Name: quantification of orofacial phenotypes in xenopus
Uploaded: 2014-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus at JoVE.com

Fondi di start-up di A. Dickinson da VCU sostenuto questo lavoro. Gli autori desiderano ringraziare Dan Nacu per il suo talento artistico nel creare la rappresentazione schematica.

<ol>
	<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate.">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Orofacial+Development+and+Median+Clefts+in+Xenopus+Laevis.">Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis.</a> Anat Rec (Hoboken). , (2014).</li><li>Dickinson, A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Development. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Barnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndrome+Transcription+Factor+is+critical+for+neural+crest+cell+function+in+Xenopus+laevis.">Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis.</a> Mech Dev. 129, 324-338 (2012).</li><li>Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Xenopus+orthologue+of+the+Treacher+Collins+syndrome+(TCOF1)+gene+product.">Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product.</a> Gene. 359, 73-80 (2005).</li><li>Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+2B+receptor+signaling+is+required+for+craniofacial+morphogenesis+and+jaw+joint+formation+in+Xenopus.">Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus.</a> Development. 137, 2927-2937 (2010).</li><li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis.">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li><li>Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+osteogenesis+and+suture+morphology+in+Xenopus+laevis:+a+unique+model+system+for+studying+craniofacial+development.">Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology.">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li><li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts.">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).</li><li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip,+alveolus+and+palate.">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li><li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw:+development+beyond+the+embryo.">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+age-related+changes+of+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).</li><li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes.">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry.">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8.">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li><li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia.">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Nieuwkoop, P. D. a. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).</li><li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+Component+Analysis.">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li><li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Xenopus laevis è diventato uno strumento utile per sezionare i meccanismi di sviluppo di sviluppo oro-facciale sottostante; tuttavia, attualmente non esistono protocolli che descrivono dimensioni e la forma cambiamenti di questa regione in rane. Il metodo qui descritto contribuirà in modo significativo al settore dello sviluppo oro-facciale, consentendo per la più rigorosa quantificazione dei fenotipi orofacciali in Xenopus e altri vertebrati. Il primo aspetto, più critico della corretta esecuzione di questo protocollo è la capacità di misurare le dimensioni del viso e determinare il posizionamento di riferimento sia accurato e riproducibile. A tal fine, è fondamentale che facce embrionali fotografare allo stesso angolo, la direzione e l&#39;ingrandimento. Particolare cura deve essere presa per ottenere misurazioni precise della lunghezza del muso, in quanto è difficile da manipolare embrioni lateralmente e ottenere il posizionamento coerente. Avere una sola persona di eseguire tutte le misurazioni sulle sgiorno ame minimizza questo tipo di errore, massimizzando la riproducibilità dei risultati. Il secondo aspetto più critico di garantire ottimi risultati è la riduzione della variabilità inutili, come le differenze di sviluppo o background genetico. Questo è particolarmente importante quando si valuta la significatività statistica tra i difetti sottili. Embrioni, quindi, devono essere nella stessa fase quando trattati e fotografato. Inoltre, occorre prestare attenzione al fine di garantire i tassi di sviluppo sono equivalenti tra e tra i gruppi di trattamento. Per ridurre questi problemi con la variabilità, assicurarsi che tutti gli embrioni sono dagli stessi genitori e sono abbinati palco all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Anche ridurre fonti esterne di variabilità quali diverse fonti di buffer e volumi, diverso numero di embrioni, e distribuzioni nelle piastre di coltura (per esempio, evitare affollamento). Un passo fondamentale nella valutazione delle variazioni di forma mediante morfometria geometrica è il alignment di punto di riferimento le coordinate via Procuste in forma. Con l&#39;applicazione di questo algoritmo matematico, alcuna informazione circa la dimensione o differenze di rotazione dell&#39;immagine viene rimossa. La matrice di covarianza successivamente generato determina le correlazioni non standardizzati di riferimento coordina tra tutti gli embrioni nel set di dati, su cui multivariata tecniche-statistica, come componente principale o una funzione discriminante analyses- possono essere eseguite. Una analisi delle componenti principali (PCA) riduce di un campione complesso per un insieme ridotto di variabili chiamate componenti principali 26. Rappresenta il primo componente per la maggior varianza all&#39;interno del set di prova, con ogni successiva componenti che rappresentano il resto. Tracciando le prime due componenti uno contro l&#39;altro software morfometrica utilizzando campioni, che sono del cluster più simili tra loro. In questo modo, PCA discrimina gruppi all&#39;interno di un insieme di esempio, e contemporaneamente determinare la variazione al loro interno. In some casi, i gruppi non possono essere chiaramente distinti l&#39;uno dall&#39;altro e si sovrappongono lungo uno o entrambi gli assi. In questo caso, è vantaggioso per tracciare altri componenti (per esempio, PC3) per rivelare caratteristiche sottili attraverso cui i gruppi sono discriminati. Questo è particolarmente rilevante quando la varianza totale è più uniformemente distribuito tra le prime variabili. La funzione discriminante analisi (DFA) di Procuste dati in forma determina se i campioni in un insieme di dati siano effettivamente discriminate in gruppi per le variabili continue che li definiscono. I campioni sono quindi classificati in gruppi prima dell&#39;analisi, e le variabili sono tradotti in componenti chiamati funzioni discriminanti per determinare la relazione statistica tra i gruppi 27. Prima di eseguire questa analisi, è importante indicare il numero di test di permutazione. Questi test di permutazione casuale di dati in modo tale che qualsiasi ipotesi circa la sua distribuzione sono ELIMINAted. Più iterazioni di test di permutazione aumentare la precisione del p-value. Quando visualizzate come una griglia di trasformazione, cambiamenti significativi nella posizione di riferimento tra i gruppi comparati sono visualizzati. Inoltre, il modello di deformazione della griglia rivela dove si verificano cambiamenti di forma. Lo svantaggio di questa analisi è che può essere utilizzato solo per il confronto dei due gruppi. Se ci sono tre o più gruppi in un fascicolo di prova per il confronto, è meglio eseguire un&#39;analisi variata canonica. Questo è simile a un DFA dal fatto di generare un valore p statistica; tuttavia, mostra cambiamenti che si verificano nel corso dell&#39;intero campione impostato in aggiunta a quelle che si verificano tra i singoli gruppi all&#39;interno di tale insieme. Il principale limite di questo protocollo quantificazione oro-facciale è che può essere applicato solo a dati bidimensionali. I nostri obiettivi futuri includono l&#39;utilizzo di TC o la microscopia confocale a sviluppare metodi simili per l&#39;analisi dei dati tridimensionali. D&#39;altronde,lavorare con le immagini bidimensionali è anche uno dei principali punti di forza di questo protocollo. Solo stereoscopes essenziali dotate di telecamere sono necessari per catturare le immagini del viso embrionale. Il OpenWare utilizzato per questa analisi di dati aumenta anche l&#39;accessibilità di questo metodo, riducendo il costo. Inoltre, una conoscenza avanzata delle immagini sofistica, analisi statistiche, o programmazione di computer non è necessario per estrarre risultati significativi e significativi dai dati. In realtà, questa tecnica è attualmente in fase insegnata come parte di un corso di laboratorio di laurea nel reparto VCU della biologia. In tal modo, il protocollo di quantificazione oro-facciale presentato qui è facile da imparare ed applicare in un breve periodo di tempo. Come una rappresentazione video, punti critici, come il posizionamento degli embrioni e la navigazione del software sono evidenziati al fine di garantire il protocollo può essere utilizzato con successo da anche gli studenti inesperti e ricercatori. In sintesi, questo protocollo fornirà una risorsa preziosaper la comunità di ricerca e come strumento didattico.

Tra i tipi più diffusi e devastanti di difetti alla nascita dell&#39;uomo sono quelli che riguardano la bocca e la faccia, come la schisi orofacciali 1. I bambini con strutture orofacciali malformati sottoposti a interventi chirurgici multipli per tutta la vita e lottano con malformazioni del viso, discorso, dell&#39;udito e problemi alimentari. Pertanto, facilitando nuove ricerche nello sviluppo cranio-oro-facciale ed è fondamentale per la prevenzione e il trattamento di questi tipi di difetti alla nascita negli esseri umani. Xenopus laevis è emerso come un nuovo strumento per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale (alcuni esempi includono 2,3,4 -11). Pertanto, un metodo quantitativo per analizzare dimensione e forma cambia durante lo sviluppo della testa e del viso di questa specie potrebbe essere molto potente 3. Qui vi presentiamo un tale metodo; Combinando le misurazioni tradizionali dimensioni con morfometria geometrica adattati da uno studio di Xenopus 12 </sup&gt; e un gran numero di studi che hanno analizzato forma del viso umano 13-15. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di permettere ai ricercatori di quantificare le dimensioni e le forme del viso per distinguere tra diversi fenotipi orofacciali durante lo sviluppo normale e anormale. Questa analisi consentirà una migliore differenziazione tra i difetti cranio-facciali sottili, come quelli derivanti da effetti sinergici di geni e / o fattori ambientali. Inoltre, questo metodo di quantificazione potrebbe anche rivelare anche lieve miglioramento o al salvataggio di un difetto oro-facciale. Questo rende quindi una guida utile per analizzare potenziali terapie. La combinazione di misurazioni facciali e morfometria geometrica che qui presentiamo consente un&#39;analisi statistica più completa di dimensioni e la forma della regione orofacciale di protocolli attuali che in gran parte utilizzano solo uno o l&#39;altro 15-18. Inoltre, presentiamo un modo semplice per valutare sia mediale e piani lateraliil volto senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging tridimensionale utilizzata in studi attuali 13,19. Dimostriamo questo protocollo su Xenopus laevis embrioni trattati con un inibitore del recettore dell&#39;acido retinoico che induce lo sviluppo oro-facciale anormale e una mediana palatoschisi 2,3. La quantificazione delle dimensioni e la forma della regione oro-facciale in questi embrioni ha rivelato cambiamenti nella midface che è analogo per l&#39;uomo con crepacci palatali simili e modelli murini 20,21. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di altri composti sullo sviluppo oro-facciale, quali sostanze naturali, erbicidi, o proteine ​​come i fattori di crescita. Inoltre, le dimensioni e la forma cambia orofacciali derivanti dalla perturbazione di espressione genica tramite la perdita o il guadagno di esperimenti di funzione (utilizzando Morpholinos antisenso o Crispers / Talens) possono essere quantificati con questo protocollo. Infine, abbiamo sviluppato questo metodo SPECIFICHElly per valutare la morfologia Xenopus; tuttavia, è facilmente modificato per l&#39;analisi di qualsiasi vertebrato. Altre applicazioni potrebbero anche includere l&#39;uso di questo protocollo per il confronto di specie strettamente collegate agli studi evolutivi o ecologici. Mentre l&#39;esempio forniamo qui utilizza questo protocollo per descrivere l&#39;analisi della regione oro-facciale, potrebbe facilmente essere modificato per l&#39;analisi di altre regioni, organi o strutture. Questo protocollo quantificazione oro-facciale diventerà una risorsa preziosa per la comunità di ricerca, così come un eccellente strumento didattico per gli studenti universitari come un video dimostrativo.

<table><tbody><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fitted with AxioCamICC1 camera</td></tr><tr><td>Dumont #5 Inox forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, disposable scalpel</td><td>Sklar</td><td>06-2015</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721</td><td></td></tr><tr><td>Standard Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Incubators</td><td>Ectotherm</td><td></td><td>set to 15 &amp;deg;C or 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Premo, or other non-toxic modeling clay</td><td></td><td>in black or white</td></tr><tr><td>Straight teasing needle</td><td>Thermo Scientific</td><td>19010</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Tubing (for needles)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each</td></tr><tr><td>Needle Puller, Model P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td><td>For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.</td></tr><tr><td>Pipettemen</td><td>Gilson</td><td>F144802, F123600, F123602</td><td></td></tr><tr><td>BMS-453</td><td>Tocris</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcom</td><td>353003, 351058</td><td>100 mm diameter and 150 mm in diameter</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus è diventato uno strumento importante per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale e difetti. Un metodo per quantificare lo sviluppo oro-facciale consentirà un&#39;analisi più rigorosa dei fenotipi orofacciali su abrogazione con sostanze che possono geneticamente o molecolarmente manipolare l&#39;espressione genica e la funzione delle proteine. Utilizzando due immagini tridimensionali delle teste embrionali, si misurano le dimensioni-come tradizionali dimensioni come larghezza oro-facciale, altezza e Area-. Inoltre, una misura rotondità della apertura della bocca embrionale è usato per descrivere la forma della bocca. Morfometria geometrica di queste due immagini tridimensionali viene eseguita anche per fornire una visione più sofisticata di cambiamenti nella forma della regione oro-facciale. Luoghi di interesse sono assegnati a punti specifici della regione oro-facciale e le coordinate vengono creati. Una analisi delle componenti principio viene utilizzato per ridurre le coordinate punto di riferimento ai componenti principali che poi discriminano il trattamentogruppi. Questi risultati sono visualizzati sotto forma di un diagramma a dispersione in cui gli individui con forme oro-facciali simili si raggruppano. E &#39;utile anche per eseguire un&#39;analisi funzione discriminante, che mette a confronto statisticamente le posizioni dei punti di riferimento tra i due gruppi di trattamento. Questa analisi viene visualizzato su una griglia di trasformazione in cui i cambiamenti della posizione di riferimento sono visti come vettori. Una griglia viene sovrapposta questi vettori in modo che un modello di deformazione viene visualizzato per mostrare dove posizioni significative punto di riferimento sono cambiati. Cambia forma per l&#39;analisi della funzione discriminante si basano su una misura statistica, e quindi possono essere valutati da un p-value. Questa analisi è semplice e accessibile, che richiede solo uno stereoscopio e software freeware, e quindi sarà una risorsa per la ricerca e l&#39;insegnamento prezioso.

Qui, un&#39;analisi quantitativa di dimensioni oro-facciale e la forma è stata dimostrata per confrontare embrioni trattati con un inibitore del recettore dell&#39;acido retinoico (RAR inibitore) per controlli non trattati. Gli embrioni sono stati trattati con una concentrazione 1 mM di questo inibitore della sostanza chimica da fase 24 a 30 (26-35 HPF), sbiaditi, e fissati allo stadio 42 (82 HPF). Sono stati poi elaborati ed analizzati come descritto nel protocollo. I risultati sono dati originali, ma in linea con le osservazioni in precedenti pubblicazioni 2,3. Embrioni controllo sono stati trattati con il veicolo, DMSO, e sviluppati normalmente (Figura 7Ai, ii). Gli embrioni trattati con una concentrazione 1 mM di inibitore RAR hanno mostrato lieve restringimento del viso, anomalie degli occhi, e una bocca embrionale malformato apertura che aveva la forma più triangolare (Figura 7Aiii, iv). In primo luogo, le dimensioni tradizionali orofacciali sono stati misurati e sono riassunte nella Figura 7B. S<html> significato tatistical è stata determinata eseguendo test t di Student assumendo varianza disuguale tra inibitori embrioni trattati e controlli per ogni misurazione. Abbiamo scoperto che sia la lunghezza del muso e larghezza del dente erano significativamente diminuiti in RAR inibitori embrioni trattati rispetto ai controlli (p-value = 0,0062 e 0,0058, rispettivamente; Figura 7Bi, ii). Mentre altezza viso e la bocca rotondità sono state aumentate in modo significativo (p-value = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), larghezza della bocca era significativamente diminuito (p-value = 2,5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .La risultati hanno mostrato alcuna differenza significativa nella zona oro-facciale globale tra i due gruppi (p = 0,3754 a valore; Figura 7Bvi). Questi dati mostrano che la perdita di segnale acido retinoico in un momento specifico in risultati di sviluppo in un muso più corto, leggero restringimento della regione midface, e malformazioni della apertura della bocca embrionale. nt &quot;&gt; Per fornire una visione sofisticata dei cambiamenti di forma della regione oro-facciale embrionale in risposta a segnali di riduzione dell&#39;acido retinoico, abbiamo prossima utilizzammo morfometrica geometrica analisi. Dopo l&#39;identificazione e l&#39;allineamento monumenti orofacciali utilizzando il software di analisi morfometrica, ci ha poi esaminato la varianza all&#39;interno di ogni gruppo tramite analisi delle componenti principali (PCA). Quando le prime due componenti principali sono state tracciate uno contro l&#39;altro, embrioni inibitore RAR trattati erano chiaramente distinti dai controlli lungo l&#39;asse PC1 (Figura 7c). Questo test ha anche mostrato i valori anomali in l&#39;impostazione del campione illustrato da due embrioni inibitori trattato che non cluster con il resto del gruppo (Figura 7C, frecce). Quindi, le differenze statistiche nella forma della regione oro-facciale tra RAR inibitori trattati gli embrioni ei controlli sono stati valutati e visualizzati eseguendo una funzione discriminante analisi (DFA). Il Procuste distanza bra i due gruppi era significativamente differente (distanza = 0,2665, p-value &lt;0,0001, Figura 7D), che indica un cambiamento di forma oro-facciale, quando la segnalazione acido retinoico è interrotto. Infatti, drammatici cambiamenti nella posizione dei punti di riferimento laterali della regione orofacciale indicano un restringimento della forma del viso corrispondente all&#39;altezza di inibitori embrioni trattati (Figura 7D). Inoltre, il leggero spostamento verso l&#39;esterno in posizione dei punti di riferimento nasali (Figura 7D, frecce) rivela l&#39;anomalia in posizione narice in questi embrioni che è coerente con la diminuzione conseguenza del muso. I cambiamenti di punti di riferimento che definiscono i bordi dell&#39;apertura della bocca cambiamenti di posizione mostrano che riflettono la formazione di una bocca a forma triangolare di apertura che è coerente con la fessura mediana riportato nei nostri precedenti studi 2,3. Oltre a turni vettore, il pattern deformazione della griglia trasformazione illustra anche cambiamenti di forma della oregione ofacial. Orditura nella regione midface è coerente con l&#39;ipoplasia midface e restringimento del viso globale visto in embrioni con segnali dell&#39;acido retinoico sono diminuiti (Figura 7D). I risultati dell&#39;analisi funzione discriminante (DFA) mostrano cambiamenti di forma che sono stati in linea con la nostra analisi qualitativa, così come rivelano alcune modifiche che non sono stati adeguatamente rilevati dalle sole misure tradizionali dimensioni. Ad esempio, mentre la zona oro-facciale non era significativamente differente tra controlli e inibitore trattata embrioni (Figura 7Bvi), la griglia trasformazione DFA rivelato cambiamenti drammatici in questa regione coerenti con il restringimento facciale visto in inibitori embrioni trattati (Figura 7A, D). Inoltre, la deformazione del modello e punto di riferimento turni di apertura della bocca, insieme con il cambiamento significativo che abbiamo visto in bocca rotondità, illustrano la malformazione della bocca di apertura in forma inibitore trattati Embryos. In sintesi, una combinazione di misurazioni tradizionali di dimensioni facciali e analisi morfometrica geometrica illustra i cambiamenti di forma e dimensioni della regione oro-facciale quando i segnali acido retinoico sono interrotti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Materiali richiesti. (A) Strumenti per l&#39;analisi dei dati. (I) 24-pozzetti, (ii) di serie pipetta usa e getta, (iii) Dumont # 5 pinze Inox, (iv) l&#39;argilla-foderato capsula di Petri, (v) prendere in giro dritto ago, (vi) strumento pipetta di vetro, (vii ) sterili, bisturi monouso. B) Preparazione del recipiente di terracotta rivestita (. (I) Un ago di presa in giro dritto viene utilizzata per tracciare linee orizzontali nella creta. (Ii) Uno strumento pipetta di vetro è usato per fare depressioni circolari lungo ogni riga. (Iii) Il piatto è pieno di PBT per l&#39;imaging. page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Fecondazione in vitro e la cultura di uova di Xenopus. (A) A seguito di iniezione di HCG, adulto Xenopus laevis femmine sono indotte a deporre le uova. (B) Le uova sono raccolte in MBS alto sale, fecondati con testicoli estratti da un maschio, e colto con metodi standard. (C) Gli embrioni vengono trasferiti in un piatto da 24 pozzetti contenenti 0.1x MBS utilizzando uno standard, monouso pipetta di trasferimento. (D) una pipetta calibrata artificiale viene utilizzato per misurare 1 ml in un pozzo vuoto, e un marcatore viene utilizzato per delimitare questo livello all&#39;esterno di tutti i pozzetti contenenti embrioni (nel riquadro). 0.1x MBS viene aggiunto o tolto in modo che sia a livello con questo marchio. highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Preparazione di teste di embrioni per l&#39;imaging. (A) Diagramma delle due incisioni necessari per rimuovere le teste, linee nere continue. Barra della scala = 400 micron. (B) La prima incisione è fatta alla fine posteriore dell&#39;intestino per rimuovere la coda e rilascio della pressione dal bisturi. Scala bar = 400 micron. (C) La seconda incisione è fatta alla fine anteriore del budello, vicino al cuore, di tagliare completamente la testa. Barra della scala = 400 micron. (D) viste frontali di fila di teste di embrioni posizionati in argilla. Barra della scala = 650 micron. (E) vista laterale fila di posizione teste embrionali in argilla. Scala bar = 500 micron CG: ghiandola del cemento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Le misure di formato tradizionale di dimensioni orofacciali. (A) </strong&gt; larghezza Viso. Le frecce indicano i punti in cui la parte ventrale dell&#39;occhio incontra la periferia della faccia. La linea rossa è la larghezza del dente, misurata come la distanza tra questi punti. Linee Barra di scala = 210 micron. (B) Altezza faccia. Bianchi sono guide disegnate prima della misura sul bordo dorsale degli occhi e il bordo dorsale della ghiandola del cemento. Linea rossa è l&#39;altezza faccia, misurata come la distanza tra questi due guide sulla linea mediana della faccia. Barra di scala = 210 micron. (C) zona orofacciale. Righe bianche sono guide disegnati prima della misura. (A) il punto dove la guida inferiore incontra il bordo ventrale dell&#39;occhio sinistro. La linea rossa indica il tracciato intorno all&#39;occhio sinistro. (B) Il punto in cui il bordo dorsale dell&#39;occhio incontra la guida superiore. Linea blu mostra il confine dorsale zona oro-facciale, tracciata lungo la guida superiore al bordo dorsale degli occhi. (C) il punto dove la guida superiore incontra destra periferia facciale. GREEN LINE spettacoliil tracciato attorno l&#39;occhio destro. (D) Il punto in cui il bordo ventrale dell&#39;occhio destro incontra la guida inferiore. Linea gialla mostra di confine ventrale zona oro-facciale, tracciata lungo la guida in basso sul bordo dorsale della ghiandola del cemento. Barra di scala = 210 micron. (D) Lunghezza del muso. La linea bianca è il bordo anteriore dell&#39;occhio e viene disegnato come una guida prima della misura. La linea rossa è la lunghezza muso, misurata da questa linea al punto in cui il bordo dorsale della ghiandola cemento incontra la periferia laterale del volto. Barra di scala = 300 micron. Larghezza (E) Bocca. Le frecce sono i punti in cui si incontrano dorsale e ventrale labbra. La linea rossa è la larghezza della bocca, misurata come la distanza tra questi due punti. Barra di scala = 200 micron. (F) Bocca rotondità. Il perimetro dell&#39;apertura della bocca è tracciata e visualizzata in rosso. CG: ghiandola del cemento. Barra di scala = 200 micron. <img alt = &quot;Figura 5&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 5. Acquisizione di punti di riferimento e preliminari per l&#39;analisi morfometrica geometrica. (A) Utilizzo di software di fotoritocco e di un foglio di calcolo di inserire punti di riferimento e le coordinate di cattura. (I) croci multicolori sono i punti di riferimento posti sulla immagine utilizzando lo strumento Aggiungi punti in ImageJ per rappresentare la forma della regione oro-facciale. (Ii) dati di interesse viene visualizzato utilizzando lo strumento di visualizzazione dei risultati. (Iii) dati Landmark viene copiato e incollato in un foglio di calcolo. Sopra la seconda colonna è un&#39;intestazione che identifica il numero di punti di riferimento e indicata con &quot;LM = 24&quot; (riquadro rosso). Sotto la seconda colonna di dati, il campione viene assegnato un nome univoco e indicata con &quot;ID = CON1&quot; (freccia rossa). Questo si ripete per tutte le immagini in un fascicolo di prova ed i dati vengono salvati come file di testo. (B) l&#39;analisi dei dati preliminari in un morfometrica softw geometricasono programma. (I) Il file di testo creato dal software di fotoritocco è importata nel programma morfometriche, MorphoJ, come un file TPS. File è indicato dalla freccia rossa. (Ii) Landmark quote di coordinate si allineato Procuste in forma con gli assi principali. Freccia rossa indica l&#39;esecuzione di allineamento. (Iii) Una matrice di covarianza di Procuste in forma punti di riferimento viene generato nel menu Preliminari. (Iv) Un file di classificatore viene creato in un foglio di calcolo. Colonna A e B sono date intestazioni &quot;ID&quot; e &quot;trattamento&quot;, rispettivamente. Dato a ogni campione nella raccolta dei dati di riferimento sono di ingresso del ID nella colonna A, e il gruppo di trattamento a cui appartiene ogni campione viene inserito nella colonna B. (v) Il file di classificatore viene importato nel programma morfometrica come un insieme variabile di classificatore e Matched dal Identificazione per il set di dati selezionato. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande</a>questa figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Analisi statistica nel software morfometrica. (A) Analisi delle Componenti Principali (PCA) (i) PCA è selezionata dalla scheda Variation. (Ii) Le prime due componenti principali punti di riferimento di Procuste vengono visualizzati come un grafico a dispersione nella scheda punteggi PC. (Iii) un menu pop-up viene portato nello spazio grafico. Questo menu viene utilizzato per modificare i componenti principali vengono riportati contro l&#39;altro (freccia rossa) e per colorare i punti dati (evidenziati in blu). (Iv) I punti dati sono colorati a seconda delle variabili classificatore nel menu di scelta rapida. (V) Percentuale della varianza catturata da ciascun componente principale viene visualizzato nella scheda Risultati. (B) Funzione Analisi discriminante (DFA) (i) DFA viene selezionato dalla scheda di confronto. (ii) Il set di dati di Procuste coordinate è selezionato per DFA, e classificatori precedentemente caricati vengono scelti per il raggruppamento. I gruppi desiderati da confrontare sono scelti e vengono eseguiti test di permutazione. (Iii) i risultati DFA vengono visualizzati come una mappa vettoriale nella scheda Forma differenza. Un menu a comparsa nello spazio di trama può essere utilizzato per orientare correttamente l&#39;immagine. (Iv) Selezionando la scheda Set Fattore di scala nel menu di scelta rapida, il segno del fattore di scala può essere cambiata. (V) La mappa vettoriale viene modificato in una griglia di trasformazione con il numero desiderato di linee della griglia scegliendo Cambiare il tipo di grafico nel menu di scelta rapida della mappa vettoriale. (Vi) Il Mahalanobis e Procuste distanze e relativi p-value vengono visualizzati nella scheda Risultati. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <imgalt = &quot;Figura 7&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 7. Analisi Orofacial di controllo e RAR inibito trattati embrioni. (A) (I, II) Immagini rappresentative dei controlli. Bar scale = 270 micron. (Iii, iv) embrioni trattati con una concentrazione 1 mM di inibitore RAR, BMS-453. Bar scale = 260 micron. (I, iii) FRONTALE vista. Apertura della bocca è descritto nella puntini rossi. (ii, iv) delle viste laterali. cg:. ghiandola cemento (B) dimensioni orofacciali tradizionali di controllo (nero) e l&#39;inibitore trattati (blu) gli embrioni. (I) la lunghezza del muso, in mm (ii) larghezza del dente, in mm (iii) l&#39;altezza faccia, in mm (iv) larghezza della bocca, in mm (v) la bocca morbidezza, un numero di unità-meno determinata ImageJ usando l&#39;equazione: (4 &#8197; × &#8197; [Area]) / (π &#8197; × &#8197; [Asse principale] 2). (Vi) zona Orofacial, in mm <sup&gt; 2. Gli asterischi indicano significatività come determinato da T-test di Student assumendo varianza disuguale. α &lt;0.05. (C) Analisi delle Componenti Principali. I controlli sono in trattamento con inibitori embrioni in bianco e RAR sono in blu. Frecce nere indicano valori anomali. PC1 = 73.63%, PC2 = 9,56%. (D) Analisi discriminante visualizzando la distanza Procuste e p-value, oltre a una griglia trasformazione. Fine ristretta cerchia di vettore è posizione di punto di riferimento a inibitori RAR embrioni trattati. L&#39;estremità della linea del vettore è la posizione di riferimento nei controlli. Frecce nere indicano cambiamento di punti di riferimento nasali. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus at JoVE.com

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

È stato sviluppato un metodo per quantificare l&#39;entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K Views.  Virginia Commonwealth University.  È stato sviluppato un metodo per quantificare l'entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti. 

Video: Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Neuroscienze

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from harmful ultraviolet radiations. Perturbations in melanocyte functioning lead to pigmentary disorders such as piebaldism, albinism, vitiligo, melasma, and melanoma. Zebrafish is an excellent model system to understand melanocyte functions. The presence of conspicuous pigmented melanocytes, ease of genetic manipulation, and availability of transgenic fluorescent lines facilitate the study of pigmentation. This study employs the use of wild-type and transgenic zebrafish lines that drive green fluorescent protein (GFP) expression under mitfa and tyrp1 promoters that mark various stages of melanocytes. 
Morpholino-based silencing of candidate genes is achieved to evaluate the phenotypic outcome on larval pigmentation and is applicable to screen for regulators of pigmentation. This protocol demonstrates the method from microinjection to imaging and fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based dissection of phenotypes using two candidate genes, carbonic anhydrase 14 (Ca14) and a histone variant (H2afv), to comprehensively assess the pigmentation outcome. Further, this protocol demonstrates segregating candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators that selectively alter melanocyte numbers and melanin content per cell, respectively.

Regulators of melanocyte functions govern visible differences in the pigmentation outcome. Deciphering the molecular function of the candidate pigmentation gene poses a challenge. Herein, we demonstrate the use of a zebrafish model system to identify candidates and classify them into regulators of melanin content and melanocyte number.

Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Quantificazione di orofacciale fenotipi in

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

La valutazione primaria neurogenesi in

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Trapianti viso a

Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra