La difficoltà con una sostituzione di un singolo residuo consiste nel genotipizzare gli animali in modo efficiente nonostante la differenza di singolo residuo. L'uso speciale di un enzima di restrizione aggiunge solo un singolo passaggio rapido e a basso costo alla tipica genotipizzazione basata sulla PCR. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi altro modello murino con un punto di mutazione se la sequenza target è riconosciuta da un enzima di restrizione, che di solito è il caso.
Tagliare da uno a tre millimetri della punta della coda con forbici pulite e trasferirlo in un tubo PCR a otto strisce da 0,2 millilitri. Dopo aver contenuto il campione di coda come descritto nel manoscritto, conservarlo a T-meno 20 gradi Celsius fino all'estrazione, fino a circa una settimana. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi tissutale per tubo e mescolare bene, seguito da spin-down utilizzando una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.
Assicurarsi che i campioni di coda siano immersi nella soluzione. Impostare i tubi su un set di termociclatori programmando i parametri per la lisi tissutale, l'inattivazione e la tenuta. Conservare il lisato tissutale a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana se la PCR non può essere eseguita immediatamente.
Preparare una soluzione PCR contenente cinque microlitri di acqua priva di nucleasi, 0,75 microlitri di primer 10 micromolari avanti e indietro e 7,5 microlitri di miscela master PCR per campione in un nuovo tubo PCR. Aggiungere un microlitro del lisato tissutale precedentemente preparato alla soluzione PCR. Mescolare bene la soluzione PCR e girare verso il basso con una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.
Impostare i tubi su un termociclatore programmato. Una volta completata la reazione, conservare i prodotti PCR a quattro gradi Celsius per uno o due mesi o circa un anno a meno 20 gradi Celsius. Preparare la soluzione enzimatica contenente sette microlitri di acqua priva di nucleasi, due microlitri di tampone CutSmart con forza 10X e un microlitro di enzima di restrizione NlaIII.
Se ci sono più campioni, moltiplicare ogni contenuto per ottenere la miscela e aliquota 10 microlitri per tubo. Aggiungere 10 microlitri di prodotto PCR precedentemente ottenuti alla soluzione enzimatica per tubo. Mescolare bene e girare verso il basso con la minicentrifuga da tavolo come dimostrato in precedenza.
Impostare i tubi su un termociclatore programmato o su un blocco termico. Conservare il prodotto dopo l'incubazione in condizioni di freddo. Aggiungere 0,75 grammi di agarosio in 50 millilitri di tampone TAE monoreduttore.
Mescolare e riscaldare l'agarosio nel microonde fino a quando non si dissolve completamente. Dopo averlo raffreddato, aggiungere cinque microlitri di macchia di DNA e mescolare delicatamente. Versare 25 millilitri di gel di agarosio nello stampo gel e lasciare che il gel si solidifichi.
Caricare 10 microlitri di prodotto PCR digerito sul pozzo. Eseguire il gel con 100 volt per 35 minuti. Immagine del gel di agarosio sotto la luce ultravioletta.
L'elettroforesi dell'agarosio eseguita utilizzando il prodotto PCR digerito ha portato a diverse bande di dimensioni diverse in ciascun genotipo, con due bande in wild type, tre in eterozigote e una in omozigote, rispettivamente. L'iniezione di prova con analisi della blastocisti ha portato a un tasso di successo del 76,9% sull'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro degli oligo donatori e un tasso di successo del 25% sull'iniezione di 25 nanogrammi per microlitro degli stessi oligo donatori, rispettivamente. Infine, l'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro di oligo donatori con precipitazione di etanolo ha ottenuto animali fondatori con un tasso di successo del 50%.
La purificazione degli oligo donatori mediante precipitazione di etanolo ha ridotto la tossicità pur mantenendo un'elevata efficienza di editing del genoma. Un'attenta manipolazione e l'aggiunta di una bassa quantità di reagenti è molto importante. Assicurati che siano aggiunti correttamente e siano mescolati bene.
