Name: monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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Ringraziamo i membri dei laboratori Kopito, Luo e Pearce per molte discussioni utili durante lo sviluppo di questi metodi. Ringraziamo anche Brian Temsamrit per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università delle scienze e le fondazioni di beneficenza W.W. Smith.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come i numeri dei pazienti affetti da malattie neurodegenerative continua ad aumentare, c'è un urgente bisogno di aumentare la comprensione della patogenesi molecolare di queste malattie, in modo che possono essere sviluppate terapie migliori. Qui, descriviamo i metodi che consentono il monitoraggio del prion-come trasmissione degli aggregati della proteina patogena tra diversi tipi di cellule nell'organismo modello, Drosophila melanogaster. Recentemente abbiamo utilizzato questa metodologia per dimostrare da prioni-come trasmissione del mutante Htt aggregati in vivo e per identificare un fagocitico recettore che media la diffusione di questi aggregati dai neuroni a glia27. Il nostro approccio sfrutta diversi vantaggi dell'utilizzo di Drosophila per studiare la malattia genetica umana: il ciclo di vita breve e vasto set di strumenti genetici, che possono accelerare la scoperta di informazioni biologiche di base che sono terapeuticamente rilevanti.
I metodi che descriviamo qui offrono due grandi vantaggi rispetto altri animale esistente e modelli di cultura per la trasmissione di prioni-come cellulare: (1) l'agente causativo aggregante (ad es., mutante Htt) è prodotto in una cella che risiedono in un tessuto intatto e (2) espressione della versione piegata normalmente della stessa proteina (ad es., selvaggio-tipo Htt) in una popolazione di cella separata fornisce prontamente accessibile "reporter" per gli eventi del prion-come. Abbiamo raggiunto espressione del mutante e del selvaggio-tipo Htt proteine in popolazioni di cellule non sovrapposte all'interno dell'organismo stesso utilizzando sofisticati strumenti genetici che si sono affermati in Drosophila40. Poiché molti driver diversi tessuto-specifici Gal4 e QF sono prontamente disponibili, esame del prion-come trasferimento tra essenzialmente qualsiasi tipi distinti delle cellule nel corpo volo è fattibile.
Un componente critico dell'approccio sta ottenendo segregata espressione del mutante e del selvaggio-tipo Htt proteine in popolazioni differenti delle cellule all'interno dello stesso animale. Qualsiasi sovrapposizione di espressione deve essere eliminato in modo che l'aggregazione di Htt wild type in cellule recettive citoplasmico penetrazione del prione-come aggregati originari del donatore cellule9,12,27, segnala in modo preciso 41. Questo è possibile con l'introduzione di ulteriori strumenti genetici (ad es., Gal80 e QS repressori40) per alleviare questo problema. Una volta che il genotipo ideale è progettato e selezionato, è necessario stabilire un metodo sistematico per quantificare puncta. Questo dipenderà in larga misura il numero di cellule che sono etichettati, il numero di aggregazioni che appaiono e il rapporto segnale-rumore del campione. Criteri quali co-localizzazione e/o FRET positivi possono essere utilizzati per analizzare i dati, come abbiamo descritto qui in Figura 4. Tuttavia, limitare la selezione di selvaggio-tipo Htt aggregati sulla base di queste caratteristiche possono portare a sottovalutazione degli eventi del prion-come trasferimento, poiché alcuni semi di aggregazione Htt mutante potrebbero scendere di sotto il limite di rilevamento del microscopio confocale.
L'approccio in vivo qui descritto non è esclusivo per prioni-come comportamento di aggregati associato HD o anche altri disturbi polyQ. Transgenici mosche possono essere sviluppati per esaminare da prioni-come diffusione dell'alfa-synuclein nel PD, tau in annuncio e SOD1 o TDP-43 in ALS utilizzando lo stesso paradigma sperimentale. Per ciascuna di queste proteine, un mutante di aggregazione-incline dovrebbe essere espressi in cellule del donatore e una versione solubile della proteina stessa che aggregati soli quando nucleate dovrebbero essere espresso in cellule recettive. Questo paradigma sperimentale può anche essere utile per investigare l'idea emergente che patogeni proteine associate con differenti malattie potrebbero interagire tramite un meccanismo di cross-semina47. Infine, gli strumenti genetici una miriade disponibili in Drosophila possono essere applicati per studiare e identificare i meccanismi molecolari alla base di citoplasma al citoplasma diffusione di aggregati proteici patogeni associati a queste malattie mortali.

L'ipotesi del prion afferma che l'agente infettivo responsabile per le encefalopatie spongiformi trasmissibili (ad es., malattia di Creutzfeldt – Jakob in esseri umani, scrapie nelle pecore, malattia del deperimento cronico in cervi e alci e "malattia della mucca pazza" nei bovini ) è esclusivamente composto di proteine e privo di acidi nucleici1. In malattie da prioni, la proteina prionica cellulare (PrPC) assume una piega non nativi, stabile (PrPSc) che è altamente beta foglio-ricco e auto-propagarsi convertendo e reclutamento monomerico PrPC molecole in amiloide stabile funzioni di aggregazione. PrPSc aggregati utilizzano questo meccanismo di auto-replica per diffondere tra diverse cellule dell'organismo e anche tra gli organismi individuali2.
Misfolding e aggregazione è anche una caratteristica centrale della maggior parte delle malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e sclerosi laterale amiotrofica (ALS))3. Formazione di assemblee di proteina aggregati intra - o extra - cellulare in queste malattie è strettamente associato con citotossicità4 e progredisce lungo percorsi altamente riproducibili e malattia-specifica attraverso il cervello sopra tempo5, 6. questi modelli di diffusione suggeriscono che aggregati patogeni associati a questi disturbi del prion-come le proprietà. Forte sostegno ora esiste per la trasmissione di prioni-come degli aggregati associati con l'annuncio, PD, HD e ALS - si sono sparsi dalla cellula--cellula e modello il cambiamento conformazionale di monomeriche forme della stessa proteina in cellule precedentemente inalterato7, 8.
La maggior parte degli studi che studiano da prioni-come diffusione di aggregati proteici fino ad oggi è stata effettuata utilizzando modelli di coltura di cellule di mammifero, dove gli aggregati trasferire nel citoplasma delle cellule naive dallo spazio extracellulare o da un'altra cella citoplasma9,10,11,12,13,14,15, o iniettando materiale contenente aggregato nel cervello di topo e monitoraggio aggregare aspetto fuori le iniezione sito16,17,18,19,20,21,22, 23. più recentemente, gli animali transgenici sono stati utilizzati per dimostrare che gli aggregati intracellulari diffondersi ad altre cellule all'interno di cervelli intatti24,25,26,27, 28,29,30. Qui, descriviamo un metodo per la visualizzazione diretta di trasferimento aggregati tra le singole celle nel cervello intatto di Drosophila melanogaster. Quasi due decenni fa in primo luogo sono stati sviluppati in Drosophila modelli di HD/poliglutammina (polyQ) malattie31,32 e hanno intestimabile molti meccanismi patogenetici che sono alla base di questi disordini 33. HD è un disordine neurodegenerative ereditato causato da una mutazione autosomica dominante del gene che codifica per la proteina huntingtina (Htt)34. Questa mutazione provoca dilatazione di un tratto poliQ nei pressi N-terminale di Htt di là di una soglia di patogena di ~ 37 Glutamine, causando la proteina di misfold e aggregazione35,36. Selvaggio-tipo Htt proteine contenenti < 37 Glutamine in questo tratto raggiungere loro ovile nativo, ma possono essere indotte a aggregato al diretto contatto fisico con un Htt aggregazione "seme"12,27,37. Sfruttiamo questo homotypic, aggregazione nucleato di selvaggio-tipo Htt come una lettura per il trasferimento del prion-like e citoplasmico voce di mutante Htt aggregati originari di altre cellule.
Determinare i meccanismi da cui aggregati del prion-come viaggio tra le celle può portare all'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative incurabili. Prendiamo vantaggio del ciclo di vita rapido, facilità d'uso e trattabilità genetica della Drosophila melanogaster definire meccanismi molecolari per cellula--cellula diffusione del mutante Htt aggregati. La nostra strategia sperimentale utilizza due sistemi di espressione binaria disponibile in Drosophila, la consolidata Gal4 specifici a Monte d'attivazione sequenza (Gal4-UAS) sistema38 e il recentemente sviluppato QF-QUAS sistema39. Questi due sistemi indipendenti di aggancio permette di limitare l'espressione dei transgeni Htt mutanti e wild-type a popolazioni distinte delle cellule all'interno della stessa volare40. Utilizzando questo approccio, esaminiamo da prioni-come diffusione del mutante Htt monitorando la ridistribuzione di citoplasmico Htt di selvaggio-tipo dallo stato normalmente diffusa, solubile a uno stato aggregato, una diretta conseguenza del contatto fisico con un mutante pre-formato Htt aggregazione "seme". Conversione di selvaggio-tipo Htt dal mutante Htt possa essere confermati mediante biochimici o trasferire tecniche biofisiche che segnalano interazioni proteina-proteina, quali l'energia di risonanza di fluorescenza (FRET)9,27,41 .
Soprattutto, possiamo anche accedere un gran numero di strumenti genetici in Drosophila per identificare geni e/o le vie che mediano del prion-come diffusione di aggregati proteici. Recentemente abbiamo utilizzato questo approccio per svelare un ruolo chiave per il recettore delle cellule superficiali dell'organismo saprofago,42,Draper43, nel trasferimento mutante Htt aggregati da un neurone assoni a vicina glia fagocitica in Drosophila centrale sistema nervoso (SNC)27. Così, l'approccio e la formazione immagine-base genetica che descriviamo qui può rivelare importanti informazioni di base biologiche su un fenomeno malattia rilevanti in simple-to-use ma organismo modello potente, Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Dilute to 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquot and freeze upon receipt</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Use at 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td></tr><tr><td>FITC anti-chicken</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>use in non-dominant hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>use in dominant hand</td></tr><tr><td>LAS X image analysis software</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris image analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

L'aggregazione della proteina è una caratteristica centrale della maggior parte delle malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Aggregati proteici sono strettamente associati con neuropatologia in queste malattie, anche se non è noto l'esatto meccanismo attraverso il quale l'aggregazione di proteine aberranti sconvolge la normale omeostasi cellulare. Emergendo dati forniscono l'appoggio importante per l'ipotesi che aggregati patogeni in AD, PD, HD e ALS hanno molte somiglianze ai prioni, che sono agenti infettivi sola proteina responsabili per le encefalopatie spongiformi trasmissibili. I prioni auto-replicano di templating la conversione delle versioni piegato in modo nativo della stessa proteina, causando la diffusione del fenotipo aggregazione. Come i prioni e proteine prioniche-like in annuncio, PD, HD e ALS mossa da una cellula a altra è attualmente un'area di intensa ricerca. Qui, è descritto un modello di Drosophila melanogaster che permette il monitoraggio della trasmissione del prion-like, cellula--cellula di aggregati di huntingtina (Htt) connesso con HD. Questo modello si avvale di strumenti potenti per manipolare l'espressione del transgene in molti tessuti differenti di Drosophila e utilizza una proteina citoplasmatica fluorescente contrassegnati al direttamente del prion-come trasferimento del rapporto di mutante Htt aggregati. D'importanza, l'approccio che descriviamo qui può essere utilizzato per identificare nuovi geni e vie che mediano la diffusione degli aggregati della proteina tra cellulari diversi tipi in vivo. Informazioni acquisite da questi studi si espanderà la limitata comprensione dei meccanismi patogenetici che sono alla base di malattie neurodegenerative e rivelare nuove opportunità per intervento terapeutico.

I metodi descritti qui produrranno dati affidabile dimostrando del prion-come trasferimento di aggregati proteici Htt dalla popolazione di una cella a altra nel fly intatto CNS. Conversione di selvaggio-tipo Htt da diffusa a punctate è osservata da fluorescenza diretta di questa proteina di fusione di YFP nel destinatario glia come risultato HttQ91-mCherry espressione nel donatore ORNs (Figura 2A-C e Figura 4A, B). Accurati report degli eventi di trasferimento del prion-come tra queste due popolazioni di cellule richiede un'attenta selezione di mosche transgeniche e driver Gal4/QF di produrre livelli di forte espressione di transgeni di Htt mutanti e wild-type senza alcuna sovrapposizione durante sviluppo o in età adulta. Inoltre, disegno premuroso di transgeni fusione proteina fluorescente-Htt possibile attivare potenti analisi a valle. Ad esempio, mutanti e wild type Htt aggregati possono essere quantificati come oggetti punctati sia manualmente (Figura 2C e Figura 4A) o utilizzando software di analisi di immagine (Figura 3A, B), può essere misurata e caratterizzato ulteriormente come aggregazione popolazioni (Figura 3C), possono essere valutati per la co-localizzazione tra mutante e proteine di selvaggio-tipo (Figura 4A) e può essere analizzato per FRET27 (Figura 4 B). Queste analisi richiedono fusione di mutanti e wild-type Htt ai tag di proteina fluorescente con proprietà di fluorescenza sufficientemente separati, ma con abbastanza sovrapposizione spettrale per abilitare FRET tra coppie di donatore e accettore (ad es., CFP/YFP9 o YFP/mCherry27).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> Figura 2 . Immagini confocal del prione-come conversione di glial HttQ25-YFP da un neurone HttQ91-mCherry aggregati. (A) massima proiezione intensità di ~ 30 µm di confocal fette mostrando un lobo antenne da una Mosca maschio esprimendo HttQ91-mCherry (rosso) in assoni DA1 ORN utilizzando Or67d-QF e HttQ25-YFP (verde) in cellule gliali utilizzando repo-Gal4. I confini approssimativi del lobo antenne e DA1 glomerulo, cui assoni DA1 ORN terminano, sono indicati dalle linee punteggiate e solide, rispettivamente. (B) massima proiezione intensità da ~ 20 µm di confocal fette mostrando una vista ingrandita della regione glomerulare DA1 da a. (C) A singola 0.35 µm confocale fetta mostrando una singola puncta HttQ25-YFP e relativo associato (segnale HttQ91-mCherry indicato dalla freccia in ogni canale). Il segnale nel canale rosso è stato migliorato per visualizzare co-localizzazione tra HttQ25-YFP e segnali di HttQ91-mCherry. Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo di olio 40 X 1.4NA. Barre di scala = 10 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> Figura 3 . Analisi tridimensionale di HttQ91-mCherry aggregati in assoni DA1 ORN. (A) un 3D rappresentazione degli aggregati di HttQ91-mCherry espresso nel glomerulo DA1 via Or67d-QF utilizzando gli stessi dati mostrati nella Figura 2B. (B) una schermata che Mostra singoli oggetti o "macchie" identificati dai dati grezzi in (A) utilizzando un pacchetto di software di analisi di immagine. Il software identificato 56 oggetti di varie dimensioni in questa canale/immagine. Il punto indicato dalla freccia (B) è stato misurato per hanno un diametro di ~ 1,2 µm. frecce scegliere posizioni dove due oggetti inesatto vengono uniti in uno spot per il software, probabilmente a causa della vicinanza dei puncta individuo. Per ovviare a questo, le impostazioni di soglia diversi devono essere testate nel software e/o macchie Unite devono essere separati manualmente se possibile. Barre di scala = 10 µm. (C) istogramma mostra la distribuzione dei diametri misurati dal software per la HttQ91-mCherry "macchie" illustrate in (B). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> Figura 4 . Co-localizzazione e analisi FRET di indotto aggregati HttQ25-YFP. (A) A montaggio di 4 singoli 0,35 µm confocale z-fette da un cervello maschile volo esprimere HttQ91-mCherry in ORNs DA1 utilizzando Or67d-QF e HttQ25-YFP in glia utilizzando repo-Gal4. I segnali sono stati adeguati affinché anche piccoli aggregati di HttQ91-mCherry sono visibili e indotto HttQ25-YFP aggregati si distinguono dalle circostanti diffusa del segnale. Le fette mostrate sono separate da ~ 1,0 µm (numero di slice indicato all'angolo inferiore destro delle immagini unite) affinché più complessi possono essere osservati. Le frecce indicano puncta HttQ25-YFP che sono stati determinati per essere a o vicino a fuoco in quella particolare z-fetta spostando manualmente tramite lo stack di z. Dei sette HttQ25-YFP puncta indicato qui, sei hanno rilevabile associato HttQ91-mCherry segnale (cioè, 86% degli aggregati HttQ25-YFP co-localizza con HttQ91-mCherry). Si noti che il segnale di mCherry associato HttQ25-YFP puncta è spesso più debole rispetto alla maggior parte dei puncta mCherry-positivi nel glomerulo DA1. Barra della scala = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-localizzato punctum prima (pannelli a sinistra) e dopo (destra pannelli) mCherry (accettore) photobleaching. L'aumento della fluorescenza YFP (donatore) fu usato per produrre un'immagine di efficienza (FRETFEP) di FRET pixel-per-pixel utilizzando il AccPbFRET plug-in per ImageJ46. Questo particolare aggregato ha un complessivo FRETeff del 61%. Barra della scala = 1 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

8.0K Views.  University of the Sciences. Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Neuroscienze

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Comportamento

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Biologia

Monitoraggio degli eventi epilettiformi in Drosophila tramite imaging del calcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autore in primo piano: approfondimenti sulle tecniche e sui risultati dei recenti progressi nella ricerca sull'epilessia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l'infezione intraperitoneale

Valutare fenotipi neurodegenerative

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Indagare le proteine prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

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Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l'infezione intraperitoneale

Valutare fenotipi neurodegenerative

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

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Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

Indagare le proteine prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello