Questo metodo consente l'esame della dinamica proteica in vivo all'interno del sistema nervoso centrale intatto per affrontare le domande nelle neuroscienze e nell'immunologia. I principali vantaggi di questa procedura sono un'eccellente stabilità del movimento per l'acquisizione dell'immagine, un breve tempo chirurgico, una ridotta esposizione dell'operatore all'anestesia gassosa e piastre schienali personalizzabili economiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile rimuovere l'osso senza danneggiare il tessuto del sistema nervoso strettamente sottostante durante le fasi della laminectomia della procedura.
Prima di iniziare la procedura, utilizzare il software di progettazione 3D computer aided per creare un modello alle dimensioni indicate. Quindi abbiamo un oggetto, che è l'oggetto tridimensionale, che è quello con cui possiamo iniziare. Quello che posso fare è mettere le impostazioni su questo per la versione di stampa.
Quindi, se apro Modifica questo, vai in Avanzate, apri una finestra che mi consente di guardare tutte queste impostazioni. Impostare la temperatura dell'ugello su 205 gradi Celsius, la temperatura del letto a 45 gradi Celsius e la velocità di stampa a 45 millimetri al secondo su una stampante 3D. Utilizzare un ugello caldo da 0,4 millimetri e un'altezza dello strato di 0,2 millimetri per stampare le piastre posteriori.
Quindi valutare visivamente le lastre posteriori stampate per la loro integrità strutturale. I guasti strutturali lordi indicano difetti di stampa. Quando le piastre posteriori sono pronte, posizionare la testa di un topo anestetizzato di otto-12 settimane su un tappetino termico tra le barre dell'orecchio di un limitatore chirurgico e applicare un unguento agli occhi dell'animale.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, utilizzare una lama numero 11 per fare un'incisione rostrale-caudale di 1,5 centimetri sulla regione lombare superiore toracica inferiore e separare la pelle dal peritoneo. Utilizzare le forcep per sbucciare il tessuto connettivo trasparente rimanente sotto la pelle per esporre la muscolatura superficiale. Spostare i muscoli con una lancia chirurgica in schiuma insieme al muscolo più profondo rimanente della vertebra bersaglio.
Per creare una seduta per la piastra posteriore, cancellare il muscolo dall'aspetto posteriore del toracico 11 e dall'aspetto anteriore del toracico 13. Uso di forcep per rimuovere il muscolo rimanente dai tendini, se necessario. Quando tutto il muscolo è stato rimosso, tagliare accuratamente i tendini con le forcep fino a ottenere spazio sufficiente per visualizzare e manipolare il midollo spinale.
Confermare che il dura mater dello spazio intervertebrale, l'osso laminare semitrasparente, il vaso sanguigno superficiale centrale sotto l'osso e l'arteria irradiante anteriore sono chiaramente visibili. Bagnare la regione con liquido spinale cerebrale artificiale caldo e utilizzare un microforo per assottigliare l'osso laminare usando tratti dritti paralleli al lungo asse del midollo spinale. Afferrando delicatamente il processo spinoso superficiale con le forcep, sollevare la vertebra.
L'osso dovrebbe sollevarsi facilmente. Utilizzare le forcep numero quattro per cancellare eventuali frammenti ossei, controllando qualsiasi sanguinamento con una lancia chirurgica e una leggera pressione costante, se necessario. Quindi sciacquare il tessuto con liquido spinale cerebrale artificiale caldo.
Per l'impianto del vetro di copertura, applicare delicatamente un vetro di copertura borosilicato di tre millimetri sul cavo esposto. Utilizzare una piccola spatola per applicare 39 gradi Celsius riscaldati del 2% di agarosio sul bordo del vetro e consentire all'azione capillare di disegnare l'agarosio sotto la superficie del vetro di copertura. Applicare l'adesivo tissutale sui processi articolari ossei esposti della vertebra adiacente intatta al livello toracico 11 e 13 spine vertebrali.
Applicare ulteriore adesivo tissutale in un anello attorno al sito di laminectomia sul tendine adiacente e sul processo trasversale. Successivamente, utilizzare una nuova spatola per applicare cemento dentale mescolato con accelerante sullo strato adesivo tissutale e posizionare una piastra posteriore sul campo chirurgico centrato sulla finestra di vetro di copertura. L'applicazione di più strati sottili di cemento dentale si traduce in un'adesione più forte della piastra posteriore, ma assicurati di posizionare rapidamente la piastra posteriore prima che il cemento dentale inizi ad asciugarsi.
Dopo aver permesso al cemento dentale di polimerizzarsi per 10 minuti, riempire la base interna e la parte inferiore del retro con adesivo aggiuntivo. L'applicazione del cemento dentale in strati sottili può aiutare a ridurre il rischio di diffusione del cemento sul vetro di copertura e sull'agarosio, il che può compromettere l'intero protocollo. Quando il cemento dentale si è asciugato, applicare un supporto per piastra posteriore biforcato nella posizione appropriata sopra la finestra e avvitare la piastra posteriore nel supporto della piastra posteriore.
Quindi applicare la salina sulla piastra posteriore per verificare la presenza di perdite. L'animale e la piattaforma chirurgica possono quindi essere trasferiti sul tavolo ottico di un microscopio a due fotoni per l'imaging attraverso la finestra di vetro di copertura. In questo esperimento rappresentativo, la claudin-5 positiva EGFP è stata visualizzata all'interno delle giunzioni strette etichettate fluorescentmente in un plesso vascolare.
La chiara delineazione delle strutture di giunzione strette nella proiezione Z indica che lo spostamento minimo dell'immagine XY viene prodotto dopo una laminectomia di successo, il posizionamento della finestra e l'impianto della piastra posteriore. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che questa microchirurgia è difficile e potrebbe richiedere del tempo per essere padroneggiata. Tuttavia, una volta padroneggiato, questo intervento chirurgico può essere eseguito in circa 30 minuti.
Seguendo questa procedura, altri metodi, come la microscopia a due fotoni e l'imaging in vivo, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sul rimodellamento neurovascolare e altri processi di malattia che coinvolgono il midollo spinale.
