Questo metodo può essere utile per rispondere a domande chiave in campi di neurobiologia come come funzionano i terminali presnaptici in vivo. Il vantaggio principale di questo insieme di tecniche è che mostriamo approcci gratuiti per valutare la funzione delle vie olfattive usando girini Xenopus come modello animale. A dimostrare questa procedura saranno io, Beatrice Terni, e Paolo Pacciolla.
Iniziare la procedura di trasezione bagnando due pezzi di carta filtrante qualitativa di cellulosa in soluzione anestetica 0,02%MS2 22 e posizionandoli nell'ambito di sezionatura. Quindi scegli un girino dal serbatoio e immergelo in un piatto di soluzione anestetica. Il girino dovrebbe smettere di nuotare entro due o quattro minuti.
Verificare la corretta anestetizzazione per assenza di una reazione agli stimoli meccanici applicati a livello della coda utilizzando una pinzetta. Posizionare il girino anestetizzato sulla carta filtrante sotto l'ambito. Posizionare l'animale con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che le strutture cerebrali possano essere visualizzate.
Per esperimenti comportamentali, usa le forbici veni per traslimare entrambi i nervi per sopprimere tutte le informazioni odoranti che arrivano al bulbo olfattivo. Caricare una pipetta di vetro poled con due microlitri di soluzione di destrorina verde calcio e posizionarla nel microiniettore. Posizionare un girino anestetizzato sotto il microscopio sezionato su carta da filtro, quindi spostare la punta della pipetta nella cavità principale della capsula nasale e fornire da 0,15 a 0,3 microlitri del colorante.
Lasciare il girino in posizione per due o tre minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, gocciolare la soluzione 0,02%MS2 22 sulle parti più coddle dell'animale per evitare l'essiccazione. Trasferire l'animale nel serbatoio di recupero in cui il girino dovrebbe recuperare il normale nuoto entro circa 10 minuti.
Osservare la florescenza a livello dello strato glomerulare del bulbo olfattivo il giorno dopo l'iniezione. Preparare un girino anestetizzato per l'imaging rimuovendo prima la pelle sopra il bulbo olfattivo. Utilizzare le forbici veni per fare un'incisione laterale sulla pelle del girino sul bordo del sistema nervoso centrale a livello del bulbo olfattivo.
Evitare di estendere il taglio allo tectum, che può essere facilmente identificato dalla posizione del nervo ottico. Mantenere l'animale umido applicando gocce di soluzione 0,02%MS2 22 utilizzando una pipetta Pasteur, quindi pizzicare la pelle tagliata usando una pinzetta e tirarla sul sistema nervoso. Verificare la corretta rimozione per assenza di melanociti sopra il bulbo olfattivo.
Posizionare il girino nel pozzo del piatto rivestito di guardia cellulare. Posizionare uno scivolo di copertura in vetro rivestito con grasso sottovuoto elevato per coprire la parte superiore dello tectum fino all'estremità della coda. Assicurarsi che la lampadina olfattiva e i placodici rimangano esposti al mezzo extracellulare.
Riempire il piatto pitri con la soluzione di Xenopus Ringer contenente 100 tubocurarine micromolare per prevenire contrazioni muscolari. Posizionare il piatto tenendo il girino al microscopio verticale. Collegare il serbatoio contenente la soluzione di Xenopus Ringer con il piatto utilizzando tubi in polietilene per una profusione continua della soluzione di Xenopus Ringer.
Inizia a perfondere la soluzione di Xenopus Ringer. Mantenere costante il livello della soluzione nel piatto durante l'esperimento. Valutare continuamente la vitalità del girino osservando la circolazione sanguigna attraverso i vasi.
Inizia l'imaging dal vivo usando un obiettivo a basso ingrandimento per visualizzare il girino. Spostare l'asse del micromanipolatore per posizionare il capillare fornendo la soluzione di odorante sulla parte superiore di una capsula nasale, formando un angolo di 90 gradi con il nervo olfattivo. Trova il bulbo olfattivo situato ipsilateralmente nella capsula nasale.
Passa a un obiettivo di acqua ad alto ingrandimento con una lunga distanza di lavoro. Controllare l'emissione di florescence da parte delle strutture I.Glomerular dovrebbe essere ovvio. Iniziare con pipettando 20 millilitri di soluzione di amminoacidi freschi in un serbatoio elevato.
Quindi prendi sei girini privi di cibo dal loro serbatoio di alloggio e posizionali in due litri di acqua pulita del girino per ridurre al minimo l'esposizione agli odori. Posizionare un piatto da sei po' modificato su un transilluminatore a LED bianco. Riempire ogni bene con 10 millilitri di acqua girino.
Posizionare un girino per pozzo, quindi lasciare riposare per almeno tre minuti. Avvia l'acquisizione di immagini e acquisisci filmati che contengono periodi basali, stimolanti e di recupero. Una risposta attraente può essere rilevata come un movimento verso l'ugello fornendo la soluzione di amminoacidi.
Riportare gli animali nel loro serbatoio dopo l'imaging. Tracciare le posizioni della testa del girino all'interno di un'area di 35 millimetri per 35 millimetri, o la dimensione equivalente in pixel, consente un'analisi quantitativa del comportamento guidato da olfattive. La linea tratteggiata rappresenta l'area prossimale all'ingresso della soluzione di odore.
I singoli appezzamenti di movimenti del girino sono costruiti utilizzando le coordinate X Y ottenute dall'analisi delle immagini. Le trame di motilità estratte devono riprodurre fedelmente le immagini video. Una regione di interesse di 8,75 millimetri di raggio centrata sull'ingresso della soluzione viene utilizzata per classificare la vicinanza degli animali alla fonte di odoro.
Più tempo trascorso nelle vicinanze dell'ugello dell'odoro indica tropismo positivo. Il tempo trascorso dai girini vicino all'ugello durante periodi definiti, ad esempio intervalli di 15 secondi, consente l'identificazione della capacità di rilevare soluzioni di amminoacidi. Il comportamento complessivo di una popolazione di girini può essere ottenuto tracciando la distribuzione dei singoli dati.
Il tropismo positivo può essere rilevato quando la soluzione di amminoacidi viene preparata a un millimolare o 160 micromolare. Gli animali non rispondono all'applicazione dell'acqua. Seguendo questa procedura, altri metodi come le tecniche istologiche o l'elettrofisiologia, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come l'alterazione delle proprietà sinaptiche dopo la lesione.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare l'elaborazione delle informazioni olfattive nel girino di Xenopus.
