We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l&#39;uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l&#39;area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro. <ol><li> Purificare BAC DNA (RP23-401E11, lunghezza clone di 228391 bps) utilizzando un metodo di estrazione alcalina 10, 11. Caratterizzare il clone BAC da SpeI digestione di 5 mg di RP23-401E11 per confermare la dimensione corretta del gene bersaglio. NOTA: Il BAC DNA è stato digerito in 14 frammenti. </li><li> Inserire il gene TdTomato giornalista nel sito Not I / Sal I del vettore shuttle PLD53SC-A-GFP-B11 e sostituire il gene GFP nello stesso sito. Quindi, utilizzando BAC RP23-401E11 come modello, amplificare le caselle di omologia (A e B) al primo esone tradotta di Il-22 (esone 1) mediante PCR (95 ° C 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 secondi, e una estensione finale a 72 ° C per 10 min). In un sistema di reazione PCR 50 microlitri, aggiungere 50 ng (1 ml) di BAC DNA, 0,5 ml di primer (10 mM), 40 ml di PCR Supermix alta fedeltà, e 8 ml di H 2 O. NOTA: I primer per le caselle A e B sono i seguenti: Una casella in avanti: 5&#39;-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG e Reverse: 5&#39;-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; Scatola B Forward: 5&#39;-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA e Reverse: 5&#39;-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. I siti degli enzimi di restrizione (Asc I e Pac I) sono sottolineate. </li><li> Legare 500 ng di Asc I-digerito A e 500 ng di Fragm B Pac I-digeritoEnt in 50 ng di PLD53SC-ATB (tdTomato) vettore a 16 ° C per 1 ora. </li><li> Transform purificato vettoriale PLD53SC-ATB in cellule BAC-competenti 11 e li cultura su Luria-Bertani (LB) piastre di agar con cloramfenicolo (20 mg / ml) e ampicillina (30 mcg / ml) a 37 ° C. Scegli due o tre colonie di co-integrazione dalle piastre maestro Ch / Amp. </li><li> Inoculare ogni colonia in 1 ml di LB addizionato con 20 ug / ml di cloramfenicolo e incubare per 1 ora a 37 ° C e 225 rpm. Distribuire 100 ml di ciascuna miscela su una piastra di LB-agar (10 g di Peptone 140, 5 g di estratto di lievito, 12 g di agar e 1 L di acqua; pH 7.5) addizionato con cloramfenicolo e 4-4,5% di saccarosio. Incubare la cultura durante la notte a 37 ° C. </li><li> Scegli entrambe colonie grandi e piccoli e li replate su due piatti LB-agar con cloramfenicolo. Poi, esporre le piastre con o senza luce UV per 30 sec e raccogliere le colonie sensibili agli UV per ulteriori analisi. </li><li> Identificare il DNA BAC modificato mediante PCR utilizzando tdTomato / IL-22 Primer eterozigote (Forward: 5 &#39;ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT; Reverse: 5&#39; TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Le condizioni Thermocycler sono le seguenti: 95 ° C per 2 min; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 56 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; e una estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li><li> Conferma la sequenza dell&#39;area modificata del BAC BAC sequenziamento diretto di grandi prep BAC DNA 12. </li><li> Anestetizzare un mouse destinatario con una dose di 0,25% tribromoethanol nella cavità peritoneale, quando impiantare gli zigoti microiniettati in topi / 6c C57BL pseudo-gravidanza. </li><li> Linearizzare l&#39;IL-22-tdTomato BAC costrutto (10 mg) mediante digestione con 5 ml di restrizione endonucleasePi-SCEI in 100 ml di sistema di reazione e microinject il DNA linearizzato BAC in uova fecondate di C57BL / 6 femmine in fase di pronuclei 13. Screit il topi transgenici con l&#39;analisi Southern blot di DNA isolati da biopsie di coda utilizzando le procedure standard. </li></ol> Preparazione 2. Single-cell da milza, timo, linfonodi, e le placche di Peyer NOTA: topi reporter IL-22-tdTomato sono stati mantenuti al National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Il metodo di eutanasia è conforme alle più recenti linee guida AVMA sull&#39;eutanasia. Tutti i topi sono stati sacrificati con CO 2 inalazione 14. <ol><li> Euthanize un IL-22-tdTomato del mouse in una camera di CO 2 e metterlo su un tampone pulito. Sterilizzare la pelle dell&#39;addome spruzzando il 70% di alcol e tagliarlo aperto. Rimuovere la milza nel fianco sinistro e il timo dietro lo sterno. </li><li> Per raccogliere i nodi mesentericlymph (situato nel tessuto mesenterico) e placche di Peyer (piccoli lymphoidnodules in tutta la regione ileo dell&#39;intestino tenue), prendere la mesenterica bianco perlato i nodi vicino alla tegli parete dell&#39;intestino tenue con sezionare pinze con punte a punta fine seghettati e poi rimuovere l&#39;intero intestino tenue e colon fuori dal corpo. Trova le patch ovali estesi (placche del Peyer) lungo l&#39;intestino e tagliarli con le forbici. Macinare questi tessuti linfoidi (linfonodi e placche di Peyer) individualmente tra due vetrini smerigliati in una cella singola sospensione in PBS / 1% di siero fetale bovino (FBS) tampone sul ghiaccio. </li><li> Tritare la milza o tessuti timo utilizzando lo stesso metodo come al punto 2.2. Centrifugare la sospensione della milza per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C. Aggiungere 1 ml di tampone di lisi ACK per milza per i pellet cellulari. </li><li> Mescolare bene e lasciare riposare per 1 min. Aggiungere 9 ml di tampone sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni campione. Centrifugare per centrifugazione per 8 minuti a 500 xg e 4 ° C per rimuovere i globuli rossi. NOTA: Non aggiungere ACK buffer di lisi delle cellule del timo. </li><li> Risospendere le leucociti risultanti in 5 ml di PBS e pass le cellule attraverso un colino cella di 100 micron. Raccogliere il pellet di cellule per centrifugazione a 500 g per 8 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di media RPMI o tampone FACS e contare le cellule vitali utilizzando 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 3. Isolamento di intraepiteliale linfociti e lamina propria cellule dall&#39;intestino <ol><li> Aprire la pelle addominale come al punto 2.1, tagliare l&#39;intestino tenue, dal duodeno (accanto allo stomaco) per ileo (vicino alla appendice), e l&#39;intero colon, proprio sopra l&#39;ano. Rimuovere il adiposo in più e pinze dei tessuti utilizzando mesenterici. Mettere subito l&#39;intestino in PBS ghiacciato. </li><li> Se vuoi placche di Peyer (piccole, noduli grezzi) lungo la regione distale del piccolo intestino. Rimuovere le masse con pinza Andopen dell&#39;intestino lunghezza con le forbici. Lavare accuratamente l&#39;intestino con 10 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Incubare i tessuti in 20 ml di tampone di pre-digestione (5 mM EDTAe 1 mM ditiotreitolo in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)) per 30 minuti a 37 ° C con rotazione lenta (50 rpm) in un agitatore. Dopo ciascuna delle 2 incubazione, rimuovere lo strato di cellule epiteliali, che contiene i linfociti intraepiteliali (IELS), da un&#39;intensa vortex (30 sec a 12.000 giri al minuto) e passare tutti i tessuti attraverso un colino cella di 100 micron. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione EDTA al tessuto per la seconda incubazione per 30 min a 37 ° C. Passare le frazioni IEL attraverso un colino cella di 100 micron e piscina con le frazioni precedenti. Mantenere i frammenti rimanenti intestino sul ghiaccio da trattare nella fase 3.9. </li><li> Centrifugare le frazioni IEL in pool a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare le frazioni IEL in pool con 10 ml di HBSS / 5% FBS e spin giù per 5 min a 800 xg e 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 8 ml di terreno 44% di silice colloidale e 15 rivestirle medio silice colloidale 5 ml di 67%. Centrifugare il 44% / 67.5% Di pendenza miscela di cellule per 20 minuti a temperatura ambiente e 1.500 x g. </li><li> Raccogliere le cellule IEL della band a livello di interfaccia. Innanzitutto, rimuovere lo strato superiore del surnatante (circa 5 ml) con 1 ml pipetta. Poi, IELS raccolta all&#39;interfase della colloidale medio di silice gradiente. </li><li> Lavare le IELS con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno RPMI. Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 800 xg e 4 ° C. Risospendere le IELS in 5 ml di RPMI per passo 3.15. </li><li> Per l&#39;isolamento dei linfociti della lamina propria (LPLS), sminuzzare i frammenti di tessuto dell&#39;intestino dal punto 3.4 in piccoli pezzi con le forbici (1 mm) e digerire i pezzi con 10 ml di tampone di digestione (0,05 g di collagenasi, 0,05 g di DNasiI, e 0,3 g di dispasi II in RPMI / 5% FBS) per 15-20 minuti a 37 ° C. </li><li> Filtrare la miscela attraverso un colino cella di 70 micron. Il supernatante flow-through contiene LPL rilasciato. </li><li> Completamente digerire i frammenti intestino ripetendo i passaggi 3,9-3,10 (di solito, devono essereripetuto 3 volte). Ogni volta, piscina il surnatante contenente il LPLS. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 1500 xg e temperatura ambiente e risospendere il pellet in RPMI / 5% FBS. farli passare attraverso un colino cella di 40 micron. </li><li> Risospendere le pellet cellulari in 10 ml della frazione 40% di 40:80 silice colloidale dislivello medio li sovrapporre 5 ml della frazione 80% in una provetta da 15 ml. </li><li> Eseguire la separazione gradiente di densità per centrifugazione per 20 min a 1500 xg e temperatura ambiente 15. </li><li> Raccogliere il LPLS, come descritto al punto 3.7. li Risciacquare una volta con 10 ml di PBS e risospendere il pellet in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS o mezzo RPMI. </li><li> Contare le cellule vitali (sia IELS e LPLS) con lo 0,4% trypan colorante blu soluzione / PBS. </li></ol> 4. L&#39;espressione di IL-22-tdTomato in Colite <ol><li> Preparare sospensioni cellulari milza singoli da topi IL-22-TdTomato ad una concentrazione di 1 x 10 &lt;sup&gt; 7 cellule / ml in PBS sterile, come descritto ai punti 2.1-2.4. </li><li> Purificare le cellule T CD4 + con il mouse CD4 cellulare Metodo di isolamento Negativo 10. Etichettarli con l&#39;anti-CD4-APC (clone RM4-5, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) e anti-CD45RB FITC-(clone 16A, 0,5 ml / 1 x 10 6 cellule in PBS / 1% tampone FBS) mediante incubazione a 4 ° C per 30 min. </li><li> Spin le cellule verso il basso per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Lavare le cellule con 2 ml di PBS / 1% tampone FBS e risospendere in 1 ml di / 1% FBS tampone PBS colorazione. </li><li> Eseguire le cellule T etichettati su una macchina di citometria a flusso 16. Porta le cellule su una popolazione di cellule T e di ordinamento CD4 + CD45RB alte cellule doppio positive (la lunghezza d&#39;onda rilevata a 488 nm e 633 nm) laser. </li><li> Raccogliere le cellule ordinati per centrifugazione per 5 min a 500 xg e 4 ° C. Risospendere il pellet di cellule in tampone PBS sterile a 1 x 10 6 </sup&gt; cellule / ml. Iniettare le cellule (0,5 x 10 6) nel peritoneo ofeach Rag1 - Mouse destinatario - /. </li><li> Sacrificare i topi riceventi sotto di CO 2 in vari momenti. Raccogliere i linfonodi mesenterici e intestino tenue e crasso, come descritto ai punti 2.1 e 2.2. Mettere ogni linfonodo mesenterico e cut-aperto intestino (carta / intestino / carta del panino) nel 4% paraformaldeide (PFA, gestire sotto una cappa) durante la notte per riparare i tessuti. Sostituire il PFA con il 18% di saccarosio per 16-24 ore e poi congelare i tessuti per il sezionamento. </li><li> Utilizzare la macchina criostato per tagliare il tessuto 17, 18, 19. Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per circa 60 minuti e metterli in acetone per 10 min a temperatura ambiente. li asciugare a temperatura ambiente per circa 5 minuti. </li><li> Aggiungere FBS in eccesso, rimuoverlo dalla pipetta e aggiungere anti-RFP ad un 1: BSA 200 diluizione nel 0,1% / 1x PBS. Incubare l&#39;anticorpo a 37 ° C per 60 min. </li><li> Risciacquare le sezioni in 1x PBS per 10 min e applicare l&#39;anticorpo secondario corrispondente (goat anti-rabbit 568) al tessuto, diluito 1: 300 in 1% BSA / PBS 1x, per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBS 1x per 10 min, pulire asciugare e aggiungere lamelle. </li><li> Visualizza tutti i campioni con un microscopio a fluorescenza in presenza di luce coerente (RFP: filtro di eccitazione 540-580 nm) con l&#39;obiettivo 40X. </li></ol>

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N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease.">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice.">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li><li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+the+intestine:+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses.">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li><li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection.">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l&#39;espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La codifica TdTomato gene reporter è stato inserito nel locus IL-22 in un sito che interrompe la sequenza segnale. Questo risultato strategia in reporter essendo intrappolati nella cellula producente, a differenza di IL-22 che è rapidamente secreta, permettendo la visualizzazione della cellula producente. L&#39;IL-22-giornalista ingegnerizzato era contenuto all&#39;interno di un grande BAC, con lo scopo di preservare gli elementi regolatori, così conferendo fedeltà di espressione del reporter corrispondente a quella di IL-22. I tessuti intestinali di m transgenicoice visualizzata espressione giornalista omeostatico nelle cellule CD4 T e linfociti innate nella lamina propria dell&#39;intestino tenue. In colite indotta, cellule T CD4 espresso il giornalista nel colon. Il ruolo di IL-22 nella malattia infiammatoria intestinale è stato poco chiaro. Partecipando nella rigenerazione della mucosa difesa e tessuto intestinale, IL-22 è in grado di suscitare la produzione sia di protezione 20, 21, 22 e mediatori proinfiammatori (ad esempio, IL-8) 23, 24. Due modelli di T colite cella-driven hanno mostrato un aumento di IL-22 nel colon, tra cui TCR α - / - mice 25, 26 e il trasferimento del modello CD45RB hi 27. Confrontando i modelli malattia infiammatoria intestinale, l&#39;espressione di IL-22 nell&#39;intestino era più alto in un Crmodelthan malattia di ohn in un modello di colite ulcerosa 21, 24 .Qui, abbiamo trasferire le cellule T CD4CD45RBhi dai topi reporter in Rag1 - / - destinatari e imitare il processo patogeno della malattia di Crohn. Abbiamo scoperto che, precedendo la colite, IL-22 giornalisti sono stati visualizzati nei linfonodi drenanti intestinali (MLN). I segnali poi diminuita nel MLN e spostati l&#39;intestino, in particolare l&#39;intestino tenue e colon distale, con lo sviluppo di colite. La maggior parte dei giornalisti tdTomato sono stati localizzati all&#39;interno della mucosa lamina propria dell&#39;intestino. Un diverso tipo di reporter per IL-22 è stata precedentemente descritta, in cui le cellule sono assegnati in modo permanente tale che essi e le loro figlie continuano ad esprimere il reporter, se trascrizione di IL-22 o meno ha continuato 28. Come nel nostro studio, intestino linfociti innate sono stati segnati in condizioni omeostatiche, e nella colite, tsi reporter è stato localizzato nelle cellule T dai linfonodi mesenterici al tessuto intestinale. Le procedure descritte in questo protocollo sarebbero applicabili per la creazione di altri topi transgene giornalista, come IL-17, IL-25, e così via. Tuttavia, è fondamentale scegliere adatti cloni BAC trasportano elementi regolatori distali per assicurare la fedeltà di espressione del gene reporter, dato che i transgeni sono integrati in modo casuale nel genoma del mouse. Il mouse giornalista consente l&#39;identificazione di cellule che esprimono in vivo, così come per la purificazione e caratterizzazione di cellule vive. Abbiamo usato tdTomato, una proteina fluorescente rossa eccezionalmente brillante, come un gene reporter fluorescente a fare il giornalista adatto per gli studi di imaging di animali vivi.

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile. Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine ​​secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L&#39;interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l&#39;infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni. Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all&#39;interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine ​​secrete.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23.C</td><td>Need gene ID: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>Dynal shaker</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr><tr><td>LSRII SORP/flow cytometry</td><td>Becton, Dickinson and Company&amp;nbsp;</td><td></td><td>Ask for quote</td></tr></tbody></table>

visualization of il-22-expressing lymphocytes using reporter mice

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell&#39;intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all&#39;interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l&#39;inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all&#39;interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all&#39;interno della lamina propria delle piccole tessuti dell&#39;intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura 2. Così, il giornalista tdTomato è stato intrappolato all&#39;interno delle cellule IL-22 che esprimono, consentendo loro individuazione e l&#39;isolamento mediante citometria a flusso. I topi omozigoti sono stati allevati da linee fondatori e screening mediante PCR, e non richiedevano reincrocio per conseguire prole con un&#39;identità genetica, come richiesto nel solito strategia knock-in. Per testare la fedeltà dei IL-22 giornalisti, in vitro splenociti generate da sono state coltivate in Th22 o condizioni neutre. <strong&gt; Figura 3 dimostra che l&#39;IL-22-tdtomato è stato ben espresso nelle cellule Th22 in vitro, sia rilevata mediante citometria di flusso o microscopia a fluorescenza. In vivo, come mostrato in figura 4, il reporter IL-22 è stata rilevata in diversi tessuti di topo sotto condizione omeostatica. La maggior parte del segnale tdTomato è stato trovato nelle cellule lamina propria (LP) dall&#39;intestino, ma non nel linfonodi ascellari (ALN), la milza o il timo. Per visualizzare il reporter tdTomato nel tessuto infiammato, abbiamo utilizzato un modello murino di colite indotta dal trasferimento di cellule T CD4 + giornalista CD45RB hi in RAG1 - / - mice. Figura 5 dimostra che i reporter erano di prima presenti nei linfonodi mesenterici e quindi accumulata all&#39;interno della lamina propria delle piccole tessuti dell&#39;intestino e del colon distale. Presi insieme, questo nuovo metodo per la generazione di IL-22 topi giornalista è efficace e risparmio di tempo. Figura 1: Mappa del sito del vettore pBACe3.6. pBACe3.6 è caratterizzata dal fatto di contenere cloramfenicolo resistenza agli antibiotici e un gene sacBII come marcatore positivo selezione. Durante la ricombinazione, i cloni desiderati sono saccarosio-resistenti attraverso la loro esprime il gene sacBII e sono autorizzati a crescere su supporti saccarosio-contenente, mentre le colonie negativi BAC sono saccarosio-sensibili. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig2.jpg" /> Figura 2: Rappresentazione schematica del modificato clone RP23-401E11 BAC. Un gene reporter tdTomato stato introdotto nel Il-22 locus, che comprende IL-22 e regolamentari elementi in un murine bacterial artificial chromosome (RP23-401E11 BAC), utilizzando la tecnologia recombineering. Con la ricombinazione omologa, la sequenza del peptide segnale di IL-22 nella<html> BAC è stato interrotto e esone 1 di Il-22 è stato sostituito dal gene reporter tdTomato. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54710/54710fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig3.jpg" /> Figura 3: Identificazione di IL-22 reporter in splenociti coltivate in vitro. cellule T CD4 sono stati purificati da milza e poi stimolate con anti-CD28; anti-CD3 (condizione neutra); o anti-CD3, anti-CD28, anti-IFNƳ, anti-IL4, IL-6, TGF-β, e 6-Formylindolo (3,2-b) carbazolo (FICZ) per 5 giorni. IL-22-tdTomato è stata analizzata mediante citometria di flusso (in alto due) e la microscopia a fluorescenza (due inferiori, barra della scala: 100 micron). I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54710/54710fig4.jpg" /> Figura 4: Visualizzazione di IL-22-cellule che producono in diversi tessuti di topo. cella singola sospensioni sono stati preparati dalla milza, timo, linfonodi, intestino (IEL e LP), e le placche di Peyer. Sono stati poi superficie colorati con FITC anti-CD3 ed esaminate per l&#39;espressione tdTomato. MLN: mesenterica linfonodi, ALN: linfonodi ascellari, PP: le placche di Peyer, IEL: cellule intraepiteliali isolate dal piccolo intestino, LP: le cellule lamina propria purificato dal piccolo intestino. I numeri nei quadranti indicano la percentuale di cellule CD45 +. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54710/54710fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5: localizzazione di IL-22 giornalisti durante lo sviluppo di trasferimento T-cell colite. cellule T CD4CD45RBHigh da IL-22 topi reporter sono stati trasferiti in Rag1 - / - topi, ei segnali tdTomato sono stati valutati mediante immunoistochimica nei diversi tessuti in diversi momenti durante lo sviluppo di colite. Le frecce indicano i segnali di IL-22-tdTomato. Barre di scala = 25 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54710/54710fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K Views.  National Cancer Institute, National Institutes of Health. We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse. 

Video: Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

Ricerca

Biologia

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Immunologia e infezioni

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

L'isolamento e l'attivazione di linfociti murini

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

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Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il

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Isolamento di cellule linfoidi innate di gruppo 2 dalla mucosa nasale di topo per rilevare l'espressione di CD226

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