Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции генов, так как он позволяет основной промоутер и усилитель открытие с использованием низкого количества исходного материала. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет объективно, генома всей одного нуклеотидного разрешения отображение РНК полимеразы II транскрипционных стартовых сайтов, используя только 10 нанограммов общей РНК. CAGE оказывается бесценным для раскрытия связанных с болезнью сайтов начала транскрипции, которые могут быть использованы в качестве диагностических маркеров.
SLIC-CAGE расширяет эти открытия для масштабирования образцов, таких как биопсия тканей. SLIC-CAGE идеально подходит для углубленного и высокого разрешения промоутерского анализа хрупких типов клеток, включая ранние эмбриональные стадии развития или эмбриональные ткани из широкого спектра модельных организмов. Поскольку в этом протоколе есть множество шагов, крайне важно свести к минимуму потерю выборки на каждом шагу, заботясь о том, чтобы получить как можно больше материала при передаче между трубами.
Начните с подготовки смеси PCR для каждого шаблона. Объедините буфер, dNTPs, уникальный форвард грунтовки, шаблон плазмид с синтетическим геном перевозчика, и синтез полимеразы в соответствии с рукописными направлениями. Смешайте реагенты с помощью труб.
Добавьте 90 микролитров смеси ПЦР в 10 микролитров каждой реверсной грунтовки и перемешайте. Обратитесь к рукописи для термоциклических условий. Выполните обратную транскрипцию или RT на РНК интереса.
Объедините один микролитр грунтовки обратной транскрипции, 10 нанограммОВ РНК и 4 990 нанограммов несущей смеси общим объемом 10 микролитров. Смешайте по трубе вверх и вниз. Нагрейте смесь до 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем сразу же поместите его на лед.
Подготовьте смесь RT в соответствии с рукописными указаниями и добавьте 28 микролитров смеси в 10 микролитров РНК. Смешайте содержимое трубки путем пипетки до однородной. Запустите RT в термоциклере.
После завершения обратной транскрипции очистите продукт магнитными бусинками DNase и RNase SPRI. Добавить бисер в смесь RT при соотношении громкости 1,8 к одному и хорошо перемешать с помощью пипетки. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем поместите шарики на магнитную подтяготу и дайте им отделиться в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте в бисер 200 микролитров свежеприготовленного 70%этанола. Не смешивайте бисер или снимите их с магнитного стенда и удалите этанол сразу после добавления.
Держите трубку на магнитной подготе и удалите все следы этанола, выталкивая оставшиеся капли с помощью пипетки P10. Немедленно добавьте 42 микролитров воды, и пипетки вверх и вниз 60 раз, чтобы elute образца, заботясь, чтобы не вызвать вспенивание. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут без крышки, а затем отделить шарики на магнитной подгоде.
Затем перенесите супернатант в новый набор трубок, заботясь о том, чтобы получить все супернатанты, но избегайте переноса бисера. После лечения RNase I смешайте 45 микролитров образца со 105 микролитров подготовленных стриптавидиновых бусин и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время инкубации, пипетка образца каждые 10 минут, чтобы смешать.
Затем разделим шарики на магнитной подгоке и удалите супернатант. Вымойте бусины буферами A, B и C.Starting с буфером A, повторно помесив бисер в 150 микролитров буфера. Разделить на магнитную подстоять на две-три минуты, а затем удалить супернатант.
Разогреть буферы B и C до 37 градусов по Цельсию и повторить шаги мытья. Чтобы удалить все неохвачатые РНК, очень важно тщательно промыть стрептавидин бусы и стенки трубки и полностью удалить буфер мытья перед добавлением следующего. Чтобы освободить cDNA, повторно использовать бисер в 35 микролитров 1X RNase I буфера и инкубировать при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
После инкубации сразу же поместите бисер на лед на две минуты. Раздели шарики на магнитном стенде и перенесите супернатант на новый набор трубок. Повторное посовещение бисера в 30 микролитров буфера 1X RNase I, а затем отделить на магнитной подготе.
Объедините супернатант с ранее собранным супернатантом общим объемом около 65 микролитров. Выполните qPCR, чтобы определить количество циклов ПЦР для усиления целевой библиотеки. Подготовь мастер-миксы qPCR для усиления целых библиотек ДНК от носителя.
Установите условия термоцикла в соответствии с рукописными указаниями и усилите подготовленный образец. Протокол SLIC-CAGE позволяет получать библиотеки, готовые к секвенированию, из нанограммов исходного РНК-материала. Длина фрагмента в окончательной библиотеке колеблется от 200 до 2000 базовых пар.
Более короткие фрагменты являются артефактами ПЦР и могут вызвать проблемы с секвенированием вниз по линии. Дополнительные раунды выбора размера могут быть выполнены, чтобы удалить их. По сравнению с NanoCAGE, SLIC-CAGE демонстрирует значительно лучшую производительность при идентификации места начала транскрипции, что видно из приемника операционных характерных кривых двух методов, выполненных в различных количествах общей РНК S.cerevisiae.
При выполнении этого протокола важно иметь в виду, что потеря выборки может привести к низкой сложности библиотек. Чтобы предотвратить это, необходимо использовать низкооплетающие пипетки и трубки. Без SLIC-CAGE промоутерный анализ различных типов клеток до сих пор был недоступен.
Это включает анализ эмбриональных стадий развития или эмбриональной ткани из широкого спектра модельных организмов.
