Name: quantification of orofacial phenotypes in xenopus
Uploaded: 2014-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus at JoVE.com

Start-up-Gelder an A. Dickinson von VCU unterstützt diese Arbeit. Die Autoren möchten sich Dan Nacu für sein künstlerisches Talent bei der Erstellung der schematischen Darstellung zu bestätigen.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Xenopus laevis hat sich zu einem nützlichen Werkzeug für Sezieren der Entwicklungsmechanismen zugrunde liegenden orofazialen Entwicklung; Allerdings gibt es noch keine Protokolle Größe und Form Veränderungen dieser Region bei Fröschen beschreibt. Die hier beschriebene Methode wird erheblich auf das Gebiet der orofazialen Entwicklung, indem sie für eine strengere Quantifizierung der orofazialen Phänotypen in Xenopus und anderen Wirbeltieren beitragen. Die erste, kritischer Aspekt dieses Protokoll nicht richtig ausgeführt ist die Fähigkeit, Gesichtsabmessungen sowohl genau und reproduzierbar zu messen und orientierungs Platzierung. Zu diesem Zweck ist es entscheidend, dass embryonale Flächen unter dem gleichen Winkel, Ausrichtung und Vergrößerung fotografiert werden. Muss insbesondere darauf geachtet werden, präzise Messungen der Schnauze Länge zu erhalten, da es schwierig ist, Embryonen seitlich manipulieren und erzielen konsistente Platzierung. Mit einer einzelnen Person führen alle Messungen an den same Tag minimiert diese Art von Fehler, bei gleichzeitiger Maximierung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Der zweite kritische Punkt der Gewährleistung einer guten Ergebnisse ist die Reduzierung unnötiger Variabilität, wie Entwicklungsdifferenzen oder genetischen Hintergrund. Dies ist besonders wichtig bei der Beurteilung statistische Signifikanz zwischen subtilen Defekten. Embryonen, daher müssen auf der gleichen Stufe, wenn behandelt und fotografiert. Außerdem sollte darauf geachtet werden, Entwicklungsgeschwindigkeiten sind äquivalent zwischen und unter den Behandlungsgruppen. Um solche Probleme mit Variabilität zu verringern, um sicherzustellen, dass alle Embryonen werden aus den gleichen Eltern und Stufe zu Beginn des Experiments abgestimmt. Auch eine Verringerung der Variabilität externen Quellen wie verschiedene Puffer Quellen und Volumina, eine unterschiedliche Anzahl von Embryos und Verteilungen in den Kulturschalen (zum Beispiel zu verhindern crowding). Ein wichtiger Schritt bei der Beurteilung der Formänderungen durch geometrische Morphometrie ist die alignment der Wahrzeichen koordiniert über Procrustes fit. Durch Anwendung dieser mathematischen Algorithmus wird jede Information über Größe oder Unterschiede in der Drehung des Bildes entfernt. Die nachfolgend erzeugten Kovarianzmatrix bestimmt die unstandardized Korrelationen der Wahrzeichen koordiniert unter allen Embryonen im Datensatz, auf dem multivariaten statistischen techniques- wie Hauptkomponenten oder Diskriminanzfunktion analyses- durchgeführt werden kann. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) reduziert einen komplexen Probe auf einen kleineren Satz von Variablen aufgerufen Hauptkomponenten 26. Die erste Komponente berücksichtigt die meisten Varianz innerhalb der Stichprobe, mit jeder weiteren Komponente Buchhaltung für den Rest. Durch Auftragen der ersten beiden Komponenten gegeneinander mit morphometrischen Software, Mustern ähnlichsten Cluster zusammen. Auf diese Weise unterscheidet PCA-Gruppen innerhalb eines Probensatzes, während gleichzeitig die Bestimmung der Veränderung in ihnen. In some Fällen kann Gruppen nicht klar voneinander unterschieden werden und überlappen, entlang einer oder beiden Achsen. In diesem Fall ist es vorteilhaft, zu anderen Komponenten, um subtile Merkmale, an denen Gruppen diskriminiert werden enthüllen Grundstück (zB PC3). Dies ist besonders relevant, wenn die Gesamtvarianz gleichmäßiger zwischen den ersten mehreren Variablen verteilt. Die Diskriminanzfunktion Analyse (DFA) von Procrustes fit Daten bestimmt, ob Proben in einem Datensatz werden effektiv in Gruppen durch die kontinuierlichen Variablen, die sie definieren, diskriminiert. Proben werden daher in Gruppen vor der Analyse klassifiziert und die Variablen in Komponenten genannt diskriminieren Funktionen, die statistische Beziehung zwischen den Gruppen 27 bestimmen übersetzt. Vor dem Ausführen dieser Analyse ist es wichtig, die Anzahl der Permutationen Tests zeigen. Diese Permutationstests zufällig die Daten, so dass alle Annahmen über deren Verteilung eliminated. Mehr Permutationstest Iterationen erhöhen die Genauigkeit der p-Wert. Wenn sie als Transformationsnetz visualisiert, wobei wesentliche Änderungen in Markierungsposition zwischen den Gruppen verglichen werden angezeigt. Ferner ist die Schärmuster des Gitters zeigt, wo Formänderungen auftreten. Der Nachteil dieser Analyse ist, dass sie nur für den Vergleich der beiden Gruppen verwendet werden. Wenn es drei oder mehr Gruppen in einem Probensatz zum Vergleich, ist es besser, eine kanonische Zufallsvariablen-Analyse durchzuführen. Dies ist ähnlich zu einem DFA, daß es einen statistischen p-Wert erzeugt; es weist aber verändert sich über die gesamte Probe zusätzlich zu den zwischen den einzelnen Gruppen vorkommenden innerhalb dieser Satzes auftritt. Die Hauptbeschränkung dieses orofacial Quantifizierungsprotokoll ist, dass sie nur auf zweidimensionale Daten angewendet werden. Unsere Ziele für die Zukunft sind der Einsatz von CT-Scan oder die konfokale Mikroskopie, ähnliche Methoden für die Analyse von dreidimensionalen Daten zu entwickeln. Andererseits,Arbeiten mit zweidimensionalen Bildern ist auch eine der Stärken dieses Protokolls. Nur Grund Stereoskopen mit Kameras ausgestattet sind, für die Aufnahmen des embryonalen Gesicht benötigt. Die für diese Datenanalyse verwendet Open erhöht auch die Zugänglichkeit dieser Methode, während die Verringerung der Kosten. Ferner ist eine fortgeschrittene Kenntnisse sophistical Bildgebung, statistischen Analysen und Computerprogrammierung ist nicht erforderlich, um aussagekräftige und signifikante Ergebnisse aus den Daten zu extrahieren. In der Tat, diese Technik wird derzeit im Rahmen einer Bachelor-Praktikum in der VCU Fachbereich Biologie unterrichtet. Somit ist die hier vorgestellte orofacial Quantifizierungsprotokoll leicht zu erlernen und anzuwenden in einer kurzen Zeitperiode. Als Videodarstellung werden kritische Schritte wie Positionierung Embryonen und die Navigation in der Software hervorgehoben, um das Protokoll erfolgreich durch selbst ungeübte Studenten und Forschern genutzt werden sicherzustellen. Zusammenfassend wird dieses Protokoll eine wertvolle Ressource zur Verfügung stellenfür die Forschungsgemeinschaft und als Lehrmittel.

Unter den am weitesten verbreiteten und auch schwerwiegendsten Form der menschlichen Geburtsfehler sind diejenigen den Mund und Gesicht, zu beeinflussen, wie Gesichtsspalten ein. Kinder mit missgebildeten orofazialen Strukturen durchlaufen mehrere Operationen über deren gesamte Lebensdauer und Kampf mit Gesichtsanomalien, Sprache, Gehör und Essstörungen. Deshalb werden neue Forschung in cranio und orofazialen Entwicklung erleichtert ist ausschlaggebend für die Vorbeugung und Behandlung dieser Art von Geburtsschäden beim Menschen. Xenopus laevis wurde als neues Werkzeug zum Präparieren der Mechanismen, die kraniofazialen Entwicklung entstanden (einige Beispiele sind 2,3,4 -11). Daher könnte eine quantitative Methode, um Größe und Form Veränderungen während der Entwicklung des Kopfes und Gesicht dieser Art zu analysieren sehr leistungsfähige 3 sein. Hier stellen wir ein solches Verfahren; Kombination von traditionellen Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie von einer Xenopus-Studie 12 angepasst </sup&gt; und eine Fülle von Studien zur Analyse menschlichen Gesichtsform 13-15. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Forschern ermöglichen, Gesichts Größen und Formen zu quantifizieren, um zwischen verschiedenen orofazialen Phänotypen während der normalen und abnormalen Entwicklung unterscheiden. Diese Analyse wird zur besseren Unterscheidung zwischen subtilen kraniofazialen Defekten wie solche aus synergistische Wirkung von Genen und / oder Umweltfaktoren. Darüber hinaus könnte diese Quantifizierungsmethode auch zeigen sogar leichte Verbesserung oder Rettung eines orofazialen Defekt. Dies macht es zu einem nützlichen Leitfaden bei der Analyse potenzielle Therapeutika daher. Die Kombination aus Gesichts Messungen und geometrische Morphometrie, die wir hier präsentieren, ermöglicht eine umfassende statistische Analyse der Größe und Form des orofazialen Region als aktuellen Protokolle, die weitgehend nutzen nur eine oder die andere von 15 bis 18. Weiterhin stellen wir eine einfache Möglichkeit, sowohl den medialen und lateralen Ebenen beurteilendas Gesicht ohne aufwändige dreidimensionale bildgebende Geräte in aktuellen Studien 13,19 verwendet erfordern. Wir zeigen, dass dieses Protokoll über Xenopus laevis Embryonen mit einer Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor, abnormen orofazialen Entwicklung und eine mediane Gaumenspalte 2,3 induziert behandelt. Quantifizierung der Abmessungen und der Form des orofacial Region in diesen Embryonen wurde Veränderungen im Mittelgesicht, die analog zu den Menschen mit ähnlichen Gaumenspalten und Mausmodellen 20,21 ist offenbart. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von anderen Verbindungen auf orofacial Entwicklung, wie natürliche Stoffe, Herbizide, oder Proteinen, wie Wachstumsfaktoren zu beurteilen. Ferner orofazialen Größe und Form Veränderungen aus Störung der Genexpression über Verlust oder Gewinn von Funktionsversuchen (mit Antisense-Morpholinos oder Crispers / Talens) kann auch mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Schließlich diese Methode specifica entwickelten wirlly zu Xenopus Morphologie zu bewerten; es ist jedoch einfach für die Analyse von jedem Wirbeltier modifiziert. Andere Anwendungen könnten auch unter Verwendung dieses Protokolls für den Vergleich nahe verwandter Arten für evolutionäre oder ökologische Studien. Während das Beispiel stellen wir hier nutzt dieses Protokoll, um Analyse der orofazialen Region zu beschreiben, könnte es leicht für die Analyse von anderen Regionen, Organe oder Strukturen verändert werden. Diese orofazialen Quantifizierung Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Forschungsgemeinschaft sowie ein ausgezeichnetes Lehrmittel für Studenten als Video-Demonstration geworden.

<table><tbody><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>fitted with AxioCamICC1 camera</td></tr><tr><td>Dumont #5 Inox forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, disposable scalpel</td><td>Sklar</td><td>06-2015</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721</td><td></td></tr><tr><td>Standard Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Incubators</td><td>Ectotherm</td><td></td><td>set to 15 &amp;deg;C or 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Premo, or other non-toxic modeling clay</td><td></td><td>in black or white</td></tr><tr><td>Straight teasing needle</td><td>Thermo Scientific</td><td>19010</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Tubing (for needles)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each</td></tr><tr><td>Needle Puller, Model P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td><td>For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.</td></tr><tr><td>Pipettemen</td><td>Gilson</td><td>F144802, F123600, F123602</td><td></td></tr><tr><td>BMS-453</td><td>Tocris</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcom</td><td>353003, 351058</td><td>100 mm diameter and 150 mm in diameter</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus ist zu einem wichtigen Werkzeug für sezieren die Mechanismen für kraniofaziale Entwicklung und Defekten. Ein Verfahren zur orofazialen Entwicklung quantifizieren für strengere Analyse der orofazialen Phänotypen auf Aufhebung mit Substanzen, die die Genexpression oder Proteinfunktion genetisch oder molekular manipulieren lassen. Mit zweidimensionalen Bilder der embryonalen Köpfe werden traditionelle Größendimensionen-wie orofazialen Breite, Höhe und Raum- gemessen. Zusätzlich ist ein Maß für die Rundheit embryonalen Mundöffnung verwendet, um die Form des Mundes zu beschreiben. Geometrische Morphometrie dieser zweidimensionalen Bildern wird auch durchgeführt, um eine anspruchsvollere Ansicht von Änderungen in der Form des orofacial Region. Wahrzeichen sind an bestimmten Stellen im orofazialen Region zugeordnet und Koordinaten erstellt. Eine Hauptkomponentenanalyse wird verwendet, um Wahrzeichen Koordinaten Hauptkomponenten, die dann zu unterscheiden, die Behandlung zu verringernGruppen. Diese Ergebnisse werden als Streudiagramm, in dem Personen mit ähnlichen orofazialen Formen zusammenballen angezeigt. Es ist auch nützlich, eine Diskriminanzanalyse, die die Positionen der Landmarken zwischen zwei Behandlungsgruppen statistisch verglichen zuführen. Diese Analyse basiert auf einer Transformationsnetz, wo Änderungen in Markierungsposition werden als Vektoren betrachtet angezeigt. Ein Raster ist auf dieser Vektoren, so dass ein Verziehen Muster angezeigt, um zu zeigen, wo signifikante Landmarkenpositionen geändert haben überlagert. Formänderungen in der Diskriminanzanalyse auf einem statistischen Maß basiert, und kann daher von einem p-Wert berechnet werden. Diese Analyse ist einfach und zugänglich, nur ein Stereoskop und Freeware-Software erfordern, und somit ein wertvoller Forschung und Lehre Ressource sein.

Hier wird eine quantitative Analyse der orofacial Größe und Form wurde gezeigt, Embryonen mit einem Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor (RAR-Inhibitor) zu unbehandelten Kontrollen behandelt vergleichen. Embryonen wurden mit einer 1 &amp; mgr; M Konzentration dieser chemischen Inhibitor von Stufe 24 bis 30 (26-35 HPF) behandelt, ausgewaschen und in Stufe 42 (82 hpf) befestigt ist. Sie wurden dann verarbeitet und analysiert, wie in dem Protokoll beschrieben. Ergebnisse sind Originaldaten, aber im Einklang mit Beobachtungen in früheren Publikationen 2,3. Steuer Embryonen wurden mit dem Fahrzeug, DMSO behandelt und normal entwickelt (Fig 7AI, ii). Embryos mit einer 1 &amp; mgr; M Konzentration der RAR-Inhibitor behandelt wurden, zeigten leichte Verengung des Gesichts, Augenanomalien und eine fehlerhafte embryonale Mundöffnung, die mehr dreieckförmige (Fig 7Aiii, iv). Zuerst wurden herkömmliche orofacial Dimensionen gemessen und sind in Figur 7B zusammengefasst. S<html> TATISTISCHE Signifikanz wurde durch Durchführen der Student-t-Test unter Annahme ungleiche Varianz zwischen Inhibitor behandelten Embryonen und Steuerungen für jede Messung ermittelt. Wir fanden, dass sowohl Schnauze Länge und Flächenbreite signifikant in RAR-Inhibitor behandelten Embryonen verringerte im Vergleich zu Kontrollen (p-Werte = 0,0062 und 0,0058 sind; Abbildung 7bi, ii). Während Gesichtshöhe und Mund Rundheit signifikant erhöht (p-Werte = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), Maulweite signifikant ab (p-Wert = 2,5175 x 10 -10; Abbildung 7Biii-v) .Das Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Gesamt orofacial Bereich zwischen den beiden Gruppen (p-Wert = 0,3754, Fig 7Bvi). Diese Daten zeigen, dass der Verlust von Retinsäure-Signalisierung zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Entwicklungsergebnisse in kürzerer Schnauze, leichte Verengung des Mittelgesichts Region und Fehlbildung der embryonalen Mundöffnung. nt &quot;&gt; eine anspruchsvolle Ansicht der Formänderungen des embryonalen orofacial Region in Reaktion auf reduzierte Retinsäure Signale liefern wir als nächstes verwendet geometrischen morphometrischen Analysen. Nach der Identifizierung und Ausrichten orofacial Sehenswürdigkeiten morphometrische Analyse unter Verwendung von Software, die wir dann in jedem untersuchten die Varianz Gruppe, über die Hauptkomponentenanalyse (PCA). Wenn die ersten beiden Hauptkomponenten wurden gegeneinander, RAR-Inhibitor behandelten Embryonen aufgetragen waren deutlich von Kontrollen entlang der PC1-Achse (7C). Dieser Test zeigte auch die Ausreißer in der Probe Soll durch zwei Inhibitor behandelten Embryonen, die nicht mit dem Rest der Gruppe (7C, Pfeile) dargestellten Cluster haben. Als nächstes wurden die statistischen Unterschiede in der Form der orofacial Bereich zwischen RAR-Inhibitor behandelten Embryonen und Kontrollen bewertet und durch Durchführen einer Diskriminanzanalyse (DFA) visualisiert. Die Procrustes Abstand bwischen den beiden Gruppen war signifikant (distance = 0,2665, p-Wert &lt;0,0001, 7D), die eine Änderung in orofacial Form, wenn Retinsäure Signalisierungs gestört ist. Tatsächlich dramatische Verschiebungen in der Position der seitlichen Grenzsteine ​​in der orofazialen Region deuten auf eine Einengung des Gesichtsform jeweiligen auf die Höhe in Inhibitor behandelten Embryonen (7D). Darüber hinaus ist die leichte Verschiebung nach außen in Position der Nasenmarken (7D, Pfeile) zeigt die Abnormalität in Nasenloch Position in diesen Embryonen, die mit verringerten Auswuchs der Schnauze ist. Die Verschiebungen in Wahrzeichen, die die Ränder der Mundöffnung Show Positionsänderungen, die die Bildung eines dreieckigen Mundöffnung, dass reflektieren zu definieren, ist im Einklang mit der medianen Spalt in unseren früheren Studien 2,3 gemeldet. Zusätzlich zur Vektorverschiebungen, die Schärmuster der Transformationsnetz stellt auch Formänderungen in der oderofacial Region. Verziehen in der Mittelgesichtsbereich ist konsistent mit der Mittelgesichts-Hypoplasie und Gesamtgesichts Verengung in Embryonen mit verminderter Retinsäure Signale (7D) gesehen. Die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse (EDA) zeigen Formänderungen, die im Einklang mit unserer qualitativen Analyse waren sowie enthüllt einige Änderungen, die nicht ausreichend durch traditionelle Größenmessungen allein gefangen genommen wurden. Zum Beispiel, während die orofacial Bereich war nicht signifikant verschieden zwischen den Kontrollen und Inhibitor behandelten Embryonen (Fig 7Bvi) ergab die DFA Transformationsnetz dramatischen Veränderungen in diesem Bereich in Übereinstimmung mit dem Gesichts Verengung Inhibitor behandelten Embryonen (7A, D) gesehen. Ferner sind die Schärmuster und Wahrzeichen Verschiebungen der Mundöffnung, verbunden mit der erheblichen Veränderung, die wir in den Mund Rundheit sah, veranschaulichen die Fehlbildung der Mundöffnung Form in Inhibitor behandelt embryos. Zusammengefasst, eine Kombination von herkömmlichen Messungen der Abmessungen und geometrischen Gesichts morphometrische Analyse zeigt die Veränderungen in der Form und Größe des Bereichs, wenn orofacial Retinsäure Signale gestört. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Benötigte Materialien. (A) Werkzeuge für die Datenanalyse. (I) 24-Well-Platte, (ii) Standardeinmaltransferpipette, (iii) Dumont # 5 Inox Pinzette, (iv) Lehm ausgekleidete Petrischale, (v) gerade teasing Nadel, (vi) Glaspipette-Werkzeug, (vii ) sterile Einwegskalpell. (B) Herstellung des Tons ausgekleidete Schale. (I) Eine gerade Necken Nadel wird verwendet, um horizontale Zeilen in dem Ton zu ziehen. (Ii) Eine Glaspipette-Werkzeug wird verwendet, um kreisrunde Vertiefungen entlang jeder Reihe zu machen. (Iii) Das Gericht wird mit PBT für die Bildgebung gefüllt. page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Abbildung 2. In-vitro-Fertilisation und Kultur von Xenopus Eier. (A) Nach HCG Injektion, laevis erwachsenen Xenopus Weibchen dazu gebracht werden, Eier zu legen. (B) Die Eier werden im hohen Salz MBS Verwendung von Standardverfahren gesammelt, mit Hoden aus einer männlichen extrahiert befruchtet und kultiviert. (C) Die Embryonen werden auf ein übertragenes 24-Well-Schale mit 0,1x MBS mit einem Standard, Einmaltransferpipette. (D) einer kalibrierten Pipette-Mann wird verwendet, um in eine leere gut messen 1 ml, und ein Marker verwendet, um dieses Niveau auf der Außenseite alle Vertiefungen abzugrenzen haltigen Embryonen (kleines Bild). 0,1x MBS wird dann hinzugefügt oder entfernt, so dass es Ebene mit diesem Zeichen ist. highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3: Herstellung von Embryos Köpfe für die Bildgebung. (A) Schematische Darstellung der zwei Einschnitte erforderlich, um Köpfe, solide schwarze Linien zu entfernen. Maßstabsbalken = 400 &amp; mgr; m. (B) Die erste Schnitt am hinteren Ende des Darms, um den Schwanz und Druck vom Skalpells zu entfernen. Maßstabsbalken = 400 &amp; mgr; m. (C) Das zweite Schnitt wird am vorderen Ende des Darms, nahe dem Herzen gemacht, um den Kopf vollständig abzutrennen. Maßstabsbalken = 400 &amp; mgr; m. (D) frontalen Blick auf Reihe Embryo Köpfe in Ton positioniert. Maßstabsbalken = 650 &amp; mgr; m. (E) Seitenansichten Reihe Embryo Köpfe Position in Ton. Maßstabsbalken = 500 &amp; mgr; m cg: Zementdrüse. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Traditionelle Größenmessungen von orofazialen Dimensionen. (A) </strong&gt; Ansichtsbreite. Pfeile zeigen die Stelle, wo der ventralen Abschnitt des Auges des Umfangs der Fläche entspricht. Rote Linie ist die Zahnbreite, gemessen als Abstand zwischen diesen Punkten. Maßstabsbalken = 210 &amp; mgr; M. (B) Gesichtshöhe. Weiße Linien sind Führungen vor der Messung an der dorsalen Rand der Augen und der dorsalen Kante des Zementeinführung zu ziehen. Rote Linie ist die Gesichtshöhe, gemessen als Abstand zwischen diesen beiden Führungen an der Mittellinie des Gesichts. Maßstabsbalken = 210 &amp; mgr; M. (C) Orofacial Bereich. Weiße Linien sind Führungen vor der Messung gezogen. (A) Punkt, wo die Bodenführung entspricht dem ventralen Rand des linken Auges. Rote Linie zeigt die Verfolgung rund um das linke Auge. (B) Punkt, wo die dorsalen Rand des Auges trifft das obere Führung. Blaue Linie zeigt die dorsale Grenze des orofazialen Bereich, entlang der oberen Führungs am dorsalen Rand der Augen verfolgt. (C) Punkt, wo die obere Führung trifft den rechten Gesichts Peripherie. Grüne Linie zeigtdie Verfolgung rund um das rechte Auge. (D) Punkt, wo die ventralen Rand des rechten Auges trifft den unteren Führungs. Gelbe Linie zeigt ventrale Grenze des orofazialen Bereich, entlang der unteren Führungs am dorsalen Rand des Zementdrüse zurückzuführen. Maßstabsbalken = 210 &amp; mgr; M. (D) Schnauze Länge. Weiße Linie ist der vordere Rand des Auges und ist als Leitfaden vor der Messung gezogen. Rote Linie ist Schnauze Länge, von dieser Linie bis zu dem Punkt, wo die dorsalen Rand des Zementdrüse trifft den seitlichen Umfang des Gesichts gemessen. Maßstabsbalken = 300 &amp; mgr; M. (E) Maulweite. Arrows sind die Punkte, wo die dorsalen und ventralen Lippen aufeinander. Die rote Linie ist der Maulweite, gemessen als Abstand zwischen diesen beiden Punkten. Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; M. (F) Mouth Rundheit. Der Umfang der Mundöffnung wird zurückverfolgt und in Rot dargestellt. cg: Zementdrüse. Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; M. <img alt = &quot;5&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 5. Capturing Sehenswürdigkeiten und Vorbereitungen für geometrische morphometrische Analyse. (A) Mit Foto-Editing-Software und einem Tabellenkalkulationsprogramm, um Sehenswürdigkeiten und Capture Koordinaten platzieren. (I) Mehrfarbige Kreuze sind die Sehenswürdigkeiten auf dem Bild mit dem Add Punkte Werkzeug in ImageJ, um die Form des orofazialen Region dar gelegt. (Ii) Landmark-Daten unter Verwendung der Ergebnisse anzeigen Werkzeug angezeigt. (Iii) Landmark Daten kopiert und in eine Tabellenkalkulation eingefügt. Oberhalb der zweiten Spalte ist ein Header, die die Anzahl der Sehenswürdigkeiten und durch &quot;LM = 24&quot; (rotes Feld) bezeichnet. Unterhalb der zweiten Spalte der Daten wird die Probe einen eindeutigen Namen gegeben und durch &quot;ID = CON1&quot; (roter Pfeil) bezeichnet. Dies wird für alle Bilder in einem Probensatz wiederholt und die Daten als Textdatei gespeichert. (B) Vorläufige Datenanalyse in einem geometrischen morphometrischen Softwsind Programm. (I) Die Textdatei in der Foto-Editing-Software erstellt wird in die morphometrische Programm MorphoJ importiert, als TPS-Datei. Datei wird von roten Pfeil angezeigt. (Ii) Landmark Koordinatendaten wird durch Procrustes anpassbare Hauptachsen ausgerichtet sind. Rote Pfeil zeigt die Ausführung der Ausrichtung. (Iii) Eine Kovarianzmatrix Procrustes fit Sehenswürdigkeiten in der Vorrunden Menü erzeugt. (Iv) Ein Klassifizierer Datei wird in einer Tabelle erstellt. Spalte A und B sind Überschriften &quot;ID&quot; und &quot;Behandlung&quot;, gegeben sind. Die IDs zu jeder Probe in Wahrzeichen der Datenerhebung gegeben werden eingegeben unter Spalte A und der Behandlungsgruppe, zu der jede Probe gehört eingegeben in Spalte B (v) Der Klassifikator Datei wird in die morphometrische Programm als Klassifizierer variablen Satz importiert und Matched durch Identifier für die gewählte Datensatzes. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen</a>diese Zahl. <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Die statistische Analyse in morphometrischen Software. Von der Registerkarte Variation (A) Hauptkomponentenanalyse (PCA) (i) PCA ausgewählt. (Ii) Die ersten beiden Hauptkomponenten Procrustes Sehenswürdigkeiten werden als Streudiagramm auf der Registerkarte PC Partituren angezeigt. (Iii) Ein Popup-Menü wird in der Grundstücksraum gebracht. Dieses Menü wird verwendet, um zu ändern, welche Hauptkomponenten gegeneinander (roter Pfeil) aufgetragen werden und die Datenpunkte (blau markiert) zu färben. (Iv) Die Datenpunkte werden nach den Klassifikator Variablen im Popup-Menü eingefärbt. (V) Prozentsatz der Varianz von jedem Hauptkomponente erfasst wird in dem Register Ergebnisse angezeigt. (B) Diskriminanzanalyse (EDA) (i) DFA aus der Registerkarte Vergleich. (ii) Der Datensatz von Procrustes Koordinaten für DFA ausgewählt und die zuvor hochgeladenen Klassifikatoren für die Gruppierung gewählt. Die gewünschten Gruppen verglichen werden ausgewählt und Permutation Tests ausgeführt werden. (Iii) DFA Ergebnisse werden als Vektorkarte in der Registerkarte Form Differenz angezeigt. Ein Popup-Menü in der Handlung Raum verwendet werden, um das Bild korrekt auszurichten. (Iv) Durch Auswahl der Registerkarte Set-Skalierungsfaktor in der Pop-up-Menü, das Vorzeichen der Skalierungsfaktor kann geändert werden. (V) Die Vektorkarte ist mit einem Transformationsnetz mit der gewünschten Anzahl von Gitterlinien, indem Sie Ändern Sie den Diagrammtyp im Popupmenü der Vektorkarte geändert. (Vi) Die Mahalanobis und Procrustes Entfernungen und entsprechenden p-Werte sind unter dem Register Ergebnisse angezeigt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <imgalt = &quot;7&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 7. Orofacial Analyse von Steuerungs- und RAR gehemmt behandelten Embryonen. (A) (i, ii) Repräsentative Bilder der Bedienelemente. Maßstabsbalken = 270 &amp; mgr; m. (Iii, iv) Embryos mit einer 1 &amp; mgr; M Konzentration der RAR-Inhibitor, BMS-453 behandelt. Maßstabsbalken = 260 &amp; mgr; m. (I, iii) Frontalansichten. Mundöffnung in rote Punkte dargestellt. (II, IV) Seitenblick. cg:. Zementdrüse (B) Traditionelle orofazialen Dimensionen der Kontrolle (schwarz) und Inhibitor behandelten (blau) Embryonen. (I) Schnauze Länge in mm (ii) Ansichtsbreite in mm (iii) Gesichtshöhe, in mm (iv) Maulweite in mm (v) Mund Rundheit, eine einheitslose Zahl in ImageJ Verwendung der Gleichung bestimmt: (4 &#8197; × &#8197; [Bereich]) / (π &#8197; × &#8197; [Hauptachse] 2). (Vi) Orofacial Bereich, in mm <sup&gt; 2. Sternchen zeigen Bedeutung als durch t-Test unter Annahme einer ungleichen Varianz bestimmt. α &lt;0,05. (C) Hauptkomponentenanalyse. Die Kontrollen sind in schwarz und RAR-Inhibitor behandelten Embryonen sind in blau. Schwarze Pfeile zeigen Ausreißer. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Diskriminanzanalyse Anzeigen der Procrustes Entfernung und p-Wert ist, zusätzlich zu einem Transformationsnetz. Geschlossener Kreis Ende des Vektors ist das Wahrzeichen Position in RAR-Inhibitor behandelten Embryonen. Das Ende der Zeile des Vektors ist die Markierungsposition in der Kontrollgruppe. Schwarze Pfeile zeigen Verschiebung Nasen Sehenswürdigkeiten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen.

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University.  Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen. 

Serie: Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologie

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Neurowissenschaften

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from harmful ultraviolet radiations. Perturbations in melanocyte functioning lead to pigmentary disorders such as piebaldism, albinism, vitiligo, melasma, and melanoma. Zebrafish is an excellent model system to understand melanocyte functions. The presence of conspicuous pigmented melanocytes, ease of genetic manipulation, and availability of transgenic fluorescent lines facilitate the study of pigmentation. This study employs the use of wild-type and transgenic zebrafish lines that drive green fluorescent protein (GFP) expression under mitfa and tyrp1 promoters that mark various stages of melanocytes. 
Morpholino-based silencing of candidate genes is achieved to evaluate the phenotypic outcome on larval pigmentation and is applicable to screen for regulators of pigmentation. This protocol demonstrates the method from microinjection to imaging and fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based dissection of phenotypes using two candidate genes, carbonic anhydrase 14 (Ca14) and a histone variant (H2afv), to comprehensively assess the pigmentation outcome. Further, this protocol demonstrates segregating candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators that selectively alter melanocyte numbers and melanin content per cell, respectively.

Regulators of melanocyte functions govern visible differences in the pigmentation outcome. Deciphering the molecular function of the candidate pigmentation gene poses a challenge. Herein, we demonstrate the use of a zebrafish model system to identify candidates and classify them into regulators of melanin content and melanocyte number.

Umgekehrter genetischer Ansatz zur Identifizierung von Regulatoren der Pigmentierung anhand von Zebrafischen

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Gesichtstransplantation in

Umgekehrter genetischer Ansatz zur Identifizierung von Regulatoren der Pigmentierung anhand von Zebrafischen