Valutazione del salidroside come agente terapeutico per la calcificazione vascolare utilizzando la farmacologia di rete e modelli sperimentali di ratto

Questo studio stabilisce un modello di calcificazione vascolare indotta da una dieta ricca di grassi (HFD) combinata con vitamina D3 (VD3). Il modello è stato utilizzato per valutare l'efficacia terapeutica del salidroside nella prevenzione e nel trattamento della calcificazione vascolare, fornendo informazioni sui suoi potenziali meccanismi d'azione attraverso la farmacologia di rete e gli esperimenti in vivo .

La calcificazione vascolare (VC) è una condizione patologica critica associata a significativa morbilità e mortalità. Questo studio impiega un approccio ibrido di farmacologia di rete e biologia molecolare per delineare i meccanismi terapeutici del salidroside (SAL), un composto attivo della Rhodiola crenulata, contro la VC. Attraverso l'estrazione di database e l'analisi della rete, sono stati identificati 388 bersagli SAL che si intersecano con 2871 bersagli associati a VC, risultando in 208 bersagli comuni. Una rete di interazione proteina-proteina (PPI) costruita tramite il database String e l'analisi topologica in Cytoscape 3.9.1 ha individuato 10 bersagli chiave, tra cui IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 e STAT3, tra gli altri. I geni identificati erano concentrati nelle vie lipidiche e aterosclerotiche, indicando che il miglioramento della VC da parte della SAL può avvenire attraverso la regolazione dell'espressione anomala di fattori lipidici e infiammatori. È stato anche scoperto che il SAL inibisce l'espressione anomala di fattori infiammatori, attivando così la via JAK2/STAT3 per intervenire nella progressione del VC. La via JAK2/STAT3 è un meccanismo molecolare chiave attraverso il quale la SAL previene l'ulteriore deterioramento della VC. Le analisi di arricchimento funzionale hanno rivelato il coinvolgimento di questi bersagli nelle risposte infiammatorie e nel metabolismo lipidico, percorsi cardine nella VC. Studi in vivo sui ratti hanno dimostrato l'efficacia di SAL nel mitigare la dislipidemia e l'infiammazione vascolare, con un miglioramento dei profili lipidici sierici e una ridotta deposizione vascolare di calcio. L'esplorazione meccanicistica, basata sull'analisi Western blot, ha dimostrato la capacità del salidroside di regolare la via di segnalazione JAK2/STAT3, evidenziando il suo potenziale come modulatore in questo meccanismo molecolare critico e offrendo un potenziale bersaglio terapeutico per VC. La forza di questa ricerca risiede nel suo rigore metodologico, integrando le previsioni computazionali con le validazioni in vivo . Questo approccio globale stabilisce un solido quadro per esplorare i meccanismi terapeutici dei composti naturali nella lotta contro la VC.

La calcificazione vascolare (VC) si riferisce alla deposizione anomala di calcio all'interno delle pareti dei vasi, che porta all'irrigidimento arterioso e alla diminuzione dell'elasticità, compromettendo infine la funzione vascolare. Tradizionalmente, la VC è stata suddivisa in due tipi: calcificazione intimale, legata all'accumulo di lipidi, e calcificazione mediale. La prima è strettamente associata all'infiltrazione infiammatoria, innescando una trasformazione osteogenica nella parete vascolare, caratterizzata dalla migrazione, proliferazione e differenziazione delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) in cellule osteoblasto-simili¹.

La capacità delle VSMC di subire la differenziazione osteogenica, influenzata da fattori come l'invecchiamento, la genetica e le condizioni ambientali come il diabete e la malattia renale cronica, è un importante contributo alla VC legata all'età. Questa trasformazione simile a quella degli osteoblasti esacerba la calcificazione e la degenerazione arteriosa¹.

La VC è una condizione multiforme, guidata da cambiamenti degenerativi, squilibri metabolici e varie condizioni sistemiche. Circa l'80% delle lesioni vascolari e il 90% dei casi di malattia coronarica presentano VC, aumentando significativamente il rischio di gravi eventi cardiovascolari ^1,2. Pertanto, c'è un urgente bisogno di scoprire trattamenti farmacologici che mitighino o invertano efficacemente questa condizione.

Attualmente, le strategie di trattamento per la VC coinvolgono vari interventi farmacologici, sebbene nessun farmaco sia specificamente progettato per questo scopo. Per i pazienti con calcificazione lieve, le statine sono spesso prescritte per stabilizzare le placche. Tuttavia, mentre possono ridurre la stenosi dell'arteria coronarica abbassando i livelli di lipidi, il loro effetto sulla calcificazione è limitato².

Data la complessità dell'aterosclerosi, molti pazienti mostrano una maggiore attivazione piastrinica, rendendo necessario l'uso di farmaci antipiastrinici come l'aspirina o il clopidogrel per inibire l'aggregazione piastrinica e ridurre il rischio di trombosi. Tuttavia, la terapia con aspirina è utile solo per gli individui con un alto punteggio di calcio dell'arteria coronarica e un basso rischio di sanguinamento³.

Inoltre, la ricerca sugli integratori, come la vitamina K, suggerisce un potenziale nella prevenzione della progressione della VC⁴. Nei casi più gravi, possono essere presi in considerazione interventi invasivi, sebbene spesso non siano adatti per la VC⁵ diffusa. Per gli individui senza VC esistente, la gestione dei fattori di rischio, come la pressione sanguigna, i profili lipidici e le scelte di stile di vita, rimane fondamentale⁶.

La Rhodiola crenulata, un'erba perenne della famiglia delle Crassulaceae, è stata tradizionalmente utilizzata nella medicina cinese. Il suo principale costituente bioattivo, il salidroside, merita un'attenzione significativa per le sue notevoli attività biologiche. Il salidroside è rinomato per la sua capacità di inibire l'apoptosi, mostrare robuste proprietà antiossidanti e possedere caratteristiche antinfiammatorie ^7,8. Questi attributi contribuiscono al suo potenziale di migliorare la funzione vascolare, ritardare l'invecchiamento vascolare e salvaguardare l'endotelio vascolare. Come potenziale agente terapeutico per la VC, il salidroside ha un valore sostanziale per la ricerca. Tuttavia, i meccanismi precisi con cui il salidroside migliora la VC devono ancora essere completamente chiariti e giustificano ulteriori indagini per sfruttare il suo potenziale terapeutico nel trattamento della VC.

Per esplorare questi meccanismi, questo studio sfrutta la farmacologia di rete, una metodologia innovativa che combina farmacologia, bioinformatica e informatica per analizzare i sistemi biologici e chiarire i meccanismi dei farmaci. Rispetto alla tradizionale ricerca sui farmaci a bersaglio singolo, la farmacologia di rete offre un approccio più completo analizzando gli effetti di un farmaco su più bersagli biologici e vie di segnalazione. Come strumento chiave nello sviluppo di farmaci moderni, costruisce reti di farmaci, bersagli e percorsi per rivelare i meccanismi alla base dell'azione dei farmaci ^9,10. Nonostante il suo ampio utilizzo nell'esplorazione dei meccanismi terapeutici, la ricerca sui meccanismi interattivi tra salidroside e VC dal punto di vista della bioinformatica e della farmacologia delle reti.

Questa ricerca costruisce una mappa della rete molecolare del potenziale impatto del salidroside sulla VC identificando e analizzando i bersagli chiave attraverso un'ampia estrazione di database. Viene generata una rete di interazione proteina-proteina (PPI) e viene applicata l'analisi topologica per evidenziare i nodi critici nel processo di calcificazione.

Per confermare le previsioni computazionali, viene sviluppato un modello di VC su ratto somministrando una dieta ricca di grassi con vitamina D3 (VD3). Questo modello replica le caratteristiche patologiche della VC umana. Il danno vascolare viene valutato attraverso tecniche istologiche, i profili lipidici sierici e i marcatori di infiammazione vengono valutati per studiare gli effetti sistemici del salidroside e l'espressione delle proteine correlate al SAL anti-VC viene misurata utilizzando il Western blotting per esplorare l'impatto del salidroside sulla VC indotta sperimentalmente, questo studio mira a contribuire a fornire preziose informazioni sul potenziale di questo composto come strategia terapeutica per combattere la VC.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato per gli Animali Sperimentali dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Approvazione n. 2023091). Questo studio aderisce alle linee guida internazionali, comprese le linee guida della Comunità Europea e la Direttiva CEE del 1986, garantendo il trattamento etico degli animali durante lo studio. Per lo studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi (8-10 settimane, peso 200-220 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Predizione farmacologica di rete di potenziali bersagli di salidroside-VC

NOTA: La farmacologia di rete utilizza metodi computazionali e analisi dei dati su larga scala per studiare le complesse interazioni tra molecole di farmaci e bersagli biologici come percorsi, geni e proteine all'interno di un organismo^11,12. Questo approccio aiuta a decifrare le funzioni biologiche e le relazioni delle entità studiate. La metodologia comprende l'utilizzo di database, l'elaborazione di informazioni chimiche, l'acquisizione di dati di bioattività, il recupero di dati proteici, l'analisi dei profili di espressione genica, la costruzione di reti di interazione e l'analisi dell'arricchimento dei percorsi¹¹. La Figura 1 mostra la rete di interazione dei bersagli principali tra salidroside e calcificazione vascolare.

1. Costruzione del database di destinazione "Ingrediente"
   1. Utilizzare "Salidroside" come parola chiave per gli ingredienti per cercare nei database¹³ (vedere la Tabella supplementare 1), come HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA e STITCH.
   2. Esamina la letteratura pertinente per identificare i bersagli associati al salidroside, con la specie impostata su Homo sapiens. Dopo aver rimosso i duplicati, standardizzare le proteine bersaglio utilizzando UniProt (vedere la Tabella supplementare 1) e creare un database completo di bersagli Salidroside¹⁴.
2. Costruzione del database dei target "Malattia"
   1. Utilizzare "Calcificazione vascolare" come parola chiave per cercare nei database¹⁵ (vedere la tabella supplementare 1), tra cui GeneCards, OMIM, PharmGkb e DrugBank, con la specie impostata su Homo sapiens. Dopo la deduplicazione, creare un database di target di calcificazione vascolare.
3. Previsione di potenziali bersagli terapeutici
   1. Inserire i bersagli per il salidroside e la calcificazione vascolare (vedere la Tabella supplementare 1) per identificare i bersagli comuni. Genera un diagramma di Venn per visualizzare i potenziali bersagli terapeutici del salidroside nel trattamento della calcificazione vascolare.
4. Costruzione della rete di interazione proteina-proteina (PPI) "Salidroside-Calcificazione Vascolare"
   1. Compilare i potenziali bersagli in un elenco di proteine multiple e analizzarli utilizzando STRING (vedere la Tabella supplementare 1), con l'organismo impostato su Homo sapiens e il punteggio di interazione impostato su media confidenza (>0,4)¹⁶. Estrarre i dati PPI in formato TSV per ulteriori analisi.
      NOTA: Dato che l'85% dei geni di ratto sono omologhi a geni umani, svolgendo funzioni biologiche simili, i ratti sono stati selezionati come soggetti sperimentali per convalidare gli effetti del salidroside sulla calcificazione vascolare¹⁷.
5. Selezione e costruzione della rete di obiettivi chiave
   1. Importare i dati della rete PPI in Cytoscape 3.9.1 (vedere la Tabella supplementare 1) per l'analisi utilizzando il plug-in CytoNCA per valutare parametri quali Betweenness (BC), Closeness (CC), Degree (DC), Eigenvector (EC), Local Average Connectivity (LAC) e Network Centrality (NC). Seleziona i target chiave con CC=1 per costruire una mappa dello spettro d'azione del target principale per 'SAL-VC'.
   2. Utilizza il plug-in CytoHubba per identificare i primi 10 geni hub in base ai calcoli della centralità della cricca massima (MCC), della componente massima di vicinato (MNC) e del grado, generando una mappa dello spettro dei geni hub.
6. Analisi dell'arricchimento dei percorsi GO e KEGG
   1. Eseguire la conversione dell'ID genico utilizzando DAVID (vedere la Tabella supplementare 1), selezionando ENSEMBL_GENE_ID per il tipo di gene 9606 per informazioni sulla specie. Analizzare l'elenco dei geni convertiti utilizzando Omicshare (vedere la Tabella supplementare 1) per l'arricchimento funzionale di OB e della via KEGG, con significatività impostata al valore P < 0,05¹⁸.
      NOTA: L'analisi funzionale GO include la funzione molecolare (MF), il processo biologico (BP) e la componente cellulare (CC). L'analisi dei percorsi KEGG coinvolge l'arricchimento dei percorsi e l'arricchimento della classificazione dei percorsi¹⁹. I risultati dell'analisi dell'arricchimento sono illustrati nella Figura 2.

2. Esperimento sugli animali

1. Acclimatazione
   1. Acclimatare i ratti Wistar in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) con un ciclo luce/buio di 12 ore. Assicurarsi che abbiano accesso ad libitum a cibo e acqua per mantenere la loro salute prima dell'inizio degli esperimenti. Eseguire l'alimentazione adattiva per 1 settimana.
2. Istituzione modello
   1. Acclimata i ratti alle condizioni ambientali e assegnali casualmente in cinque gruppi: gruppo di controllo (Ctrl, ND + veicolo), gruppo modello (modello, HFD + veicolo), gruppo SAL a basso dosaggio (SAL-L, HFD + SAL 5 mg/kg), gruppo SAL ad alto dosaggio (SAL-H, HFD + SAL 10 mg/kg) e gruppo simvastatina (SIM) (HFD + SIM 5 mg/kg).
   2. Somministrare una dieta normale (ND) al gruppo Ctrl e una dieta ricca di grassi (HFD) ai gruppi rimanenti per l'intera durata dell'esperimento. Il primo giorno di somministrazione di HFD, iniettare una singola dose sottocutanea di 600.000 UI/kg VD3 a tutti i gruppi tranne il gruppo Ctrl^20,21. Proseguire con iniezioni sottocutanee settimanali di 100.000 UI/kg VD3 per le successive 8 settimane (Figura 3).
   3. Monitorare quotidianamente lo stato di salute e la sopravvivenza degli animali. Iniziare gli interventi sperimentali nella nona settimana.
   4. Sopprimere gli animali alla conclusione dello studio (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Raccogliere i campioni di siero, lasciarli riposare per 30 minuti e centrifugare per isolare il siero (seguendo i rapporti precedentemente pubblicati^20,21). Sezionare i tessuti vascolari (aorta addominale) e risciacquare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il sangue.
   5. Fissare una parte del tessuto in paraformaldeide al 4% per l'esame istologico e conservare un'altra porzione in azoto liquido per l'analisi molecolare.
      NOTA: Diluire il salidroside con acqua tiepida prima dell'uso.

3. Valutazione del danno tissutale vascolare mediante colorazione HE, VK, EVG

NOTA: Fissare il tessuto vascolare (aorta addominale) in paraformaldeide al 4%, disidratato in etanolo dopo 48 ore e incorporato in paraffina. Tagliare i blocchi di paraffina incorporati in fette da 5 μm per la colorazione con ematossilina-eosina (HE), Elastica van Gieson (EVG) e Von Kossa (VK) e osservare la morfologia istologica al microscopio ottico. La colorazione HE viene utilizzata per valutare i cambiamenti nella morfologia dei tessuti. Nel tessuto vascolare, evidenzia alterazioni strutturali nella parete del vaso, tra cui la proliferazione delle cellule muscolari lisce, la disposizione disorganizzata delle cellule e l'infiammazione. La colorazione EVG visualizza le fibre elastiche e di collagene, il che è essenziale per valutare il danno o il rimodellamento delle fibre elastiche nel tessuto vascolare e aiuta a comprendere l'impatto della calcificazione sull'elasticità vascolare. La colorazione VK rileva i depositi di calcio, una caratteristica chiave nella VC, rendendola cruciale per valutare l'entità e la distribuzione della calcificazione nel tessuto vascolare^22,23.

1. Colorazione HE per il rilevamento del danno tissutale vascolare
   1. Deparaffinazione e reidratazione
      1. Deparaffinare le sezioni in due cambi di xilene per 8 minuti ciascuna e reidratarle attraverso una serie di etanolo graduato (100%, 95%, 85%, 75%) per 3 minuti per passo. Seguire con un risciacquo di 2 minuti in acqua corrente del rubinetto.
   2. Colorazione con ematossilina
      1. Macchiare le sezioni con ematossilina per 5-10 minuti e lavare per rimuovere la macchia in eccesso, seguito da un risciacquo con acqua corrente del rubinetto.
         NOTA: Si consiglia una colorazione chiara di 5 minuti per evitare macchie eccessivamente scure, che possono influire sul colore citoplasmatico.
   3. Differenziazione
      1. Differenziare le sezioni in una soluzione di differenziazione per 30 s, seguita da due risciacqui in acqua di rubinetto per 3 minuti ciascuno.
   4. Eosina controcolorazione
      1. Mettere le sezioni nella macchia di eosina per 1 minuto. Dopo aver rimosso la macchia in eccesso, eseguire una rapida disidratazione.
   5. Disidratazione, chiarificazione e montaggio
      1. Per una rapida disidratazione, immergere le sezioni in etanolo al 75%, 85%, 95% e 100% per 3 secondi ciascuna, seguite da etanolo al 100% per 1 minuto.
         NOTA: Si raccomanda una rapida disidratazione poiché l'eosina può perdere colore nei gradienti di acqua ed etanolo.
2. Colorazione VK per la rilevazione del calcio
   1. Deparaffinazione e reidratazione
      1. Eseguire questo passaggio dopo il passaggio 3.1.1.
   2. Reazione al nitrato d'argento
      1. Asciugare le sezioni, delineare con un pennello sottile e colorare con Von Kossa (vedi Tabella dei materiali). Esporli alla luce ultravioletta per 4 ore, quindi risciacquare accuratamente con acqua corrente del rubinetto.
   3. Controcolorazione con ematossilina
      1. Macchiare le sezioni con ematossilina per 5 minuti, sciacquare con acqua corrente del rubinetto, differenziare e risciacquare di nuovo, quindi risciacquare con acqua corrente.
   4. Eosina controcolorazione
      1. Disidratare le sezioni con etanolo graduato (85% e 95% per 5 minuti ciascuna), quindi colorare con eosina per 5 minuti.
   5. Disidratazione e montaggio
      1. Disidratare le sezioni in bagni di etanolo (100% etanolo I, II, III per 5 minuti ciascuno) e chiarificare in bagni di xilene (xilene I e II per 5 minuti ciascuno). Quindi, montare le sezioni con balsamo neutro.
   6. Esame microscopico e acquisizione di immagini
      1. Esamina le sezioni colorate al microscopio ottico e acquisisci immagini per l'analisi.
         NOTA: Assicurarsi che i depositi di calcio appaiano da marrone-nero a nero scuro, che i nuclei siano blu e che lo sfondo sia rosso. Preparare la soluzione di nitrato d'argento per la colorazione VK fresca immediatamente prima dell'uso.
3. Colorazione EVG per fibre elastiche e di collagene
   1. Deparaffinazione e reidratazione
      1. Trattare le sezioni di paraffina con il calore per 50 minuti, quindi immergerle nello xilene per 20 minuti per rimuovere la paraffina. Procedere sottoponendo le sezioni a una serie di etanolo graduato (100%, 95%, 85%, 75%) per 5 minuti ciascuna, concludendo con un risciacquo in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
   2. Colorazione EVG
      1. Applicare la soluzione colorante EVG (vedere la Tabella dei materiali) per 10 minuti, quindi risciacquare brevemente in acqua corrente del rubinetto per 5 s per rimuovere la macchia in eccesso.
      2. Successivamente, applicare la soluzione di lavoro di Verhoeff (vedere la Tabella dei materiali) per 5 minuti, seguita da un altro breve risciacquo in acqua corrente del rubinetto per 5 s. Applicare la soluzione differenziante di Verhoeff per 5 s fino a quando le fibre di elastina sono chiaramente visibili, quindi risciacquare con acqua corrente del rubinetto per 5 s.
         NOTA: Mescolare i componenti A, B e C (forniti nel kit disponibile in commercio) in un rapporto 5:2:2 per preparare la soluzione di lavoro Verhoeff prima dell'uso. Utilizzare la soluzione entro 2 ore e reintegrare se necessario durante il processo di colorazione per evitare che le sezioni si secchino.
   3. Disidratazione e montaggio
      1. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato (75%, 85%, 95% e 100%) per 5 s ciascuna, seguita da una chiarificazione in due cambi di xilene per 1 minuto ciascuno. Dopo un breve periodo di asciugatura all'aria, montare le sezioni con balsamo neutro.
   4. Esame microscopico e analisi delle immagini
      1. Esamina le sezioni colorate al microscopio ottico per visualizzare le fibre elastiche e di collagene e acquisisci immagini per l'analisi successiva.

4. Dosaggio della fosfatasi alcalina (ALP)

NOTA: Utilizzare l'ALP come indicatore chiave per valutare l'efficacia dei trattamenti anticalcificazione.

1. Preparazione del reagente
   1. Sciogliere il substrato che sviluppa il colore in un tampone carbonato ghiacciato 0,05 M pH 9,6 fino a un volume finale di 2,5 mL.
      NOTA: Preparare il tampone sciogliendo 1,59 g di carbonato di sodio e 2,93 g di bicarbonato di sodio in 1.000 ml di acqua bidistillata.
2. Diluizione del substrato
   1. Diluire 10 μL di soluzione di p-nitrofenolo (10 mM) con tampone carbonato 0,05 M pH 9,6 fino a un volume finale di 0,2 mL per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM.
3. Preparazione del campione
   1. Omogeneizzare l'aorta addominale nel tampone di lisi. Centrifugare l'omogeneizzato (~12.000 x g per 10 minuti a 4 °C) e raccogliere il surnatante per il rilevamento dell'attività ALP.
      NOTA: Assicurarsi che il tampone di lisi sia privo di inibitori della fosfatasi. Conservare i campioni di prova in attesa a -80 °C, evitando ripetuti cicli di gelo-scongelamento.
4. Preparazione di micropiastre per il saggio
   1. Preparare una piastra a 96 pozzetti con pozzetti bianchi, standard e campioni. Aggiungere 50 μl della soluzione standard ai pozzetti standard e 50 μl di campioni di prova in attesa ai pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 10 minuti.
5. Misura della terminazione della reazione e dell'assorbanza
   1. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione. Misurare l'assorbanza a 405 nm e calcolare l'attività ALP in base ai valori di assorbanza (seguendo le istruzioni del produttore, vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: I pozzetti contenenti lo standard o i campioni con attività ALP mostreranno diverse sfumature di giallo. Il colore è stabile fino a 2 ore.

5. Determinazione del contenuto di calcio

NOTA: La determinazione del contenuto di calcio è fondamentale per valutare l'entità della mineralizzazione nei tessuti biologici.

1. Preparazione dei tessuti
   1. Tritare il tessuto in piccoli pezzi e omogeneizzarlo nel tampone di lisi.
2. Diluizione e centrifugazione del campione
   1. Diluire il tessuto nel tampone di lisi in un rapporto di 1:10. Omogeneizzare la miscela e centrifugare a 4 °C, 12.000 x g per 5 min. Raccogliere il surnatante per l'analisi.
      NOTA: Preparare le diluizioni standard di calcio (0-1,0 mM) utilizzando una soluzione standard di calcio 5 mM (vedere la Tabella dei materiali).
3. Impostazione e incubazione della piastra
   1. Aggiungere 50 μl di campioni standard o di prova a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 150 μl di soluzione di lavoro del saggio, mescolare accuratamente e incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Misurare l'assorbanza a 575 nm e costruire una curva standard.
4. Calcolo del contenuto di calcio
   1. Calcolare il contenuto di calcio utilizzando la curva standard, incorporando il fattore di diluizione, il volume del campione e il peso atomico del calcio.

6. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per citochine infiammatorie (IL-6, TNF-α, IL-1β)

NOTA: IL-6, IL-1β e TNF-α sono citochine pro-infiammatorie chiave che indicano la presenza e la gravità di una risposta infiammatoria. La misurazione di queste citochine è essenziale per comprendere il processo infiammatorio e valutare l'efficacia dei trattamenti antinfiammatori.

1. Raccolta campioni
   1. Raccogli il siero dall'aorta addominale del ratto. Lasciarlo coagulare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare il campione a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante.
2. Preparazione della micropiastra per il test
   1. Preparare una piastra a 96 pozzetti con pozzetti designati per gli standard e i campioni di prova. Aggiungere 50 μl di standard (vedere la tabella dei materiali) a concentrazioni variabili nei pozzetti appropriati.
3. Preparazione del campione
   1. Aggiungere 40 μl di diluente per campioni in ogni pozzetto designato per i campioni di prova. Aggiungere 10 μl di campione negli stessi pozzetti, ottenendo una diluizione di 5 volte.
4. Incubazione con reagenti marcati con enzimi
   1. Aggiungere 100 μl di reagenti marcati con enzimi specifici per IL-6, TNF-α o IL-1β a tutti i pozzetti tranne il bianco. Incubare la piastra a 37 °C per 60 minuti.
5. Lavaggio
   1. Scartare il liquido da tutti i pozzetti tranne il bianco. Lavare i pozzetti con 1 soluzione di lavaggio (preparata in diluizione di 20 volte in acqua distillata). Ripetere questa fase di lavaggio cinque volte e asciugare i pozzetti.
6. Sviluppo e terminazione del colore
   1. Aggiungere 50 μl di soluzioni di substrato A e B (dal kit disponibile in commercio, vedere la Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente e incubare la piastra al buio a 37 °C per 15 minuti. Aggiungere 50 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione.
7. Misurazione dell'assorbanza e analisi dei dati
   1. Impostate il pozzetto del pezzo grezzo su zero. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Genera una curva standard basata sui valori OD e sulle concentrazioni standard. Calcolare le concentrazioni del campione utilizzando l'interpolazione e regolare il fattore di diluizione.

7. Saggio del profilo lipidico

NOTA: Il test del profilo lipidico rileva livelli di lipidi anormali, dove livelli di lipidi elevati o sbilanciati possono accelerare il rischio di calcificazione vascolare.

1. Colesterolo totale e trigliceridi (TC e TG)
   1. Raccogliere il siero e preparare una piastra a 96 pozzetti con pozzetti designati per il bianco, la calibrazione e i campioni di test in sospeso. Aggiungere 2,5 μL di siero, standard di calibrazione o soluzione in bianco a ciascun pozzetto.
   2. Aggiungere 250 μl della soluzione di lavoro in ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente e incubare la piastra a 37 °C per 10 minuti. Misurare l'assorbanza a 500 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
2. Lipoproteine a bassa densità e lipoproteine ad alta densità (LDL-C e HDL-C)
   1. Raccogliere il siero e preparare una piastra a 96 pozzetti con pozzetti designati per il bianco, la calibrazione e i campioni di test in sospeso. Aggiungere 2,5 μl di siero, standard di calibrazione o soluzione in bianco nei rispettivi pozzetti.
   2. Aggiungere il reagente appropriato (Reagente Uno per 180 μL o Reagente Due per 60 μL, vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto, come specificato nelle istruzioni del kit di analisi. Incubare alla temperatura (37 °C) e per il tempo (Reagente Uno per 5 minuti o Reagente Due per 10 minuti) raccomandati per ciascun reagente.
   3. Misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda specifica (600 nm) indicata per LDL-C o HDL-C utilizzando un lettore di micropiastre.

8. Western blotting

NOTA: Il Western blot (WB) è fondamentale per valutare i livelli di espressione delle proteine chiave, consentendo la rilevazione sia delle forme totali che di quelle fosforilate.

1. Preparazione dei tessuti
   1. Pesare 0,05 g di fazzoletto e risciacquare abbondantemente con PBS per rimuovere i detriti in eccesso. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi contenente 1x inibitori della fosfatasi e della proteasi. Incubare il fazzoletto a 4 °C per 10 minuti e omogeneizzarlo utilizzando un trituratore di tessuti.
2. Estrazione delle proteine
   1. Lasciare riposare il campione omogeneizzato per 1 minuto, quindi centrifugare a 4 °C e 12.000 x g per 15 minuti. Raccogliere il surnatante per l'analisi delle proteine. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo BCA seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare una curva standard per calcolare la concentrazione.
      NOTA: Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C prima dell'uso. Misura la concentrazione di proteine a 562 nm.
3. Preparazione del campione
   1. Miscelare il campione proteico con un tampone di carico 5x contenente β-mercaptoetanolo e SDS in un rapporto 4:1. Scaldare il composto a 100 °C per 5 minuti per denaturare le proteine.
      NOTA: Se è necessario un tampone di caricamento 1x, diluire il tampone 5x con il tampone di lisi.
4. Preparazione del gel SDS-PAGE
   1. Preparare un gel SDS-PAGE al 12% e inserirlo nell'apparecchio per elettroforesi. Aggiungere 1x tampone per elettroforesi fino a metà corsa secondo le istruzioni (vedere la Tabella supplementare 2).
5. Elettroforesi
   1. Recuperare i campioni di proteine da -20 °C. Caricare 60 μg di proteine per pozzetto ed eseguire il gel.
   2. Impostare la corrente a 50 mA per 20 minuti per il gel di impilamento, quindi aumentare a 100 mA per 60 minuti per il gel di separazione fino a quando la parte anteriore del colorante non raggiunge il fondo.
6. Trasferimento a membrana
   1. Attivare la membrana PVDF in metanolo per 5 min.
   2. Assemblare il sandwich di trasferimento nel seguente ordine: carta da filtro → gel SDS-PAGE → membrana PVDF → carta da filtro. Trasferire proteine a 300 mA per 60 min.
      NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate tra il gel SDS-PAGE e la membrana PVDF.
7. Inceppamento
   1. Incubare la membrana in PVDF in BSA al 5% (preparato in 1x TBST) a temperatura ambiente agitando delicatamente per 60 minuti. Lavare la membrana con 1x TBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
8. Incubazione degli anticorpi primari
   1. Incubare la membrana in 5 mL dell'anticorpo primario appropriato (ad es. p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) diluito in tampone bloccante a temperatura ambiente per 2,5 ore.
9. Incubazione secondaria degli anticorpi
   1. Lavare la membrana con 1x TBST tre volte per 5 minuti ciascuna dopo l'incubazione degli anticorpi primari. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare nuovamente la membrana con 1 TBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
10. Scoperta
    1. Visualizzare le bande proteiche utilizzando il rilevamento della chemiluminescenza ECL²⁴ (vedi Tabella dei materiali).
11. Analisi densitometrica
    1. Quantifica le bande proteiche utilizzando il software ImageJ. Seguire questo flusso di lavoro in ImageJ: Image → 8-bit → Elabora → Sottrai sfondo. Analizza → imposta le misure → analizza → scala impostata. Modifica → Inverti → analizza → misura → risultati. File → Salva con nome → IntDen.
    2. Genera grafici statistici utilizzando software di grafica e analisi statistica.
       NOTA: assicurarsi che i risultati siano coerenti tra le repliche per convalidare i risultati.

9. Analisi statistica

1. Raccogli e organizza i dati utilizzando GraphPad Prism 9.0.
2. Calcola e traccia le barre di errore utilizzando la media ± SD dai dati grezzi.
3. Esegui l'analisi statistica utilizzando l'ANOVA unidirezionale, seguita dal test post-hoc di Tukey per confronti multipli.
4. Determinare la significatività statistica a P < 0,05, con valori P più piccoli che indicano maggiori differenze nei risultati.

Analisi farmacologica di rete

Utilizzando database come HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA e STITCH, sono stati identificati 388 potenziali geni bersaglio per il salidroside. Inoltre, 2871 potenziali geni bersaglio correlati alla VC sono stati recuperati da database come GeneCards, OMIM, PharmGkb e DrugBank. L'analisi delle intersezioni tramite diagrammi VENN ha rivelato 208 bersagli sovrapposti, considerati obiettivi chiave per l'intervento del salidroside nella VC (Figura 1A).

Analisi della rete PPI

La piattaforma STRING è stata utilizzata per analizzare le interazioni tra i 208 target chiave, da cui sono stati selezionati i primi 100 nodi. Questi nodi sono stati poi importati in Cytoscape 3.9.1 per costruire una rete PPI dettagliata. L'analisi della topologia di rete utilizzando parametri come EC, BC, NC, LAC, CC e DC ha identificato 37 obiettivi principali. Un ulteriore perfezionamento incentrato su grado, MCC e MNC ha individuato i primi 10 obiettivi principali, tra cui IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 e STAT3 (Figura 1B).

Analisi funzionale GO e del percorso KEGG

L'analisi funzionale OB dei 208 bersagli chiave ha identificato 4808 processi biologici, 294 componenti cellulari e 515 funzioni molecolari. L'analisi delle vie KEGG ha riportato 281 vie di segnalazione, che coinvolgono principalmente il metabolismo, l'elaborazione delle informazioni genetiche e ambientali, i sistemi organismici, i processi cellulari e le malattie umane. È stato riscontrato che la maggior parte dei geni identificati erano arricchiti nella via lipidica e dell'aterosclerosi, indicando che il meccanismo chiave attraverso il quale il SAL migliora la VC può coinvolgere la regolazione di cambiamenti anomali nei lipidi e nei fattori infiammatori (Figura 2).

Validazione dell'esperimento in vivo

Rispetto al gruppo Ctrl, i ratti del gruppo modello mostravano obesità, letargia e pelo opaco. I profili lipidici sierici hanno mostrato aumenti significativi dei livelli di TC, TG e LDL-C e una diminuzione di HDL-C nel gruppo modello (p < 0,05). Al contrario, i gruppi SAL-L, SAL-H e SIM hanno mostrato miglioramenti significativi in questi parametri, con un effetto dose-dipendente nei gruppi SAL (p < 0,05) (Figura 4).

La colorazione HE è stata utilizzata per identificare le alterazioni strutturali nell'aorta addominale del ratto, mentre la colorazione EVG ha valutato le condizioni delle fibre elastiche e la colorazione VK è stata impiegata per identificare i depositi di calcio. Nel gruppo di controllo, la colorazione HE ha delineato gli strati distinti del tessuto dell'aorta addominale e la colorazione EVG ha rivelato una disposizione ordinata delle fibre elastiche con interruzioni minime. I depositi di calcio non erano marcatamente presenti come per la colorazione VK. Al contrario, il gruppo modello presentava tessuto vascolare con iperplasia intimale e infiltrazione di cellule infiammatorie, insieme a un esteso disordine strutturale nello strato mediale. La distinzione tra fibre elastiche e cellule muscolari lisce era indistinta e le fibre erano disposte in modo irregolare, con calcificazioni necrotiche visibili. È stata osservata anche un'infiltrazione di linfociti avventiziali. La colorazione EVG in questo gruppo ha mostrato un pattern disordinato di fibre elastiche, con rotture estese, e la colorazione VK ha confermato sostanziali depositi di calcio.

Dopo l'intervento di SAL, è stato osservato un notevole miglioramento del danno vascolare da parte della VC. La colorazione HE ha indicato che i gruppi SAL-L e SAL-H avevano strutture dello strato vascolare ben definite, con una minima degenerazione delle cellule muscolari lisce nel terreno. Dopo la colorazione EVG, le fibre elastiche in entrambi i gruppi erano perfettamente allineate con poche interruzioni, con il gruppo SAL-H che superava il gruppo SAL-L. La colorazione VK non ha mostrato depositi significativi di calcio in entrambi i gruppi, suggerendo che SAL mitiga le alterazioni strutturali vascolari indotte da VC.

Dopo l'intervento della SIM, i cambiamenti strutturali vascolari rispecchiavano quelli del gruppo SAL-H. La colorazione HE ha dimostrato una chiara architettura dell'aorta addominale con una minima degenerazione delle cellule muscolari lisce nel terreno. La colorazione EVG ha confermato la disposizione ordinata delle fibre elastiche con poche interruzioni e la colorazione di Von Kossa non ha rilevato depositi di calcio significativi. Questi risultati suggeriscono che il gruppo SAL ha migliorato significativamente i sintomi avversi associati alla VC (Figura 5).

Sia i livelli di ione calcio (Ca²⁺) che di ALP erano significativamente elevati nel gruppo modello rispetto al gruppo Ctrl (p < 0,05). Tuttavia, questi livelli sono stati marcatamente diminuiti nei gruppi SAL-L e SAL-H, con il dosaggio più elevato di SAL che ha dimostrato un'efficacia superiore (Figura 6A, B). Inoltre, l'espressione della proteina morfogenetica ossea-2 (BMP2) è stata notevolmente migliorata nel gruppo modello (p < 0,001), mentre i gruppi SAL hanno mostrato una riduzione dell'espressione di BMP2 in misura variabile (p < 0,01) (Figura 6C). L'analisi dei fattori infiammatori ha rivelato una significativa sovraregolazione di TNF-α e IL-6 nel gruppo modello (p < 0,05), indicando una risposta infiammatoria dovuta a VC (Figura 6D-F). Dopo il trattamento con SAL, questi marcatori infiammatori sono diminuiti significativamente (p < 0,05), con risultati migliori nel gruppo SAL-H.

L'analisi dell'espressione proteica nel tessuto vascolare ha mostrato un aumento dei livelli di fosforilazione di JAK2, STAT3 e NF-κB p65 e una diminuzione dell'espressione di IκBα nel gruppo modello (p < 0,05). Entrambi i trattamenti con SAL-L e SAL-H hanno ridotto significativamente i livelli di fosforilazione di JAK2, STAT3 e NF-κB p65, aumentando al contempo l'espressione di IκBα, suggerendo che il salidroside mitiga la progressione di VC attraverso la via di segnalazione JAK2/STAT3 (Figura 7).

Questi risultati evidenziano i potenziali effetti terapeutici del SAL sulla VC, supportati dalla farmacologia di rete e dalla validazione in vivo , offrendo al contempo informazioni sui suoi possibili meccanismi d'azione.

Figura 1: Rete di interazione dei bersagli principali tra salidroside e calcificazione vascolare. (A) Il diagramma di flusso della rete di interazione dei bersagli principali tra salidroside e calcificazione vascolare. (B) Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione tra i bersagli del salidroside (viola) e i bersagli della calcificazione vascolare (verde). I bersagli che si intersecano sono indicati da un testo nero. (C) La potenziale rete di interazione target principale coinvolta negli effetti del salidroside sulla VC. (1) Primi 100 nodi adiacenti della rete PPI. Ogni nodo rappresenta una destinazione e ogni bordo rappresenta un'interazione tra le destinazioni. (2) Rete hub-geni (37 nodi identificati utilizzando il plugin CytoNCA). (3) Primi 20 nodi vicini della rete PPI. (4-6) Obiettivi chiave identificati in base ai criteri di grado, MCC e MNC utilizzando il plugin CytoHubba (10 nodi ciascuno). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati dell'analisi dell'arricchimento. (A) Arricchimento dei primi 20 termini GO. L'asse X rappresenta il fattore ricco e l'asse Y rappresenta i termini GO. La dimensione dei punti indica il numero di geni e il colore rappresenta -log₁₀ (valore P ), con il rosso che indica un valore P più piccolo. (B) Annotazione dell'arricchimento del percorso KEGG. L'asse X rappresenta il numero di geni e l'asse Y rappresenta diversi livelli di informazioni di annotazione. Colori diversi rappresentano varie categorie di annotazioni di primo livello. (C) Arricchimento dei percorsi Top 20. L'asse X rappresenta il fattore ricco e l'asse Y rappresenta i termini GO. La dimensione dei punti indica il numero di geni e il colore rappresenta -log₁₀ (valore P ), con il rosso che indica un valore P più piccolo. (D) Mappa delle vie lipidiche e aterosclerosi. Le caselle rosse indicano i potenziali bersagli dell'intervento del salidroside nella VC che sono arricchiti nella via dei lipidi e dell'aterosclerosi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Studio dell'effetto del salidroside sulla calcificazione vascolare nei ratti attraverso esperimenti in vivo . Diagramma di flusso del disegno sperimentale. I ratti Wistar sono stati utilizzati per un esperimento da 11w. Durante la prima settimana, i ratti sono stati acclimatati e poi divisi in modo casuale in cinque gruppi: Ctrl, Model, SAL-L, SAL-H e SIM per gli esperimenti successivi. Le settimane 1-9 hanno comportato l'alimentazione del gruppo Ctrl con una dieta normale (ND), mentre gli altri gruppi hanno ricevuto una dieta ricca di grassi (HFD) a partire da 8 settimane dopo una singola iniezione di 600.000 UI/kg VD3, seguita da iniezioni settimanali di 100.000 UI/kg VD3. Dalla settimana 9 alla 10, tutti i gruppi sono passati all'HFD (tranne il gruppo Ctrl), con i gruppi SAL-L e SAL-H che hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di salidroside a 5 mg/kg e 10 mg/kg, rispettivamente, mentre il gruppo SIM ha ricevuto Simvastatina a 5 mg/kg (n = 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Livelli sierici di lipidi nei ratti VC trattati con salidroside. I livelli siero-lipidici nei ratti VC sono stati misurati utilizzando metodi GPO-PAP a singolo reagente e metodi diretti a doppio reagente. (A) Livelli di TG (metodo GPO-PAP a singolo reagente). (B) Livelli di TC (metodo GPO-PAP a singolo reagente). (C) Livelli di HDL-C (metodo diretto a doppio reagente). (D) Livelli di LDL-C (metodo diretto a doppio reagente). Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 8). Rispetto al gruppo Ctrl, P < 0,001; rispetto al gruppo Modello, ^###P < 0.001, ^##P <0.01, ^#P < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Valutazione istologica del danno tissutale vascolare nei ratti VC. La colorazione HE è stata utilizzata per valutare il danno tissutale, con frecce rosse che indicavano calcificazione mediale e frecce verdi che indicavano infiltrazione linfocitaria nell'avventizia. I nuclei sono colorati di blu e il citoplasma è colorato di rosso. La colorazione EVG è stata utilizzata per osservare il danno alle fibre elastiche nell'aorta addominale, con frecce blu che indicavano aree di rottura e disorganizzazione delle fibre elastiche. Le fibre elastiche appaiono rosse e il muscolo appare rosso pallido. La colorazione VK è stata utilizzata per osservare la deposizione di calcio nell'aorta addominale, con aree arancioni che indicano depositi di calcio, che appaiono nere (Barre della scala: 100 μm, n = 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Espressione di marcatori di calcificazione ossea e citochine infiammatorie in ratti VC trattati con salidroside. (A) Attività ALP (un marcatore di calcificazione vascolare). (B) Contenuto di ioni calcio. (C) Espressione di BMP2 (Proteina Morfogenetica Ossea). (D) Espressione di IL-6 (citochina pro-infiammatoria). (E) Espressione del TNF-α (citochina pro-infiammatoria). (F) Espressione di IL-1β (citochina pro-infiammatoria). Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 8). Rispetto al gruppo Ctrl, P < 0,001, ^**P < 0,01; rispetto al gruppo Modello, ^###P < 0,001, ^##P < 0,01, ^#P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Analisi Western blot dell'espressione proteica chiave in ratti VC trattati con salidroside. (A) Analisi Western blot dei livelli di espressione delle proteine p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65 e IκBα. (b) Espressione proteica relativa di P-JAK2/JAK2 in diversi gruppi. (C) Espressione proteica relativa di p-NF-κB p65, NF-κB p65 in diversi gruppi. (d) Espressione proteica relativa di IκBα in diversi gruppi.  (e) Espressione proteica relativa di P-STAT3/STAT3 in diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 8). Rispetto al gruppo Ctrl, P < 0,001; rispetto al gruppo di modelli, ^###P < 0.001, ^##P < 0.01, ^#P < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Proposta di meccanismo molecolare dell'intervento del salidroside nei ratti VC. Il meccanismo molecolare proposto attraverso il quale il salidroside interviene nella VC coinvolge l'inibizione di fattori lipidici e citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α). Salidroside sopprime l'attivazione di IκBα e la fosforilazione di JAK2, inibendo così la via infiammatoria-immunitaria NF-κB/STAT3. In ultima analisi, ciò riduce il danno tissutale vascolare associato alla progressione delle VC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Informazioni sul database farmacologico di rete. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Componenti di SDS-PAGE (per 1 campione). Clicca qui per scaricare questo file.

La VC è caratterizzata da alterazioni degenerative delle cellule e dei tessuti vascolari, con depositi minerali patologici all'interno dei vasi sanguigni che portano all'irrigidimento delle pareti dei vasi o alla formazione di placche aterosclerotiche, che possono provocare malattie vascolari ostruttive²⁵. Gli studi dimostrano che circa l'85% delle placche VC può evolvere in trombosi, che può scatenare episodi cardiovascolari acuti. Inoltre, la VC è un indicatore cruciale di potenziali eventi cardiovascolari acuti, ictus e malattie vascolari periferiche²⁶. Gli attuali metodi di trattamento si concentrano principalmente su anticoagulanti, farmaci ipolipemizzanti e regolazione della tensione vascolare, ma questi approcci hanno spesso un'efficacia e effetti collaterali limitati, in particolare nelle fasi avanzate della calcificazione.

Il salidroside (SAL), un composto identificato come p-idrossifenetil-beta-D-glucopiranoside, ha dimostrato un significativo potenziale terapeutico in varie condizioni vascolari che colpiscono il sistema nervoso, cardiovascolare e immunitario, nonché nelle malattie renali croniche^27,28. La ricerca moderna ha confermato i suoi effetti antiossidanti, anti-invecchiamento, immunomodulatori e antinfiammatori 29,30,31. Il salidroside migliora notevolmente la funzione endoteliale e migliora l'elasticità dei vasi sanguigni inibendo i vasocostrittori e promuovendo i vasodilatatori³². L'elasticità dei vasi sanguigni riflette direttamente i cambiamenti successivi alla calcificazione, dove una perdita di elasticità spesso accompagna la degradazione delle proteine elastiche, danneggiando gli strati interni e medi dei vasi sanguigni. Questo danno si manifesta spesso come l'attivazione di cellule infiammatorie. Numerosi studi evidenziano la stretta associazione tra VC e infiammazione. L'infiammazione cronica è vista come un fattore chiave della calcificazione ectopica, in cui le cellule pro-infiammatorie proliferano e rilasciano fattori che contribuiscono alla VC attraverso molteplici percorsi 33,34,35,36. Il potenziale del salidroside come agente terapeutico multi-target è particolarmente rilevante dato che la calcificazione vascolare è un processo patologico complesso che coinvolge infiammazione, metabolismo lipidico e stress ossidativo. L'approccio multi-target del salidroside, che inibisce le vie infiammatorie regolando l'accumulo di lipidi e lo stress ossidativo, presenta un netto vantaggio rispetto ai farmaci a bersaglio singolo attualmente in uso. Pertanto, in questo studio, l'espressione del fattore infiammatorio sarà esaminata per indagare ulteriormente se il salidroside influenza VC riducendo l'infiammazione.

Il concetto di farmacologia di rete, introdotto da Hopkins nel 2007, prevede l'utilizzo di approcci basati su reti per esaminare come farmaci, malattie e bersagli interagiscono tra più componenti, bersagli e percorsi³⁷. In questo studio, la farmacologia di rete è stata impiegata per prevedere come il SAL interagisce con VC, individuando bersagli cruciali come IL6, STAT3, TNF, TP53 e ALB. I risultati hanno indicato una concentrazione di questi geni nel metabolismo dei lipidi e nelle vie dell'aterosclerosi, suggerendo che la VC può essere collegata all'accumulo di lipidi e all'infiammazione nelle arterie. Per verificare queste previsioni, è stato utilizzato un modello di ratto di VC indotta da una dieta ricca di grassi combinata con VD3. Questo modello ha permesso di esplorare ulteriormente l'impatto del SAL sul VC. I risultati hanno rivelato che la VC ha aumentato i livelli di TC, TG e LDL-C mentre ha abbassato l'HDL-C. Inoltre, il SAL a dosi diverse ha dimostrato effetti variabili nella regolazione di questi indicatori anomali. Ulteriori risultati della ricerca hanno indicato che il SAL ha ridotto efficacemente la deposizione di calcio nell'aorta addominale, ha corretto i livelli anormali di ioni calcio e ha diminuito l'infiltrazione di cellule infiammatorie, riducendo contemporaneamente l'espressione di marcatori correlati alla calcificazione come ALP e BMP2.

La via JAK/STAT svolge un ruolo cruciale in vari processi di crescita e segnalazione, regolando le risposte immunitarie e la differenziazione cellulare, il che la rende parte integrante delle risposte infiammatorie³⁸. STAT3, attivato da IL-6, fa parte di una risposta di fase acuta, con IL-6 che induce la fosforilazione di JAK, che a sua volta fosforila STAT3. Questa attivazione controlla l'espressione genica correlata alla crescita, alla differenziazione e alla sopravvivenza cellulare. La fosforilazione persistente di STAT3 è stata associata a malattie vascolari e può portare a un'espressione anomala di molecole di adesione, che nei primi stadi di VC facilita l'adesione dei monociti all'intima vascolare, danneggiando ulteriormente la struttura vascolare^39,40. I risultati sperimentali mostrano che SAL inibisce l'espressione di JAK2, STAT3 e NF-κB p65 fosforilati, promuovendo al contempo l'espressione di IκBα, suggerendo che il ruolo di SAL nell'inibire la progressione di VC è mediato dalla via di segnalazione IL-6/JAK2/STAT3 (Figura 8).

In questo studio, la farmacologia di rete ha predetto con successo i meccanismi chiave coinvolti nella progressione della VC, identificando i bersagli e le vie attraverso le quali interviene la SAL. I parallelismi fisiologici e patologici tra i sistemi di ratto e quelli umani rendono i modelli di ratto particolarmente preziosi per la ricerca clinica in futuro. Inoltre, i ratti sono economici e facili da maneggiare, il che li rende adatti alla ricerca sulle malattie e alla scoperta di farmaci. Nonostante i vantaggi dei modelli animali, ci sono dei limiti. I modelli di ratto, sebbene utili, non possono catturare completamente la complessità dello sviluppo del VC negli esseri umani. Gli studi futuri dovrebbero coinvolgere modelli più diversificati e considerare fattori come le comorbidità e i diversi background dei pazienti.

Tuttavia, questo studio presenta diverse limitazioni. Il periodo sperimentale è stato di 10 settimane, durante le quali i ratti sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi (HFD) con una dose iniziale elevata seguita da dosi multiple più basse di VD3 per indurre VC. L'alto tasso di mortalità osservato nel modello di ratto è stato notato per la prima volta durante gli esperimenti preliminari, dove è stato riscontrato che dosi elevate e prolungate di VD3 hanno ridotto significativamente i tassi di sopravvivenza del ratto, influenzando in ultima analisi la qualità e la tempistica dell'esperimento. Ciò sottolinea la necessità di ottimizzare il modello per migliorare i tassi di sopravvivenza e ottenere dati più robusti. Sebbene questo studio abbia confermato gli effetti del SAL sulla VC nei ratti, la complessità della VC e il suo processo di sviluppo prolungato significano che un singolo studio su un animale potrebbe non catturare completamente la sua fisiopatologia. Gli studi futuri dovrebbero concentrarsi sul perfezionamento del modello per migliorare i tassi di sopravvivenza dei ratti. Inoltre, mentre gli esperimenti in vivo hanno dimostrato che il SAL riduce la VC modulando i fattori infiammatori attraverso la via JAK2/STAT3, ulteriori studi dovrebbero esplorare i bersagli a monte e a valle in vitro. Infine, gli studi clinici sul SAL sono limitati e sono necessarie ulteriori ricerche per valutarne l'efficacia e la sicurezza nell'uomo. La VC è associata a molteplici condizioni, tra cui la malattia renale cronica, le malattie cerebrovascolari e l'aterosclerosi coronarica. Questo studio ha stabilito con successo un modello VC che può essere ulteriormente utilizzato per esplorare trattamenti per le condizioni vascolari. Il disegno sperimentale e le tecniche utilizzate qui forniscono anche una base preziosa per la scoperta di farmaci relativi alla VC.

In sintesi, questo studio ha utilizzato la farmacologia di rete e la biologia molecolare per studiare l'effetto del salidroside sulla calcificazione vascolare. I risultati mostrano che il SAL inibisce la VC riducendo l'infiammazione, abbassando l'espressione del fattore lipidico e diminuendo i marcatori VC attraverso la via JAK2/STAT3, suggerendo un approccio terapeutico promettente per il trattamento della VC.

Assicurati che tutti gli autori abbiano divulgato tutti i conflitti di interesse.

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Progetto del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia di Jilin (YDZJ202301ZYTS460) e dal Progetto del Dipartimento Provinciale dell'Istruzione di Jilin (JJKH20230991KJ).