Il metodo si basa su software open source per valutare sistematicamente le attività motorie locali per il comportamento di tracciamento delle mosche adulte e delle larve dai video registrati. Questo metodo richiede l'integrazione di dispositivi a basso costo per registrare e analizzare il comportamento, rendendolo un approccio economico ed efficace per lo screening della locomozione delle mosche. Questa tecnologia è impiegata per identificare la modificazione comportamentale in un modello di mosca di malattia umana con compromissione del movimento locale, ma non è adatta per il trattamento di malattie, disabilità o difficoltà.
È essenziale cancellare la finestra video pertinente durante il processo di analisi, vale a dire la finestra video originale e quella di elaborazione. Per iniziare, mescolare il reagente A e il reagente B del kit di silice in un rapporto di uno a 10, secondo le istruzioni del produttore, per preparare l'arena in campo aperto per il monitoraggio della locomozione drosophila. Quindi, impostare la videocamera HD su un treppiede, regolandola in modo che l'obiettivo della fotocamera sia perpendicolare alla superficie dell'arena di silice.
Quindi apri il video con Fiji. Trascinate la barra di avanzamento sul fotogramma iniziale e approvate tacitamente. Scegli l'intero corpo della mosca usando lo strumento di selezione a mano libera.
Fare clic su immagine, regolare, luminosità e contrasto per regolare il bilanciamento del bianco fino a quando il valore di grigio dell'area selezionata si avvicina allo sfondo ampio. Trasferisci la mosca anestetizzata nell'arena del campo aperto. Una volta che la mosca si riprende dall'anestesia, metti il piatto dell'arena con la mosca sotto la fotocamera e scuoti rapidamente da un lato all'altro per assicurarti che la mosca sia in movimento quando inizia la registrazione.
Premere il pulsante di registrazione sull'applicazione della fotocamera per avviare la registrazione video. Al termine della registrazione, premere il pulsante di arresto per terminare la registrazione video. Converti i video registrati in formato AVI con codifica pagana M-J in modo che possano essere aperti e analizzati utilizzando le Fiji.
Imposta anche i fotogrammi al secondo del video su 15 fps per le mosche adulte e 12 fps per le larve. Per aprire il video con Fiji, selezionare le due opzioni, utilizzare lo stack virtuale e convertire in scala di grigi, nella finestra pop-up. Ottieni una finestra di elaborazione utilizzando lo strumento imposta immagine attiva del plug-in animal tracker e crea un'area di tracciamento che circonda l'arena nella finestra video originale, utilizzando lo strumento ovale.
Impostate i filtri e i parametri dei due filtri per il primo fotogramma vuoto nella finestra di elaborazione. Quindi selezionate il fotogramma successivo nella finestra video originale e scegliete la superficie filtrata della finestra di elaborazione. Una volta selezionata una finestra di elaborazione filtrata, utilizzare lo strumento imposta soglia per ruotare il tratto con un profilo rosso, coperto nella finestra di elaborazione.
Quindi utilizzare il rilevatore di blob impostato per consentire al computer di riconoscere la mosca con un profilo rosso, coperto nella finestra di elaborazione. Imposta l'ultimo fotogramma per la mosca o le larve adulte, come descritto nel manoscritto testuale. Utilizzare lo strumento Mostra BLOB per presentare un rettangolo di rilevamento nella finestra video originale.
Avviare il rilevamento ed esportare il file di rilevamento al termine del monitoraggio. Carica i file di traccia e zona utilizzando il plug-in Animal Tracker e Tracking Analyzer. Selezionare l'indice desiderato utilizzando le impostazioni della zona e modificare le impostazioni dei parametri.
Calcolate il tempo dell'intervallo di fotogrammi utilizzando la frequenza fotogrammi. Produrre i grafici di analisi quantitativa utilizzando il software del foglio di calcolo e il prisma del grafico del tampone, dopo essere stati analizzati nell'analizzatore di tracciamento. Aprire il file di traccia.
Copiare tutte le coordinate in Microsoft Office Excel e dividere le celle utilizzando la barra spaziatrice. Per calcolare il tempo di immobilità per intervallo di fotogrammi, selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un istogramma per visualizzare visivamente il tempo di immobilità con il margine dell'intero istogramma. Per illustrare le variazioni dell'angolo di direzione, selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un diagramma a dispersione.
Le mosche adulte e le larve di terza Instar, trattate con Rotenone, presentavano deficit locomotori significativi rispetto a quelli delle mosche di controllo, alimentate con DMSO solvente. L'analisi quantitativa del trattamento con Rotenone nei moscerini adulti ha mostrato una significativa diminuzione della distanza percorsa e della velocità media. E un aumento significativo del tempo di immobilità.
I grafici rappresentativi hanno mostrato meno picchi per la velocità di movimento per intervallo di fotogramma nelle mosche alimentate con Rotenone rispetto a quelle nel controllo, indicando la gravità del deficit di attività locomotoria. La colonna di immobilità istituzionalistica dei pixel spostati per fotogramma ha anche mostrato un movimento significativamente inferiore entro un minuto per le mosche alimentate con Rotenone, rispetto alle mosche di controllo. I grafici rappresentativi che illustrano l'angolo di movimento dei cambiamenti di direzione negli animali nutriti con Rotenone e di controllo hanno anche rivelato alterazioni nella direzione scelta dalle mosche.
Risultati simili sono stati osservati per la terza larva Instar. I risultati hanno rivelato che il movimento comportamentale delle larve di tracciamento alimentate con Rotenone era significativamente compromesso rispetto al controllo. Il passo più cruciale nel processo di analisi è la formazione del primo frame vuoto, in quanto dimostra se il software può controllare in modo efficace.
Questa tecnologia potrebbe consentire ai ricercatori di approfondire il meccanismo sottostante di molteplici difetti, come lesioni nervose o muscolari.
