Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione genica, in quanto consente la scoperta di promotori e potenziatori di base utilizzando basse quantità di materiale di partenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una mappatura imparziale della risoluzione mono nucleotidica a livello genomico dei siti di partenza trascrizionale RNA polimerasi II utilizzando solo 10 nanogrammi di RNA totale. CAGE si sta dimostrando prezioso per scoprire i siti di inizio della trascrizione associati alla malattia che possono essere utilizzati come marcatori diagnostici.
SLIC-CAGE estende queste scoperte per scalare campioni come le biopsie tissutali. SLIC-CAGE è ideale per l'analisi approfondita e ad alta risoluzione dei tipi di cellule fragili, compresi i primi stadi di sviluppo embrionale o il tessuto embrionale di una vasta gamma di organismi modello. Poiché ci sono numerosi passaggi in questo protocollo, è fondamentale ridurre al minimo la perdita di campioni in ogni passaggio facendo attenzione a recuperare il più materiale possibile durante il trasferimento tra tubi.
Iniziare preparando il mix PCR per ogni modello. Combina buffer, dNTP, primer forward unico, plasmide modello con il gene portante sintetico e polimerasi di fusione secondo le indicazioni manoscritte. Mescolare i reagenti con la pipettazione.
Aggiungere 90 microlitri del mix PCR a 10 microlitri di ogni primer inverso e mescolare. Fare riferimento al manoscritto per le condizioni di termociclismo. Eseguire la trascrizione inversa o RT sull'RNA di interesse.
Combina un microlitro di primer di trascrizione inversa, 10 nanogrammi di RNA e 4.990 nanogrammi di mix portante in un volume totale di 10 microlitri. Mescolare pipettando su e giù. Scaldare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti e quindi posizionarla immediatamente sul ghiaccio.
Preparare il mix RT secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere 28 microlitri del mix a 10 microlitri di RNA. Mescolare il contenuto del tubo con pipettando fino a omogeneo. Eseguire RT in un termociclo.
Una volta completata la trascrizione inversa, purificare il prodotto con perline magnetiche SPRI senza DNasi e RNasi. Aggiungere le perline alla miscela RT con un rapporto di volume di 1,8 a uno e mescolare bene con la pipettazione. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, posizionare le perline su un supporto magnetico e lasciarle separare per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato al 70% alle perline. Non mescolare le perline o toglierle dal supporto magnetico e rimuovere l'etanolo immediatamente dopo l'aggiunta.
Tenere il tubo sul supporto magnetico e rimuovere tutte le tracce di etanolo spingendo fuori le goccioline rimanenti con una pipetta P10. Aggiungere immediatamente 42 microlitri di acqua e pipettare su e giù 60 volte per elutare il campione, facendo attenzione a non causare schiuma. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per cinque minuti senza il coperchio e quindi separare le perline sul supporto magnetico.
Quindi, trasferisci il supernatante su un nuovo set di tubi, facendo attenzione a recuperare tutti i supernatanti ma evitare il riporto di perline. Dopo il trattamento con RNasi I, mescolare 45 microlitri di campione con 105 microlitri di perline di streptavidina preparate e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, pipettare il campione ogni 10 minuti per mescolare.
Quindi, separare le perline sul supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline con tamponi A, B e C.A partire dal tampone A, rimorsi le perline in 150 microlitri di tampone. Separare sul supporto magnetico per due o tre minuti, quindi rimuovere il supernatante.
Preriscaldare i tamponi B e C a 37 gradi Celsius e ripetere i passaggi di lavaggio. Per rimuovere completamente tutti gli RNA non limitati, è fondamentale lavare accuratamente le perline di streptavidina e le pareti del tubo e rimuovere completamente il tampone di lavaggio prima di aggiungere quello successivo. Per rilasciare il cDNA, rimescolare le perline in 35 microlitri di tampone 1X RNasi I e incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente le perline sul ghiaccio per due minuti. Separare le perline su un supporto magnetico e trasferire il supernatante in un nuovo set di tubi. Rimescolare le perline in 30 microlitri di tampone 1X RNasi I e quindi separarsi su un supporto magnetico.
Combina il supernatante con il supernatante precedentemente raccolto per un volume totale di circa 65 microlitri. Eseguire qPCR per determinare il numero di cicli PCR per l'amplificazione della libreria di destinazione. Preparare i mix master qPCR per amplificare intere librerie di DNA dal vettore.
Impostare le condizioni di termociclismo in base alle indicazioni manoscritte e amplificare il campione preparato. Il protocollo SLIC-CAGE consente di ottenere librerie pronte per il sequenziamento da nanogrammi di materiale di RNA iniziale. La lunghezza del frammento nella libreria finale varia tra 200 e 2.000 coppie di basi.
Frammenti più brevi sono artefatti PCR e possono causare problemi di sequenziamento lungo la linea. È possibile eseguire ulteriori arrotondamenti di selezione delle dimensioni per rimuoverli. Rispetto a NanoCAGE, SLIC-CAGE mostra prestazioni significativamente migliori all'identificazione del sito di inizio trascrizione, che è evidente dalle curve caratteristiche operative del ricevitore delle due tecniche eseguite su varie quantità di RNA totale S.cerevisiae.
Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante tenere presente che la perdita di campioni può portare a librerie a bassa complessità. Per prevenirlo, è necessario utilizzare punte e tubi a pipetta a bassa legatura. Senza SLIC-CAGE, l'analisi dei promotori di vari tipi di cellule è stata finora inaccessibile.
Ciò include l'analisi degli stadi di sviluppo embrionale o del tessuto embrionale da una vasta gamma di organismi modello.
