Questo protocollo è stabilito per isolare e identificare le cellule linfoidi innate del gruppo due dalla mucosa nasale murina ed esplorare i determinati effetti e meccanismi sottostanti dell'ILC due nelle malattie nasali. Questa tecnica consente ai ricercatori di isolare ILC due dal mesoteliale locale ed esporre l'espressione dell'antigene di superficie mediante citometria a flusso. La nostra tecnica non prevede operazioni complicate.
Tuttavia, una cosa importante è cercare di rimuovere completamente la carne aderente alle piccole ossa per evitare l'impatto di altri tessuti vicini Prima di iniziare l'esperimento, ospitare topi neri selvatici di tipo C57 sei maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane in condizioni specifiche prive di agenti patogeni forniti di chow e acqua di laboratorio standard. Per stabilire il modello di rinite allergica, emulsionare 50 microgrammi di ovalbumina in 0,2 millilitri di PBS sterile contenente due milligrammi di idrossido di alluminio e iniettare per via intraperitoneale 50 microgrammi di ovoalbumina emulsionata in ciascun topo su zero, sette e 14 giorni. Nei giorni 21, 22, 23, 24 e 25, i topi instillati per via intranasale con 50 microgrammi di ovalbumina si sono sciolti in 30 microlitri di PBS sterile, seguiti dall'eutanasia dei topi 24 ore dopo l'ultima sfida.
Immergere la testa del topo eutanasia in etanolo al 75% per cinque minuti ed evitare che l'etanolo entri nella narice esterna. Posizionare l'addome verso il basso sul tavolo operatorio. Tagliare i quattro denti e sulla linea mediana della testa fare un'incisione e tagliare la pelle usando le forbici.
Quindi, rimuovere la mascella inferiore, tagliare l'intero naso lungo la fine del palato e posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente cinque litri di PBS ghiacciato. Usando forbici e pinze, rimuovere la carne e i muscoli che aderiscono alle ossa. Quindi, trasferire il naso del topo in una nuova capsula di Petri da 60 millimetri contenente cinque millilitri di PBS ghiacciato e lavare le ossa.
Dopo il secondo lavaggio, trasferire il naso in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Rompere sufficientemente il tessuto e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone digestivo preriscaldato. Fissare il coperchio e posizionare il tubo verticalmente in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e da 120 a 150 RPM per 40 minuti.
Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo RPMI 1640 ghiacciato contenente il 10% di siero bovino fetale per interrompere la digestione. Quindi filtrare il contenuto attraverso un filtro a celle da 70 micron per rimuovere i frammenti solidi. Dopo aver centrifugato il filtrato a 500 G per cinque minuti, scartare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet in mezzo RPMI 1640 ghiacciato.
Per ripetere la centrifugazione come dimostrato in precedenza, risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di mezzo con gradiente del 40%. Quindi, inserire delicatamente un pipet Pasteur sul fondo del tubo per aggiungere 2,5 millilitri di fluido sfumato all'80% di densità. Centrifugare il tubo a 400 G per 15 minuti a temperatura ambiente con la velocità di accelerazione e decelerazione impostata inferiore rispetto alla terza marcia.
Prima di drenare le celle all'interfaccia, rimuovere lo strato superiore di impurità per evitare potenziali contaminazioni. Quindi utilizzare un pipettuccio per drenare lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia del fluido con gradiente di densità del 40% per 80% in un tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di ghiaccio freddo. Lavare le celle con PBS ghiacciato due volte.
Raccogliere le cellule e centrifugarle per cinque minuti a 500 g a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare nel tampone colorante e centrifugare nuovamente per cinque minuti a 500 G.Eliminare il surnatante. Risospendere e incubare le cellule in una soluzione bloccante da 80 microlitri per 30 minuti a quattro gradi Celsius allo stato di oscurità.
Aggiungere un microlitro di colorante vitalità fissabile 520 subito prima di aggiungere 20 microlitri del cocktail di anticorpi anticorpali di colorazione superficiale della diluizione appropriata al campione. Inoltre, impostare gli anticorpi isotipo corrispondenti e la fluorescenza meno uno come controlli negativi. Quindi, lavare le cellule in 500 microlitri di tampone colorante centrifugando a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone colorante. Infine, aggiungere 50 microlitri di perline di conteggio assoluto a vortice alle celle colorate. Agitarli e sottoporli a un'analisi di citometria a flusso.
Un modello murino indotto da ovuli sviluppato per esplorare il ruolo delle cellule linfoidi innate del gruppo due ha mostrato che la frequenza di sfregamento nasale e starnuti nei topi con rinite allergica era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo. Nella mucosa nasale di topi di controllo sani, sono state identificate circa il 2-3% delle cellule negative del lignaggio e CD 45 positive. Il numero assoluto di cellule linfoidi innate del gruppo due variava da 2.000 a 4.000.
L'analisi della citometria a flusso ha indicato un notevole aumento del numero totale di cellule linfoidi innate del gruppo due nella mucosa nasale della rinite allergica rispetto a quella nei topi sani di controllo. Una maggiore espressione di CD 226 è stata rilevata sulle cellule linfoidi innate del gruppo due nei topi con rinite allergica rispetto ai topi di controllo. Inoltre, l'intensità media della fluorescenza di CD 226 era significativamente sovraregolata nei topi AR.
Essere consapevoli dei passaggi di rimozione della carne aderente all'osso nasale, impostando il tasso di accelerazione e decelerazione durante la centrifugazione dei mezzi e il drenaggio delle cellule mononucleate. I due ILC identificati possono essere un supporto per la caratterizzazione della citometria a flusso ordinati per la coltura cellulare o stimolati in vitro, che aiuterebbero a esplorare il rischio specifico di ILC due nel tessuto nasale. Questa procedura di isolamento e caratterizzazione dei linfociti, in particolare nelle cellule linfatiche innate nella mucosa nasale, rende questo protocollo un riferimento preliminare per i ricercatori che esplorano l'ambiente immunitario nasale locale.
