使用超低输入载波保持架进行转录启动站点映射

这种方法可以帮助回答基因调控领域的关键问题，因为它使核心启动剂和增强剂发现使用少量的起始材料。该技术的主要优点是，它允许RNA聚合酶II转录启动位点使用10纳米的总RNA，无偏、全基因组的单核苷酸分辨率图谱。CAGE 被证明是无价的发现疾病相关的转录开始点，可以用作诊断标记。

SLIC-CAGE 将这些发现扩展到扩大样本（如组织活检）。SLIC-CAGE 非常适合对脆弱细胞类型进行深入和高分辨率的启动子分析，包括早期胚胎发育阶段或来自各种模型生物体的胚胎组织。由于此协议中有许多步骤，因此在管间传输时注意检索尽可能多的材料，从而最大限度地减少每个步骤中的样品损失至关重要。

首先准备每个模板的 PCR 组合。结合缓冲液，dNTP，独特的前底，模板质粒与合成载体基因，和融合聚合体根据手稿方向。通过移液混合试剂。

将 PCR 混合物的 90 微升添加到每个反向底头和混合的 10 微升中。有关热循环条件，请参阅手稿。对感兴趣的RNA进行逆转录或RT。

将一微升逆转录底转、10纳米RNA和4，990纳米的载体混合组合在10微升的总体积中。通过上下移液混合。将混合物加热到65摄氏度5分钟，然后立即放在冰上。

根据稿稿说明准备RT混合物，并将混合的28微升加入10微升RNA。通过移液混合管内，直到均匀。在热循环器中运行 RT。

一旦逆转录完成，用DNase和无RNase的SPRI磁珠净化产品。以 1.8 比 1 的体积比将珠子添加到 RT 混合物中，然后通过移液混合。让混合物在室温下坐五分钟。

然后，将珠子放在磁性支架上，让它们分开五分钟。丢弃上一杯，在珠子中加入200微升新鲜准备好的70%乙醇。不要混合珠子或将其从磁性支架上取下，并在添加后立即取出乙醇。

将管子放在磁性支架上，用 P10 移液器将任何剩余的液滴推出，从而去除所有乙醇痕迹。立即加入42微升水，并上下移液器60次，以利特样品，注意不要引起发泡。在37摄氏度下孵育管，不带盖子5分钟，然后分离磁性支架上的珠子。

然后，将上流水液转移到一组新的管子中，注意取回所有上流液，但避免珠子结转。RNase I治疗后，将45微升样品与105微升的制备的链球菌珠混合，在37摄氏度下孵育30分钟。在孵育过程中，每10分钟移液一次样品混合。

然后，将磁支架上的磁珠分离并取出上经剂。用缓冲器 A、B 和 C 清洗珠子，从缓冲器 A 开始，将珠子重新在 150 微升缓冲器中重新填充。在磁性支架上分离两到三分钟，然后取出上经剂。

将缓冲液 B 和 C 预热至 37 摄氏度，然后重复洗涤步骤。要去除所有非封盖RNA，必须彻底清洗链球菌珠和管壁，并在添加下一个之前完全去除洗涤缓冲液。要释放cDNA，将珠子重新在35微升1X RNase I缓冲和孵育，在95摄氏度下孵育5分钟。

孵育后，立即将珠子放在冰上两分钟。将磁支架上的珠子分离，然后将上经器转移到一组新的管子上。将珠子重新悬浮在 30 微升 1X RNase I 缓冲器中，然后在磁性支架上分离。

将上一液与以前收集的上一级机结合，总体积约为 65 微升。执行 qPCR 以确定目标库放大的 PCR 周期数。准备 qPCR 主混合，以放大来自载体的整个 DNA 库。

根据手稿方向设置热循环条件，并放大制备的样品。SLIC-CAGE 协议使得从起始RNA材料的纳米图获得测序就绪库成为可能。最终库中的片段长度介于 200 到 2，000 个基对之间。

较短的片段是 PCR 伪影，并可能导致排序问题。可以执行其他大小选择轮以将其删除。与 NanoCAGE 相比，SLIC-CAGE 在转录启动位识别方面表现出显著更好的性能，这从两种技术对不同数量的 S.cerevisiae 总RNA进行的接收器操作特性曲线中可见一些。

在执行此协议时，必须记住，示例丢失可能会导致低复杂性库。为了防止这种情况，必须使用低结合移液器尖端和管子。如果没有SLIC-CAGE，到目前为止，各种细胞类型的启动子分析一直无法访问。

这包括分析胚胎发育阶段或胚胎组织从广泛的模型生物体。