Гломерулонефрит вызывает патологическую гломерулярную травму со значительной гибелью клеток и внеклеточным высвобождением ДНК. Данный протокол позволяет визуализировать внеклеточную ДНК в месте высвобождения при патологической травме. Преимущество этого метода заключается в том, что он измеряет внеклеточную ДНК от гибели клеток в почках.
В отличие от сыворотки или мочи, внеклеточное измерение ДНК является суррогатным маркером патологического повреждения. Значение этого метода заключается в том, что как внеклеточное окрашивание ДНК, так и анализ изображений легко передаются другим аутоиммунным заболеваниям, таким как ревматоидный артрит и волчанка. Этот метод требует базовых знаний гистологии почек.
Для точного обнаружения гломерулярной внеклеточной ДНК исследователь должен уметь правильно идентифицировать гломерули. Для внеклеточного окрашивания ДНК, сначала нагревать образцы интереса в слайд стойку в 60 градусов по Цельсию в течение 60 минут, прежде чем погрузить слайды в два 40-минутных изменений растворителя в дым капот. После второго погружения, регидратировать образцы два раза в 100% этанола и один раз в 70% этанола в течение пяти минут за лечение.
После последнего лечения, используйте щипцы, чтобы поместить слайды в кипящий раствор поиска антигена в скороварке на высоком в течение 10 минут. После разоблачения эпитопов антигена, перенесите скороварку с огня в раковину и немедленно запустите холодную водопроводную воду над крышкой. Разрешить слайды, чтобы уравножать в течение 20 минут в растворе поиска антигена перед мытьем образцов два раза в 0,01 молар PBS на орбитальном шейкере в течение пяти минут за стирку.
После второй стирки используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круги вокруг образцов почечной ткани и блокировать любое неспецифическое окрашивание 60 микролитров 10%куриной сыворотки в 5%бычьем альбумине сыворотки в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации тщательно замените блокирующий раствор 60 микролитров первичного антитела, представляющих интерес в камере влажности, на ночь при четырех градусах Цельсия. На следующее утро, мыть слайды на орбитальном шейкере в PBS в течение двух минут за стирку, прежде чем добавить 60 микролитров соответствующего фторфора конъюгированных вторичных антител к каждому слайду для 40-минутной инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть слайды в PBS, как попродемонстрировано, а затем лечение в 0,3%Sudan черный в 70% этанола, чтобы утолить любые потенциальные формалин-индуцированной аутофторесценции. Через 30 минут, мыть горки в водопроводной воде, чтобы удалить любые осадки и погрузить слайды в PBS в течение 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее образование черного осадка Судана. В конце инкубации, смонтировать слайды на конфокальные стеклянные крышки с тремя 60 микролитров капли монтажного раствора дополняется DAPI и печать coverslips с лаком для ногтей.
Разрешить слайды для лечения в течение 24 часов при комнатной температуре. Храните их при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, до визуализации с помощью конфокального лазерного сканирования микроскопии в соответствии со стандартными протоколами. Обязательно запечатать крышки лаком для ногтей, чтобы предотвратить любое движение во время визуализации и очистить крышки этанола для повышения разрешения изображения.
После изображения 20 гломерули на слайд откройте обутуемый плагин сегмента Weka в ImageJ и опустите первое изображение на панель инструментов ImageJ. Нажмите на изображения, цвет и разделенные каналы. Появится изображение, показывающее первичное окрашивание антител.
Чтобы создать объединенный файл одного изображения, нажмите цвет и объединить каналы. Всплывающее окно появится с просьбой о выделении цвета каждому каналу. Проверьте создать композитный и сохранить исходные коробки изображений и нажмите OK. Появится объединенное композитное изображение.
Используя первичное окрашивание антител в качестве руководства, нарисуйте область интереса вокруг шарового пуча. Для выполнения гауссийского размытия на одном синем изображении DAPI щелкните процесс, фильтры и гауссийское размытие. Установите размытие на один к двум.
Изображение станет немного размытым, но ядра будут выглядеть гладкими, фон будет смягчен. Далее нажмите плагины, сегментации и обуговляемой сегментации Weka, а также используйте инструмент свободной руки для отслеживания нетронутых ядер. Когда все ядра интереса были добавлены, добавить класс один ящик, использовать линейный инструмент для разграничения областей фона в классе два окна.
Нажмите создать новый класс и использовать линейный инструмент, чтобы наметить DAPI окрашенных внеядерной ДНК. Нажмите классификатор поезда и получить вероятность. Переключить мышь, чтобы получить черно-белое изображение всех компонентов с объектом выбора выделены в белом цвете.
Чтобы дублировать это изображение, нажмите на изображение и дублируйте его. Под изображением, настроить и порог. Используйте кнопку мыши, чтобы настроить порог, пока не будет наблюдаться только внеклеточная ДНК.
После порога нажмите процесс, двоичный, и сделать двоичный, и скопировать ранее созданные glomerular области интереса. Сдвиг управления прессой E для выбора редактирования, выбора и восстановления для восстановления выделения. Чтобы измерить только внеклеточные частицы ДНК в гломеруле, нажмите проанализировать частицы и OK. Будет сформирован лист результатов, показывающий количество частиц, область, средние пиксели и процент гломерули, содержащих внеклеточную ДНК.
Чтобы сохранить классификатор в качестве внеклеточного классификатора ДНК, нажмите сохранить классификатор и сохранить данные. Чтобы повторно придать модель последующим изображениям, повторите начальную обработку изображений, как это было продемонстрировано перед выбором классификатора нагрузки и сохраненного файла классификатора. Меню журнала будет всплывающее и запустить модель.
После запуска модели щелкните данные о загрузке и выберите extracellularDNA.arff. Затем нажмите создать результат. Если полученное изображение не смогло подобрать все ядра, фон или внеклеточную ДНК, нажмите переквалификационный классификатор и добавьте больше классификаторов по мере необходимости.
Здесь показаны изображения одного канала, показывающие репрезентативное окрашивание ДНК и бета актина. Слияние двух изображений позволяет области, представляющие интерес, быть обращено вокруг шаровой области для измерения внеклеточной ДНК в мыши почки glomeruli использованием обуговительных Weka сегментации, как попродемонстрировано. Эта модель может быть принята для выявления внеклеточной ДНК в образцах биопсии почек от контрольного пациента или сравнения с биопсией почек у пациента с миелопероксидазом ANCA-ассоциированным васкулитом.
Кроме того, эта программа может быть переведена на другие пятна в образцах почечной ткани, например, для окрашивания для нейтрофилов внеклеточных ловушек и осаждения внеклеточной миелопероксидазы в ANCA-ассоциированных васкулит. Важно отметить, что никаких существенных различий при анализе одними и теми же данными несколькими пользователями не наблюдается. Наиболее важным этапом анализа является предоставление достаточного количества примеров фоновой, нуклейной и внеклеточной ДНК с гломерули в качестве классификаторов для программы сегментации Weka, чтобы учиться.
Этот метод легко переаттомить. Например, дальнейший анализ различных типов клеточной смерти может быть исследован путем окрашивания для конкретных антител против маркеров апоптоза или некроза. Наша техника может быть использована с другими воспалительными процессами, такими как оценка экспрессии TLR при аутоиммунных заболеваниях почек или экстраклеточное выражение миелопероксидазы в биопсии почек человека.
