Este método permite el examen de la dinámica de proteínas in vivo dentro del sistema nervioso central intacto para abordar preguntas en neurociencia e inmunología. Las principales ventajas de este procedimiento son una excelente estabilidad de movimiento para la adquisición de imágenes, un breve tiempo quirúrgico, una exposición reducida del operador a la anestesia gaseosa y placas traseras personalizables de bajo costo. La demostración visual de este método es crítica, ya que es difícil extraer el hueso sin dañar el tejido del sistema nervioso estrechamente subyacente durante las etapas de laminectomía del procedimiento.
Antes de comenzar el procedimiento, utilice el software de diseño asistido por ordenador 3D para crear un modelo según las dimensiones indicadas. Así que tenemos un objeto, que es el objeto tridimensional, que es con lo que podemos empezar. Lo que puedo hacer entonces es poner ajustes en eso para la versión de impresión.
Así que si abro Editar esto, vaya a Avanzado, abra una ventana que me permita ver todos estos ajustes. Ajuste la temperatura de la boquilla a 205 grados Celsius, la temperatura de la cama a 45 grados Celsius y la velocidad de impresión a 45 milímetros por segundo en una impresora 3D. Utilice una boquilla caliente de 0,4 milímetros y una capa de 0,2 milímetros de altura para imprimir las placas posteriores.
A continuación, evalúe visualmente las placas posteriores impresas para comprobar su integridad estructural. Las fallas estructurales brutas indican defectos de impresión. Cuando las placas traseras estén listas, coloque la cabeza de un ratón anestesiado de ocho a 12 semanas de edad sobre una almohadilla de calor entre las barras de los oídos de un retén quirúrgico y aplique un ung ón en los ojos del animal.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, utilice una cuchilla número 11 para hacer una incisión de línea media rostral a caudal de 1,5 centímetros sobre la región lumbar superior torácica inferior y separe la piel del peritoneo. Use fórceps para pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel para exponer la musculatura superficial. Desplazar los músculos con una lanza quirúrgica de espuma junto con el músculo más profundo restante de la vértebra objetivo.
Para crear un asiento para la placa posterior, borre el músculo del aspecto posterior del torácico 11 y el aspecto anterior del torácico 13. Usar fórceps para eliminar el músculo restante de los tendones según sea necesario. Cuando se haya eliminado todo el músculo, corte cuidadosamente los tendones con fórceps hasta que se logre suficiente espacio para visualizar y manipular la médula espinal.
Confirme que la duramadre del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son claramente visibles. Humedezca la región con líquido cefalorraquídeo artificial cálido y utilice un micro-perforador para adelgazar el hueso laminar usando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal. Agarrando suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps, levante la vértebra.
El hueso debe levantarse fácilmente. Utilice fórceps número cuatro para eliminar cualquier fragmento óseo, controlando cualquier sangrado con una lanza quirúrgica y una presión constante suave según sea necesario. A continuación, enjuague el tejido con líquido cefalorraquídeo artificial caliente.
Para la implantación de vidrio de cubierta, aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de tres milímetros al cordón expuesto. Utilice una pequeña espátula para aplicar 39 grados Celsius calentado 2%agarose al borde del vidrio y permitir la acción capilar para dibujar la agarosa debajo de la superficie de vidrio de la cubierta. Aplique adhesivo tisular en los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta en las espinas vertebrales de nivel torácico 11 y 13.
Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de laminectomía sobre el tendón adyacente y el proceso transversal. A continuación, utilice una nueva espátula para aplicar cemento dental mezclado con acelerador en la capa adhesiva de tejido y coloque una placa posterior en el campo quirúrgico centrado sobre la ventana de vidrio de la cubierta. La aplicación de múltiples capas delgadas de cemento dental da como resultado una adhesión más fuerte de la placa posterior, pero asegúrese de colocar la placa posterior rápidamente antes de que el cemento dental comience a secarse.
Después de permitir que el cemento dental se cure durante 10 minutos, rellene la base interior y la parte inferior del lugar posterior con adhesivo adicional. La aplicación del cemento dental en capas delgadas puede ayudar a reducir el riesgo de que el cemento se propague al vidrio de la cubierta y a la agarosa, lo que puede comprometer todo el protocolo. Cuando el cemento dental se haya secado, aplique un soporte de placa posterior bifurcado a la posición adecuada sobre la ventana y atornille la placa posterior en el soporte de la placa posterior.
A continuación, aplique solución salina en la placa posterior para comprobar si hay fugas. El animal y la plataforma quirúrgica se pueden transferir a la mesa óptica de un microscopio de dos fotones para obtener imágenes a través de la ventana de cristal de la cubierta. En este experimento representativo, la claudina-5 positiva EGFP se visualizó dentro de las uniones estrechas con etiqueta fluorescente a lo largo de un plexo vascular.
La delineación clara de las estructuras de unión estrecha en la proyección Z indica que se produce un desplazamiento mínimo de la imagen XY después de una laminectomía exitosa, la colocación de la ventana y la implantación de la placa posterior. Al intentar este procedimiento es importante recordar que esta microcirugía es difícil y puede tomar tiempo para dominar. Sin embargo, una vez dominada, esta cirugía se puede realizar en aproximadamente 30 minutos.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de dos fotones y las imágenes in vivo, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación neurovascular y otros procesos de la enfermedad que involucran la médula espinal.
