Name: monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

אנו מודים חברים של מעבדות Kopito לואו, פירס דיונים מועילים רבים במהלך פיתוח שיטות אלה. אנו מודים גם בריאן Temsamrit לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאוניברסיטת למדעים ונאמנויות צדקה של וו. סמית.

המחברים אין לחשוף.

המספרים של חולים הסובלים ממחלות ניווניות ממשיך לגדול, יש צורך דחוף להגדיל את ההבנה של פתוגנזה מולקולריים של מחלות אלו כך ניתן לפתח טיפולים טובים יותר. כאן, אנו מתארים שיטות המאפשרות לניטור פריון כמו שידור של אגרגטים חלבון פתוגניים בין סוגי תאים שונים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה. לאחרונה השתמשנו מתודולוגיה זו כדי להדגים פריון כמו שידור של מוטציה Htt אגרגטים ויוו וכדי לזהות קולטן phagocytic המעביר התפשטות אלה אגרגטים של נוירונים עד עכשיו, דונלד27. הגישה שלנו מנצלת מספר יתרונות השימוש דרוזופילה ללמוד מחלות אנושיות גנטית: כלים גנטי עצום, אשר יכולים להאיץ את גילוי המידע הביולוגי הבסיסי הרלוונטי רפואית ו מחזור חיים קצר שלו.
השיטות נתאר כאן מציעים שני יתרונות גדולים על פני חיה אחרת הקיימת וסלולרי תרבות מודלים עבור שידור כמו פריון: (1) בהעלאת הפתוגן (למשלמוטציה Htt) מופק בתא המתגוררים של רקמות ללא פגע, ו- (2) הביטוי של הגירסה מקופלת בדרך כלל של החלבון אותו (למשל, פראי-סוג Htt) של אוכלוסיה תא נפרד מספקת ניתן להגיע בקלות "כתב" לאירועים כמו פריון. השגנו את הביטוי של מוטציה וחלבונים Htt פראי-סוג אוכלוסיית תאים שאינם חופפים בתוך האורגניזם אותו באמצעות הכלים גנטי מתוחכמת ומבוססת ב דרוזופילה40. כי רבים Gal4 רקמות ספציפיות ומנהלי ליטראות שונים זמינים, בחינת פריון כמו העברה בין למעשה כל סוגי תאים נפרדים בגוף זבוב הוא ריאלי.
מרכיב קריטי של הגישה הוא בהשגת ביטוי הפרדה של מוטציה וחלבונים Htt פראי-סוג אוכלוסיית תאים שונים בתוך אותה חיה. בחפיפה הביטוי צריך להיות מחוסל כך פראי-סוג צבירת Htt בתאים הנמען ידווח באופן מדויק cytoplasmic חדירה של אגרגטים פריון דמוי שמקורם תורם תאי9,12,27, 41. זה יכול להתבצע על ידי החדרת כלים גנטיים נוספים (למשל, repressors Gal80 ו- QS40) כדי להקל על בעיה זו. ברגע גנוטיפ האידיאלי הוא תוכנן, נבחר, חייבים להקים שיטה שיטתית לכימות puncta. זה יהיה תלוי במידה רבה על מספר התאים המסומנות, המספר של אגרגטים המופיעות, יחס אות לרעש של המדגם. קריטריונים של לוקליזציה שיתוף ו/או סריג חיובי יכול לשמש לניתוח הנתונים, כפי שתיארנו כאן באיור4. עם זאת, הגבלת מבחר פראי-סוג Htt אגרגטים על סמך תכונות אלה עלול להוביל underestimation של פריון, כמו העברת אירועים, מאז זרעים צבירה Htt מוטציה עלול ליפול מתחת לגבול של זיהוי של מיקרוסקופ קונפוקלי.
אין ויוו הגישה המתוארת כאן אינה בלעדית עבור פריון כמו התנהגות של אגרגטים המשויך HD או אפילו הפרעות אחרות polyQ. ניתן לפתח זבובים הטרנסגניים לבחון פריון כמו הפצת אלפא-synuclein ב- PD, טאו לספירה, ו SOD1 או TDP-43 ב- ALS באמצעות הפרדיגמה ניסיוני אותו. עבור כל אחד החלבונים האלה, מוטציה נוטה צבירת צריך לבוא לידי ביטוי תאי התורם, גרסה מסיסים של החלבון אותו כי אגרגטים רק כאשר nucleated צריך לבוא לידי ביטוי תאים הנמען. פרדיגמה נסיונית הזה יכול להיות גם שימושי עבור חוקרים את הרעיון המתעוררים כי חלבונים פתוגניים הקשורים עם מחלות שונות אולי אינטראקציה באמצעות מנגנון זורעות הצלב47. בסופו של דבר, ניתן להחיל את הכלים גנטי הרבות הזמינות בדרוזופילה לחקור ולזהות mechanism(s) מולקולרית הבסיסי. ציטופלזמה-כדי-הציטופלסמה הפצת אגרגטים חלבון פתוגניים המשויכת אלה מחלות קטלניות.

ההשערה פריון נקבע כי הסוכן זיהומיות אחראי מדבקות spongiform encephalopathies (למשל, מחלת קרויצפלד - יעקב בבני אדם, scrapie כבשים, מחלה כרונית לבזבז צבאים, איילים, "מחלת הפרה המשוגעת" בבקר ) מורכב אך ורק של חלבון של חומצות גרעין1. מחלות פריון, החלבון פריון הסלולר (PrPC) ההנחה היא שנוצרה, יציב קיפול (PrPSc) מאוד בטא גיליון עשיר, באפשרותך להפיץ עצמית על ידי המרת וגיוס monomeric מולקולות PrPC לתוך עמילואיד יציב אגרגטים. PrPSc אגרגטים להשתמש במנגנון הזה המשכפלת להפיץ בין תאים שונים באורגניזם, אפילו בין אורגניזמים נפרדים2.
חלבון misfolding צבירת היא גם תכונה מרכזית של רוב מחלות ניווניות (מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS))3. מערך הרכבות אינטרה - או תוספת - cellular מצטברים חלבונים במחלות אלה קשורה מאוד cytotoxicity4 ומתקדמת לאורך שבילים מאוד הדירים מחלות ספציפיות דרך המוח לאורך זמן5, 6. את הדפוסים הללו של התפשטות מציע כי אגרגטים פתוגניים הקשורים עם הפרעות אלה יש תכונות כמו פריון. כעת קיימת תמיכה חזקה כמו פריון שידור של אגרגטים הקשורים לספירה, PD, HD ו- ALS - הם מתפשטים מן-לתא ותבנית השינוי הסתגלותי של צורות monomeric של החלבון זהה של תאים בעבר לא מושפע7, 8.
הרוב המכריע של מחקרים חוקרת פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון עד כה בוצעו באמצעות מודלים בתרבית של תאים תרבות, איפה אגרגטים להעביר לתוך הציטופלסמה של תאים נאיביים מן המרחב חוץ-תאית או מתא אחר הציטופלסמה,9,10,11,12,13,14,15, או על ידי הזרקת חומר המכיל צבירה לתוך מוח העכבר וניטור צבירה המראה מחוץ הזרקת באתר16,17,18,19,20,21,22, 23. לאחרונה, חיות הטרנסגניים שימשו כדי להדגים אגרגטים תאיים התפשט לתאים אחרים בתוך המוח שלם24,25,26,27, 28,29,30. כאן, אנו מתארים שיטה עבור פריט חזותי ישיר של העברת הצבירה בין תאים בודדים במוח שלם של melanogaster דרוזופילה. דרוזופילה דגמי HD/polyglutamine (polyQ) מחלות פותחו לראשונה לפני כמעט שני עשורים31,32 , סיפקו הרבה תובנות המנגנונים פתוגניים העומדים בבסיס הפרעות אלה שלא יסולא בפז 33. HD הוא הפרעה ניווניות תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה דומיננטי autosomal בגן כי הקודים חלבון huntingtin (Htt)34. מוטציה זו גורמת הרחבה של מתיחה polyQ ליד של Htt אמיני, מעבר לסף מסוים פתוגניים של ~ glutamines 37, גורם החלבון כדי misfold צבירה35,36. פראי-סוג Htt חלבונים המכילים < glutamines 37 ב מתיחה זו להשיג לקפל מקורית שלהם, אבל יכולה להיגרם כדי צבירה בעת מגע פיזי ישיר עם Htt צבירה "זרע"12,27,37. אנו מנצלים את זה homotypic, nucleated צבירה של Htt פראי-סוג כמו הבדיקה להעברה כמו פריון וכניסה cytoplasmic מוטציה האגרגטים Htt שמקורם בתאים אחרים.
קביעת מנגנוני על ידי אגרגטים פריון כמו איזה נסיעות בין תאים יכול להוביל הזיהוי של הרומן מטרות טיפוליות למחלות ניווניות חשוכות מרפא. אנחנו לוקחים את היתרון של מחזור חיי מהירה, קלות שימוש, ללקוחות שלנו גנטי של דרוזופילה melanogaster להגדרת מנגנונים מולקולריים-לתא התפשטות מוטציה אגרגטים Htt. האסטרטגיה שלנו ניסיוני מעסיקה שתי מערכות בינאריות ביטוי זמינה דרוזופילה, את ומבוססת Gal4 ספציפי נגד הזרם הפעלת רצף (Gal4-UAS) מערכת38 את פותח לאחרונה QF-QUAS מערכת39. זיווגים אלה שתי מערכות עצמאיות מאפשר הגבלת הביטוי של מוטציות ובני פראי-סוג transgenes Htt אוכלוסיות תאים נפרדים בתוך לטוס באותו ה40. באמצעות גישה זו, נבחן פריון כמו התפשטות של מוטציה Htt על-ידי ניטור הפצה מחדש של Htt פראי-סוג cytoplasmic ממצב שלה בדרך כלל ' מאטום לשקוף ', מסיסים למצב צבור, תוצאה ישירה של מגע פיזי עם מוטנט הקבועים מראש Htt צבירה "זרע". המרה של פראי-סוג Htt מאת mutant Htt יכול להיות אישרו שימוש ביוכימי או טכניקות biophysical כי הדו ח אינטראקציות חלבון-חלבון, כגון קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה להעביר (סריג)9,27,41 .
חשוב, אנחנו יכולים גם לגשת מספר רב של כלים גנטיים דרוזופילה לזיהוי גנים ו/או מסלולים המתווכות פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון. השתמשנו לאחרונה בגישה זו כדי לחשוף את תפקיד מפתח עבור הקולטן נבלות פני שטח התא, דרייפר42,43, בהעברת אגרגטים Htt מוטציה של אקסונים עצביים בקרבת מקום עכשיו, phagocytic דונלד ב דרוזופילה המרכזית מערכת העצבים (CNS)27. לפיכך, הגישה הגנטית דימות מבוססות כי אנו מתארים כאן יכול לחשוף מידע חשוב ביולוגיים בסיסיים על תופעה מחלות רלוונטיות פשוטה לשימוש אבל אורגניזם מודל רב עוצמה, דרוזופילה.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Dilute to 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquot and freeze upon receipt</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Use at 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td></tr><tr><td>FITC anti-chicken</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>use in non-dominant hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>use in dominant hand</td></tr><tr><td>LAS X image analysis software</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris image analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

צבירת חלבון הוא מאפיין מרכזי של רוב מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD) נוירודגנרטיביות (ALS). אגרגטים חלבון קשורים קשר הדוק עם neuropathology במחלות אלה, למרות המנגנון המדויק שבו צבירת חלבון aberrant משבש הומאוסטזיס סלולרית רגילה לא ידוע. מתעוררים נתונים מספקים תמיכה חזקה על ההשערה את צבירות פתוגניים לספירה, PD, HD, ALS יש קווי דמיון רבים כדי prions, שהינם חלבונים בלבד מדבקים אחראי encephalopathies spongiform מדבקות. Prions עצמית שכפל באמצעות תבניות ההמרה של מקופלת מקורי גירסאות של החלבון אותו, גורם התפשטות פנוטיפ צבירה. איך prions וחלבונים כמו פריון לספירה, מהלך PD, HD ו- ALS מתא אחד למשנהו הוא כיום שטח של חקירה אינטנסיבית. כאן, מתואר מודל דרוזופילה melanogaster המאפשר ניטור של שידור כמו פריון, מתא לתא של אגרגטים מוטציה huntingtin (Htt) המשויך HD. מודל זה מנצל כלים רבי-עוצמה מניפולציה transgene ביטוי ברקמות דרוזופילה שונות רבות, מנצל חלבון cytoplasmic מתויג fluorescently ישירות דוח העברת פריון כמו מוטציה אגרגטים Htt. חשוב מכך, הגישה שנתאר כאן יכול לשמש כדי לזהות גנים הרומן משעולים המתווכות התפשטות של אגרגטים חלבון בין סוגי תאים שונים vivo בתוך. מידע ממחקרים אלה ירחיב את ההבנה מוגבלת של המנגנונים פתוגניים אשר מושתתות מחלות ניווניות ולחשוף הזדמנויות חדשות התערבות טיפולית.

השיטות המתוארות כאן להפיק נתונים להדגים פריון, כמו העברה של אגרגטים חלבון Htt מאוכלוסיה תא אחד למשנהו בתוך הזבוב ללא פגע CNS. המרה של Htt פראי-סוג של ' מאטום לשקוף ' punctate הוא ציין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ישירה של חלבון כימרי זה YFP עכשיו, הנמען דונלד כתוצאה HttQ91-mCherry ביטוי ORNs התורם (איור 2A-C ואיור 4A, B). דיווח מדויק של אירועים כמו פריון העברה בין אוכלוסיות שני תאים אלה דורש בחירה זהירה של זבובים הטרנסגניים ומנהלי Gal4/ליטראות לייצר רמות ביטוי חזק של מוטציות ובני פראי-סוג Htt transgenes ללא כל חפיפה במהלך פיתוח או בבגרות. בנוסף, עיצוב מושקע של transgenes פיוז'ן החלבון הניאון-Htt ניתן להפעיל עוצמה ניתוחים במורד הזרם. לדוגמה, מוטציות ובני פראי-סוג Htt אגרגטים ניתן לכמת כאובייקטים punctate גם באופן ידני (איור 2C ו- איור 4) או באמצעות תמונה ניתוח תוכנה (איור 3A, B), ניתן למדוד, מאופיין נוספות כמו אוכלוסיות צבירה (איור 3C), יכול להיות מוערך בלוקאליזציה שיתוף בין מוטציה פראי-סוג חלבונים (איור 4א), יכול להיות מנותח על סריג27 (איור 4 B). ניתוחים אלה דורשים פיוז'ן של Htt מוטציות ובני פראי-סוג לתגים חלבון פלואורסצנטי עם פלורסצנטיות מופרדים מספיק מאפיינים, אבל עם מספיק חפיפה ספקטרלי כדי לאפשר סריג בין זוגות התורם ואת מקבל (למשל, CFP/YFP9 או YFP/mCherry27).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> איור 2 . תמונות קונאפוקלית של פריון דמוי המרה של גליה HttQ25-YFP מאת עצביים אגרגטים HttQ91-mCherry. (א) מקסימום הטלה בעוצמה של ~ 30 מיקרומטר הפרוסות קונאפוקלית מציג אונה antennal אחת מחבצלת זכר לבטא HttQ91-mCherry (אדום) ב אקסונים ולהתמכר DA1 באמצעות Or67d-העל, HttQ25-YFP (ירוק) עכשיו, דונלד באמצעות ריפו-Gal4. גבולות משוער של האונה antennal, פקעית DA1, היכן לסיים DA1 ולהתמכר אקסונים, מסומנים על ידי קווים מנוקדים ומוצק, בהתאמה. (B) מקסימום הטלה בעוצמה מ ~ 20 מיקרומטר הפרוסות קונאפוקלית מציג תצוגה מוגדלת של האזור glomerular DA1 מ א א (ג) יחיד 0.35 מיקרומטר קונאפוקלית פרוסה מראה של puncta HttQ25-YFP יחיד (האות המשויכת שלו HttQ91-mCherry שמציין החץ בכל אחד מהערוצים). האות ב ערוץ הצבע האדום היה משופרת להמחיש לוקליזציה שיתוף בין HttQ25-YFP אותות HttQ91-mCherry. כל התמונות נרכשו באמצעות מטרה שמן 40 X 1.4NA. גודל ברים = 10 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> איור 3 . ניתוח תלת-ממדי של אגרגטים אקסונים ולהתמכר DA1 HttQ91-mCherry. (א) תלת-ממד תיאור של אגרגטים HttQ91-mCherry לידי ביטוי פקעית DA1 ויה Or67d-ליטראות באמצעות אותו הנתונים שמוצג באיור 2B. מסך (B) A מציג אובייקטים בודדים או "כתמים" מזוהה מן הנתונים הגולמיים (A) באמצעות חבילת תוכנה של ניתוח תמונה. התוכנה מזוהה 56 אובייקטים בגדלים שונים בתמונה זו/הערוץ. המקום שמציין החץ (B) נמדדה יש קוטר של ~ 1.2 מיקרומטר. חיצים הצבע למיקומים שבו שני אובייקטים שדבריהן ימוזגו במקום אחד על ידי התוכנה, ככל הנראה בגלל קרבתה של puncta בודדים. כדי להתגבר על זה, הגדרות קביעת סף שונים צריך להיבדק בתוכנה ו/או כתמים הממוזג להפרידם באופן ידני במידת האפשר. גודל ברים = 10 מיקרומטר. היסטוגרמה (C) מציג את ההתפלגות של קטרים נמדד על ידי תוכנת HttQ91-mCherry "כתמים" שמוצג (B). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> איור 4 . לוקליזציה שיתוף וניתוח סריג של המושרה אגרגטים HttQ25-YFP. מצרף (א) א 4 0.35 מיקרומטר קונאפוקלית z-פרוסות בודדות של מוח לטוס זכר לבטא HttQ91-mCherry ב ORNs DA1 באמצעות Or67d-העל, HttQ25-YFP עכשיו, דונלד באמצעות ריפו-Gal4. האותות הותאמו כך אגרגטים HttQ91-mCherry קטן אפילו גלויים אגרגטים HttQ25-YFP המושרה לעמוד מן הסובב אות ' מאטום לשקוף '. הפרוסות שמוצג אחד מופרדים על-ידי ~ 1.0 מיקרומטר (מספר פרוסה המצוין בפינה הימנית התחתונה של התמונות הממוזגות) כך יכול להיות שנצפו אגרגטים מרובים. חיצים מציינים puncta HttQ25-YFP זה נקבעו להיות או בסמוך המוקד ב- z-החיתוך מסוים על-ידי הזזת באופן ידני באמצעות z-המחסנית. של puncta HttQ25-YFP שבע שצוין כאן, שש משויכות detectably אות HttQ91-mCherry (כלומר, 86% מצרפי HttQ25-YFP משותף לשפה עם HttQ91-mCherry). שימו לב כי האות mCherry המשויך puncta HttQ25-YFP לעתים קרובות חלשים יותר מאשר רוב puncta mCherry-חיובית ב פקעית DA1. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-מותאם לשפות אחרות punctum לפני (לוחות משמאל) ואחרי (לוחות נכון) mCherry (מקבל) photobleaching. הגידול וכתוצאה מכך פלורסצנטיות YFP (תורם) נעשה שימוש כדי לייצר תמונת יעילות (סריגeff) סריג פיקסל-מאת פיקסל באמצעות AccPbFRET את יישום plug-in עבור ImageJ46. זה צבירה מסוים יש של סריג הכוללתeff של 61%. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.

ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

8.0K Views.  University of the Sciences. לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.

Video: Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Immunology and Infection

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Behavior

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Biology

ניטור אירועים אפילפטיים בדרוזופילה באמצעות הדמיית סידן

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

זרקור על המחבר: תובנות לגבי הטכניקות והממצאים של ההתקדמות האחרונה בחקר האפילפסיה 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

הערכת פנוטיפים ניווניות ב

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה