Name: monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-03-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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우리는 이러한 방법을 개발 하는 동안 많은 도움이 토론을 위한 Kopito, 루 오, 그리고 피어스 연구소의 회원을 감사합니다. 우리는 또한이 원고에의 중요 한 독서에 대 한 브라이언 Temsamrit을 감사합니다. 이 작품은 대학 과학 및 트 면 스미스 자선 신탁에서에서 자금에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 없다.

신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 명과27뉴런에서 이러한 집계의 확산을 중재 phagocytic 수용 체를 식별 하이 방법을 사용 했습니다. 우리의 접근 방식을 악용 초파리 를 사용 하 여 유전자 인간 질병 연구의 몇 가지 장점: 그것의 짧은 라이프 사이클 및 치료와 관련 된 기본적인 생물 학적 정보의 발견을 가속화할 수 있는 광대 한 유전 도구.
우리는 여기에 설명 하는 방법을 기존의 다른 동물에 비해 두 가지 주요 이점을 제공 및 세포 프리온 같은 전송에 대 한 문화 모델: 그대로 조직, 그리고 (2)에 있는 세포에서 생산 되는 (1) 집계 원인이 되는 에이전트 (예를 들면, 돌연변이 체 Htt) 일반적으로 접혀 버전을 별도 셀에에서 동일한 단백질 (예를 들어, 야생-타입 Htt)의 식을 프리온 같은 이벤트에 대 한 쉽게 액세스할 수 있는 "기자를"를 제공합니다. 우리는 초파리40확고는 정교한 유전자 도구를 사용 하 여 돌연변이 같은 유기 체 내에서 세포 인구 겹치지 야생-타입 Htt 단백질의 표현을 달성 했다. 많은 다른 조직 관련 Gal4 및 QF 드라이버를 쉽게 사용할 수 있기 때문에 비행 체에 본질적으로 어떤 뚜렷한 세포 유형 사이 프리온 같은 이전을 검토 하는 것은 가능 합니다.
접근의 중요 한 구성 요소는 돌연변이 같은 동물 내에서 다른 세포 인구에 있는 야생-타입 Htt 단백질의 차별된 표정을 달성 이다. 모든 식 중복 받는 사람 세포에서 야생-타입 Htt 집계 정확 하 게 보고 기증자 세포9,12,,27에서 발생 하는 프리온 같은 집계의 세포질 침투 되도록 제거 될 필요가 41. 이 추가적인 유전 도구 (예를 들어, Gal80와 QS repressors40)이이 문제를 완화 하 여 수행할 수 있습니다. 이상적인 유전자 설계 및 선정, 일단 puncta를 측정 하는 체계적인 방법을 설정 해야 합니다. 이 크게 표시 되는 셀의 수, 집계, 수 및 샘플의 신호 대 잡음 비율에 따라 달라 집니다. 우리는 여기에서 설명한 그림 4공동 지역화 긍정적인 무서 워 등 기준 데이터를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 야생-타입 Htt의 선택 제한 집계가이 기능에 따라 발생할 수 있습니다 과소 프리온 같은 전송 이벤트의 몇몇 돌연변이 체 Htt 집계 씨 confocal 현미경의 검출 한도 이하로 떨어질 수 있기 때문.
여기에 설명 된 vivo에서 접근 HD 또는 심지어 다른 polyQ 장애 관련 된 집계의 프리온 처럼 행동에 대 한 배타적입니다. 유전자 변형 파리 프리온 처럼 알파 synuclein PD, 광고, 타우에에서의 확산을 검사 개발 될 수 있다 및 SOD1 또는 동일한 실험 패러다임을 사용 하 여 ALS에 TDP-43. 이 단백질의 각 집계 경향이 돌연변이 기증자 세포, 그리고 유일한 집계 nucleated 때 받는 사람 세포에서 표현 되어야 합니다 같은 단백질의 용 해 버전에서 표현 되어야 합니다. 이 실험적인 패러다임 또한 다른 질병와 관련 된 병원 성 단백질 크로스 시드 메커니즘47을 통해 상호 작용 수 있습니다 신흥 아이디어 조사를 위해 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 조사 하 고 식별 분자 따라 세포질-세포질 확산이 치명적인 질병와 관련 된 병원 성 단백질의 기본 장치를 마더보드에 초파리 에서 사용할 수 있는 무수 한 유전 도구를 적용할 수 있습니다.

프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 "광우병" 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산1없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrPC) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrPC 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrPSc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체2사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.
단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다3. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간5, 에 밀접 하 게 관련 된 세포 독성4 와 두뇌를 통해 높은 재현성 및 질병 특정 경로 따라 진행 6. 이러한 패턴의 확산이이 질환과 관련 된 병원 성 집계 프리온 같은 속성을가지고 제안. 강력한 지원, 광고와 관련 된 집계의 프리온 같은 전송에 대 한 존재 PD, HD, 및 ALS-그들은 셀 템플릿 이전 영향을 받지 않는 셀7, 동일한 단백질의 단위체 형태의 구조적 변화에서 확산 8.
날짜의 단백질 프리온 처럼 확산 조사 연구의 대다수 포유류 세포 문화 모델, 어디 집계 전송을 사용 순진한 세포의 세포질에 다른 세포 또는 세포 외 공간에서 수행 되었습니다. 세포질9,10,11,12,13,,1415, 또는 마우스 두뇌에 집계 포함 된 재료를 주입 하 고 모니터링 하 여 집계는 사출 사이트16,17,18,19,20,,2122, 이외의 모양 23. 최근 유전자 변형 동물 세포내 집계 그대로 두뇌24,25,,2627, 내의 다른 셀에 확산을 보여 주기 위해 사용 되었습니다 28,,2930. 여기, 우리는 초파리 melanogaster의 그대로 뇌에 있는 개별 셀 사이의 집계 전송의 직접 시각화 하는 방법을 설명합니다. 초파리 모델 HD/polyglutamine (polyQ) 질병의 거의 2 년 전 처음 개발31,32 이 무질서의 기반이 되는 병원 성 메커니즘에 대 한 많은 귀중 한 통찰력 제공 33. HD는 단백질 huntingtin (Htt)34코드 하는 유전자는 상 염색체 지배적인 돌연변이 의해 발생 하는 상속 된 신경 장애. 이 돌연변이의 병원 문 턱을 넘어 Htt의 N-말단 근처 polyQ 스트레치의 확장 결과 ~ 37 glutamines, misfold 및 집계35,36단백질을 일으키는. 야생-타입 Htt 단백질 포함 된 <이 뻗 기에 37 glutamines 그들의 네이티브 배를 달성 하지만에 유도 될 수 있다는 Htt 집계 "씨앗"12,,2737와 직접적인 물리적 접촉 시 집계. 우리는이 homotypic, 프리온 같은 전송에 대 한 판독으로 야생-타입 Htt의 nucleated 집계 및 다른 세포에서 발생 하는 돌연변이 체 Htt 집계의 세포질 항목을 악용 합니다.
프리온 같은 집계 하 여 결정 하는 메커니즘 셀 사이의 여행 불 치 신경 퇴행 성 질환에 대 한 새로운 치료 대상의 식별 될 수 있습니다. 우리는 빠른 라이프 사이클을 이용, 사용의 용이성, 그리고 초파리 melanogaster 돌연변이 체 Htt의 셀을 확산에 대 한 분자 메커니즘 정의를 유전적 추적성을 걸릴. 우리의 실험 전략 초파리, 잘 설립 Gal4 특정 상류 활성화 순서 (Gal4 UAS) 시스템38 및 QF QUAS 최근 개발 시스템39에서 사용할 수 있는 두 개의 이진 식 시스템을 사용합니다. 이 두 개의 독립적인 시스템을 커플링 같은 비행40내 뚜렷한 세포 인구를 제한 하는 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 표현 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 프리온 같은 집계 된 상태로, 미리 형성 된 돌연변이 체 Htt와 육체적 인 접촉의 직접적인 결과 일반적으로 확산, 수용 성 상태에서 세포질 야생-타입 Htt의 재분배를 모니터링 하 여 돌연변이 Htt의 확산 검토 집계 "씨입니다." Htt의 돌연변이 의해 야생-타입 Htt의 변환 생물을 사용 하 여 확인 될 수 있다 또는 단백질 단백질 상호 작용, 형광 공명 에너지 등을 보고 생물 기술 전송 (무서 워)9,,2741 .
중요 한 것은, 우리 또한 많은 유전자 초파리 유전자 및 단백질의 프리온 같은 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 도구를 액세스할 수 있습니다. 우리는 최근 세포 표면 폐품 수용 체, 드레이퍼42,43, 신경 축 삭에서 초파리 중앙에 가까운 phagocytic 명과 돌연변이 체 Htt 집계를 전송에 대 한 중요 한 역할을 공개 하기 위해이 접근을 사용 신경 시스템 (CNS)27 따라서, 우리가 여기에 설명 하는 유전 및 이미징 기반 접근 강력한 모델 생물, 초파리하지만 사용 하기 간단한에서에서 질병 관련 현상에 대 한 중요 한 기본적인 생물 학적 정보를 밝힐 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Dilute to 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquot and freeze upon receipt</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Use at 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td></tr><tr><td>FITC anti-chicken</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>use in non-dominant hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>use in dominant hand</td></tr><tr><td>LAS X image analysis software</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris image analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.

여기에 설명 된 방법을 그대로 비행 CNS에서에서 다른 한 세포 인구에서 Htt의 단백질 프리온 같은 전송 시연 하는 강력한 데이터 생성. 야생-타입 Htt의에서 변환 확산 punctate 기증자 ORNs (그림 2A C 및 그림 4A, B)에서 HttQ91 mCherry 식의 결과로 받는 사람 명과에서이 YFP 융해 단백질의 직접 형광에 의해 관찰 됩니다. 이 두 세포 인구 사이 프리온 같은 전송 이벤트의 정확한 보고 유전자 변형 파리와 중 어떤 오버랩 없이 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 강한 식 수준의 생산 Gal4/QF 드라이버의 신중한 선택 필요 개발 또는 성인에서. 또한, 형광 단백질-Htt 퓨전 transgenes의 사려깊은 디자인 강력한 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 돌연변이 및 야생-타입 Htt 집계 될 수 정량 punctate 개체로 하거나 수동으로 (그림 2C 및 그림 4) 또는 이미지 분석 소프트웨어 (그림 3A, B)를 사용 하 여 측정 될 수 있다 고 돌연변이 야생-타입 단백질그림 4(A), 사이 공동 지역화에 대 한 평가 될 수 있다 집계 인구그림 3(C)으로 추가 특징, 그리고 무서 워27 (그림 4에 대 한 분석 될 수 있다 B). 이러한 분석 필요 (예를 들어, c f P/YFP9 기증자 및 수락자 쌍 사이 무서 워 수 있도록 형광 단백질 태그 충분히 분리 된 형광 속성, 하지만 충분 한 스펙트럼 오버랩에 돌연변이 야생-타입 Htt의 융합 또는 YFP/mCherry27).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> 그림 2 . 신경 HttQ91 mCherry 집계에 의해 glial HttQ25 YFP의 프리온 같은 변환의 공초점 이미지. (A) 최대의 강도 투영 ~ (빨간색) DA1 ORN axons repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25-YFP (녹색)를 사용 하 여 표현 하는 HttQ91 mCherry 남성 비행에서 한 더듬이 엽 보여주는 confocal 조각의 30 µ m. 더듬이 엽 DA1 glomerulus, DA1 온 축 삭 종료의 대략적인 경계는 점선 및 고체 라인으로 각각 표시 됩니다. (B) 최대 강도 프로젝션 ~ 슬라이스에서 A. (C) A 단일 0.35 µ m confocal 단일 HttQ25 YFP puncta 및 그것의 관련된 HttQ91 mCherry 신호 (DA1 사 영역의 확대 보기를 표시 하는 confocal 조각의 20 µ m 각 채널에 화살표로 표시). 빨강 채널에서 신호 HttQ25 YFP 및 HttQ91 mCherry 신호 사이 공동 지역화를 시각화 하기 위해 향상 되었습니다. 모든 이미지는 40 X 1.4NA 오일 목표를 사용 하 여 인수 했다. 스케일 바 = 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> 그림 3 . HttQ91-mCherry 집계 DA1 온 축 삭에서의 3 차원 분석. (A)는 3D 묘사의 HttQ91-mCherry Or67d-QF 같은 그림 2B에 표시 된 데이터를 사용 하 여 통해 DA1 glomerulus 표현. (B) A 스크린샷 개별 개체 또는 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (A)에 원시 데이터에서 확인 된 "반점"를 보여주는. 소프트웨어는이 채널/이미지에 다양 한 크기의 56 개체를 식별합니다. (B) 화살촉으로 표시 하는 자리를의 직경을 측정 했다 ~ 1.2 µ m. 화살표 어디 두 개체는 정확 하 게 병합 하지 한 자리에 개별 puncta의 가까운 근접으로 인해 소프트웨어에 의해 위치를 가리킵니다. 이것을 극복 하기 위해 다른 임계 처리 설정 소프트웨어에서 테스트 해야/또는 병합 된 관광 명소 가능 하면 수동으로 분리 해야 합니다. 스케일 바 = 10 µ m.의 직경 분포를 보여 주는 (C) 히스토그램 측정 소프트웨어에 의해 HttQ91 mCherry (B)에 표시 된 "반점"에 대 한. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> 그림 4 . 공동 현지화 및 무서 워 분석 유도 HttQ25 YFP 집계. (A) A 4 개별 0.35 µ m confocal z-조각 표현 repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25 YFP를 사용 하 여 DA1 ORNs에 HttQ91-mCherry 남성 비행 두뇌에서의 몽타주. 신호는 작은 HttQ91 mCherry 집계 되 고 유도 HttQ25 YFP 집계 확산 신호를 주변에서 밖으로 서 있도록 조정 되었다. 분할 영역 표시는 각각 구분 하 여 ~ 1.0 µ m (슬라이스 번호 병합 된 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시)는 여러 집계를 관찰할 수 있다. 화살표는 수동으로 z 스택을 통해 이동 하 여 또는 그 특정 z 슬라이스에 초점 근처에 있을 하기로 결정 했다 HttQ25 YFP puncta를 나타냅니다. 여기에 표시 된 7 개의 HttQ25 YFP puncta의 6 탐지 HttQ91 mCherry 신호 연결 (즉, HttQ25 YFP 집계의 86% 공동 지역화와 HttQ91-mCherry). MCherry 신호 HttQ25 YFP puncta와 관련 된 참고는 종종 DA1 glomerulus에 mCherry-긍정적인 puncta의 대부분 보다는 더 약하다. 눈금 막대 = 5 µ m. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-지역화 푼 크 툼 (왼쪽된 패널) 전에 전후 (오른쪽 패널) mCherry (수락자) photobleaching. YFP (기증자) 형광 결과 증가 ImageJ46에 대 한 AccPbFRET 플러그인을 사용 하 여 픽셀에 의해 무서 워 효율 (무서 워eff) 이미지를 생산 하기 위해 사용 되었다. 이 특정 집계의 61%는 전반적인 무서 워eff 는 있다. 눈금 막대 = 1 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

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Universidad San Sebastian

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Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

8.0K 조회수.  University of the Sciences. 병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

신경과학

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

행동분석학

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

생물학

Calcium Imaging을 통한 Drosophila 의 간질형 이벤트 모니터링

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

저자 스포트라이트: 간질 연구의 최근 발전에 대한 기술 및 연구 결과에 대한 통찰력 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

요약

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Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

에 신약 표현형을 평가

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상