הערכת סלידרוזיד כסוכן טיפולי להסתיידות כלי דם באמצעות פרמקולוגיה של רשת ומודלים ניסיוניים של חולדות

מחקר זה מבסס מודל חולדה של הסתיידות כלי דם הנגרמת על ידי תזונה עתירת שומן (HFD) בשילוב עם ויטמין D3 (VD3). המודל שימש להערכת היעילות הטיפולית של סלידרוסיד במניעה וטיפול בהסתיידות כלי הדם, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הפעולה הפוטנציאליים שלו באמצעות פרמקולוגיה ברשת וניסויים in vivo .

הסתיידות כלי דם (VC) היא מצב פתולוגי קריטי הקשור לתחלואה ותמותה משמעותית. מחקר זה משתמש בגישה היברידית של פרמקולוגיה של רשת וביולוגיה מולקולרית כדי לתאר את המנגנונים הטיפוליים של סלידרוסיד (SAL), תרכובת פעילה מרודיולה קרנולאטה, כנגד VC. באמצעות כריית מסדי נתונים וניתוח רשתות, זוהו 388 מטרות SAL המצטלבות עם 2871 מטרות הקשורות ל-VC, וכתוצאה מכך 208 מטרות משותפות. רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) שנבנתה באמצעות מסד הנתונים של String וניתוח טופולוגי ב-Cytoscape 3.9.1 איתרה 10 מטרות מפתח, כולל IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 ו-STAT3, בין היתר. הגנים שזוהו התרכזו במסלולי השומנים וטרשת העורקים, מה שמצביע על כך שהשיפור ב-VC על ידי SAL עשוי להתרחש באמצעות ויסות ביטוי חריג של גורמים ליפידים ודלקתיים. כמו כן, נמצא כי SAL מעכב את הביטוי החריג של גורמים דלקתיים, ובכך מפעיל את מסלול JAK2/STAT3 כדי להתערב בהתקדמות VC. מסלול JAK2/STAT3 הוא מנגנון מולקולרי מרכזי שבאמצעותו SAL מונע הידרדרות נוספת של VC. ניתוחי העשרה פונקציונליים חשפו את המעורבות של מטרות אלה בתגובות דלקתיות ובמטבוליזם של שומנים, מסלולים מרכזיים ב-VC. מחקרי in vivo בחולדות הראו את היעילות של SAL בהפחתת דיסליפידמיה ודלקת בכלי הדם, עם שיפור פרופילי השומנים בסרום ושקיעת סידן מופחתת בכלי הדם. המחקר המכניסטי, המבוסס על ניתוח כתמים מערביים, הדגים את יכולתו של סלידרוסיד לווסת את מסלול האיתות JAK2/STAT3, להדגיש את הפוטנציאל שלו כמודולטור במנגנון מולקולרי קריטי זה ולהציע מטרה טיפולית פוטנציאלית ל-VC. כוחו של מחקר זה טמון בקפדנות המתודולוגית שלו, המשלב תחזיות חישוביות עם אימות in vivo . גישה מקיפה זו מבססת מסגרת איתנה לחקר המנגנונים הטיפוליים של תרכובות טבעיות במאבק ב-VC.

הסתיידות כלי דם (VC) מתייחסת לשקיעה לא תקינה של סידן בתוך דפנות כלי הדם, מה שמוביל להתקשות העורקים ולירידה בגמישות, ובסופו של דבר פוגע בתפקוד כלי הדם. באופן מסורתי, VC חולק לשני סוגים: הסתיידות אינטימית, הקשורה להצטברות שומנים, והסתיידות מדיאלית. הראשון קשור קשר הדוק לחדירה דלקתית, המעוררת טרנספורמציה אוסטאוגנית בדופן כלי הדם, המאופיינת בהגירה, התפשטות והתמיינות של תאי שריר חלק בכלי הדם (VSMCs) לתאים דמויי אוסטאובלסטים¹.

היכולת של VSMCs לעבור התמיינות אוסטאוגנית, המושפעת מגורמים כמו הזדקנות, גנטיקה ותנאים סביבתיים כמו סוכרת ומחלת כליות כרונית, היא תורמת מרכזית ל-VC הקשור לגיל. טרנספורמציה דמוית אוסטאובלסטים זו מחמירה הסתיידות וניוון עורקים¹.

VC הוא מצב רב-פנים, המונע על ידי שינויים ניווניים, חוסר איזון מטבולי ומצבים מערכתיים שונים. כ-80% מהפגיעות בכלי הדם ו-90% ממקרי מחלת העורקים הכליליים מציגים VC, מה שמגדיל משמעותית את הסיכון לאירועים קרדיווסקולריים חמורים ^1,2. לכן, יש צורך דחוף לגלות טיפולים תרופתיים המקלים או הופכים ביעילות מצב זה.

נכון לעכשיו, אסטרטגיות הטיפול ב-VC כוללות התערבויות פרמקולוגיות שונות, אם כי אין תרופות שתוכננו במיוחד למטרה זו. עבור חולים עם הסתיידות קלה, סטטינים נרשמים לעתים קרובות לייצוב פלאק. עם זאת, בעוד שהם עשויים להפחית את היצרות העורקים הכליליים על ידי הורדת רמות השומנים, השפעתם על ההסתיידות מוגבלת².

בהתחשב במורכבות של טרשת עורקים, חולים רבים מציגים הפעלת טסיות מוגברת, מה שמחייב שימוש בתרופות נוגדות טסיות כמו אספירין או קלופידוגרל כדי לעכב הצטברות טסיות ולהפחית את הסיכון לפקקת. עם זאת, טיפול באספירין מועיל רק לאנשים עם ציון סידן גבוה בעורקים הכליליים וסיכון נמוך לדימום³.

בנוסף, מחקרים על תוספי מזון, כמו ויטמין K, מצביעים על פוטנציאל למניעת התקדמות VC⁴. במקרים חמורים, ניתן לשקול התערבויות פולשניות, אם כי לרוב הן אינן מתאימות ל-VC⁵ נרחב. עבור אנשים ללא VC קיים, ניהול גורמי סיכון, כגון לחץ דם, פרופילי שומנים ובחירות אורח חיים, נותר קריטי⁶.

ברפואה הסינית משתמשים ברודיולה קרנולטה (Rhodiola crenulata), צמח רב-שנתי ממשפחת הקרסוליים. המרכיב הביו-אקטיבי העיקרי שלו, סלידרוסיד, זוכה לתשומת לב משמעותית בשל פעילותו הביולוגית הבולטת. סלידרוזיד ידוע ביכולתו לעכב אפופטוזיס, להפגין תכונות נוגדות חמצון חזקות ובעל תכונות אנטי דלקתיות ^7,8. תכונות אלו תורמות לפוטנציאל שלו לשפר את תפקוד כלי הדם, לעכב את הזדקנות כלי הדם ולהגן על האנדותל של כלי הדם. כסוכן טיפולי פוטנציאלי ל-VC, לסלידרוזיד יש ערך משמעותי למחקר. עם זאת, המנגנונים המדויקים שבאמצעותם סלידרוסיד משפר VC עדיין לא ברורים במלואם ומצדיקים חקירה נוספת כדי לרתום את הפוטנציאל הטיפולי שלו לטיפול ב-VC.

כדי לחקור מנגנונים אלה, מחקר זה ממנף פרמקולוגיה רשתית, מתודולוגיה חדשנית המשלבת פרמקולוגיה, ביואינפורמטיקה ומדעי המחשב כדי לנתח מערכות ביולוגיות ולהבהיר מנגנוני תרופות. בהשוואה למחקר מסורתי של תרופות למטרה אחת, פרמקולוגיה של רשת מציעה גישה מקיפה יותר על ידי ניתוח השפעות התרופה על מטרות ביולוגיות ומסלולי איתות מרובים. ככלי מרכזי בפיתוח תרופות מודרניות, הוא בונה רשתות של תרופות, מטרות ומסלולים כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של פעולת התרופות ^9,10. למרות השימוש הנרחב בו בחקר מנגנונים טיפוליים, היה מחקר מוגבל על המנגנונים האינטראקטיביים בין סלידרוסיד ו-VC מנקודות מבט של ביואינפורמטיקה ופרמקולוגיה רשתית.

מחקר זה בונה מפת רשת מולקולרית של ההשפעה הפוטנציאלית של סלידרוסיד על VC על ידי זיהוי וניתוח מטרות מפתח באמצעות כריית מסדי נתונים נרחבים. נוצרת רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), וניתוח טופולוגי מיושם כדי להדגיש צמתים קריטיים בתהליך ההסתיידות.

כדי לאשר את התחזיות החישוביות, פותח מודל חולדה של VC על ידי מתן תזונה עתירת שומן עם ויטמין D3 (VD3). מודל זה משכפל את המאפיינים הפתולוגיים של קרנות הון סיכון אנושיות. פגיעה בכלי הדם מוערכת באמצעות טכניקות היסטולוגיות, פרופילי שומנים בסרום וסמני דלקת מוערכים כדי לחקור את ההשפעות המערכתיות של סלידרוסיד, והביטוי של חלבונים הקשורים ל-SAL anti-VC נמדד באמצעות Western Blotting כדי לחקור את ההשפעה של סלידרוסיד על VC המושרה בניסוי, מחקר זה נועד לתרום תובנות חשובות לגבי הפוטנציאל של תרכובת זו כאסטרטגיה טיפולית למאבק ב-VC.

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת חיות הניסוי של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית (אישור מס' 2023091). מחקר זה מקפיד על הנחיות בינלאומיות, כולל הנחיות הקהילה האירופית והנחיית EEC משנת 1986, המבטיחות טיפול אתי בבעלי חיים לאורך כל המחקר. חולדות וויסטאר זכרות (8-10 שבועות, משקל 200-220 גרם) שימשו למחקר. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. חיזוי פרמקולוגיה ברשת של מטרות פוטנציאליות של סלידרוסיד-VC

הערה: פרמקולוגיה של רשת משתמשת בשיטות חישוביות וניתוח נתונים בקנה מידה גדול כדי לחקור את האינטראקציות המורכבות בין מולקולות תרופות ומטרות ביולוגיות כגון מסלולים, גנים וחלבונים בתוך אורגניזם^11,12. גישה זו מסייעת לפענח את הפונקציות הביולוגיות והיחסים של הישויות הנחקרות. המתודולוגיה כוללת שימוש במאגרי מידע, עיבוד מידע כימי, רכישת נתונים ביו-אקטיביים, אחזור נתוני חלבון, ניתוח פרופילי ביטוי גנים, בניית רשתות אינטראקציה וניתוח העשרה של מסלולים¹¹. איור 1 מציג את רשת האינטראקציה של מטרות הליבה בין סלידרוסיד להסתיידות כלי הדם.

1. בניית מסד הנתונים של היעד "מרכיבים"
   1. השתמש ב-"Salidroside" כמילת המפתח למרכיבים לחיפוש במאגרי מידע¹³ (ראה טבלה משלימה 1), כגון HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA ו-STITCH.
   2. סקירת ספרות רלוונטית לזיהוי מטרות הקשורות לסלידרוזיד, כאשר המינים מוגדרים להומו ספיינס. לאחר הסרת כפילויות, תקנן את חלבוני המטרה באמצעות UniProt (ראה טבלה משלימה 1) והקים מסד נתונים מקיף של יעד Salidroside¹⁴.
2. בניית מסד הנתונים של מטרות "מחלות"
   1. השתמש ב"הסתיידות כלי דם" כמילת המפתח לחיפוש במאגרי מידע¹⁵ (ראה טבלה משלימה 1), כולל GeneCards, OMIM, PharmGkb ו-DrugBank, כאשר המינים מוגדרים כהומו ספיינס. לאחר ביטול הכפילויות, צור מסד נתונים של יעד הסתיידות כלי דם.
3. חיזוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות
   1. הזן את היעדים עבור סלידרוסיד והסתיידות כלי דם (ראה טבלה משלימה 1) כדי לזהות מטרות נפוצות. צור דיאגרמת ון כדי לדמיין את המטרות הטיפוליות הפוטנציאליות לסלידרוסיד בטיפול בהסתיידות כלי הדם.
4. בניית רשת "הסתיידות חלבון-כלי דם" (PPI)
   1. אספו את המטרות הפוטנציאליות לרשימת חלבונים מרובים ונתחו אותן באמצעות STRING (ראו טבלה משלימה 1), כאשר האורגניזם מוגדר להומו ספיינס וציון האינטראקציה מוגדר לביטחון בינוני (>0.4)¹⁶. חלץ את נתוני ה- PPI בפורמט TSV להמשך ניתוח.
      הערה: בהתחשב בכך ש-85% מהגנים של חולדות הם הומולוגיים לגנים אנושיים, ומבצעים פונקציות ביולוגיות דומות, חולדות נבחרו כנבדקים ניסיוניים לאימות ההשפעות של סלידרוסיד על הסתיידות כלי דם¹⁷.
5. בחירה ובניית רשת של יעדי מפתח
   1. ייבא את נתוני רשת ה-PPI ל-Cytoscape 3.9.1 (ראה טבלה משלימה 1) לניתוח באמצעות התוסף CytoNCA כדי להעריך פרמטרים כגון בין (BC), קרבה (CC), תואר (DC), וקטור עצמי (EC), קישוריות ממוצעת מקומית (LAC) ומרכזיות רשת (NC). בחר יעדי מפתח עם CC=1 כדי לבנות מפת ספקטרום פעולת יעד ליבה עבור 'SAL-VC'.
   2. השתמש בתוסף CytoHubba כדי לזהות את 10 הגנים המרכזיים המובילים על סמך מרכזיות מקסימלית של קליקה (MCC), רכיב שכונה מקסימלי (MNC) וחישובי מעלות, ויצירת מפת ספקטרום גנים של Hub.
6. ניתוח העשרה במסלולי GO ו-KEGG
   1. בצע המרת מזהה גן באמצעות DAVID (ראה טבלה משלימה 1), ובחר ENSEMBL_GENE_ID עבור סוג הגן -9606 למידע על מינים. נתח את רשימת הגנים שהומרו באמצעות Omicshare (ראה טבלה משלימה 1) להעשרה פונקציונלית של GO ומסלול KEGG, עם מובהקות מוגדרת בערך P < 0.05¹⁸.
      הערה: ניתוח פונקציונלי של GO כולל תפקוד מולקולרי (MF), תהליך ביולוגי (BP) ורכיב סלולרי (CC). ניתוח מסלול KEGG כולל העשרת מסלול והעשרת סיווג מסלולים¹⁹. תוצאות ניתוח ההעשרה מתוארות באיור 2.

2. ניסויים בבעלי חיים

1. התאקלמות
   1. התאקלמו בחולדות Wistar בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. ודא שיש להם גישה חופשית למזון ומים כדי לשמור על בריאותם לפני תחילת הניסויים. בצע האכלה אדפטיבית למשך שבוע.
2. הקמת מודל
   1. התאקלמו את החולדות לתנאי הסביבה והקצו אותן באופן אקראי לחמש קבוצות: קבוצת ביקורת (Ctrl, ND + רכב), קבוצת מודל (דגם, HFD + רכב), קבוצת מינון נמוך SAL (SAL-L, HFD + SAL 5 מ"ג/ק"ג), קבוצת מינון גבוה SAL (SAL-H, HFD + SAL 10 מ"ג/ק"ג) וקבוצת סימבסטטין (SIM) (HFD + SIM 5 מ"ג/ק"ג).
   2. תנו דיאטה רגילה (ND) לקבוצת Ctrl ודיאטה עתירת שומן (HFD) לקבוצות הנותרות למשך כל הניסוי. ביום הראשון למתן HFD, יש להזריק מנה תת עורית אחת של 600,000 IU/kg VD3 לכל הקבוצות למעט קבוצת Ctrl^20,21. לאחר מכן יש ליטול זריקות תת-עוריות שבועיות של 100,000 יחב"ל/ק"ג VD3 במשך 8 השבועות הבאים (איור 3).
   3. עקוב אחר מצב הבריאות וההישרדות של בעלי החיים מדי יום. התחל התערבויות ניסיוניות בשבוע התשיעי.
   4. המתת חסד של בעלי החיים בסיום המחקר (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אספו דגימות סרום, אפשרו להן לעמוד במשך 30 דקות, וצנטריפוגה כדי לבודד את הסרום (בעקבות דיווחים שפורסמו בעבר^20,21). יש לנתח רקמות כלי דם (אבי העורקים הבטני), ולשטוף במי מלח עם פוספט (PBS) כדי להסיר דם.
   5. תקן חלק אחד של הרקמה ב-4% פרפורמלדהיד לבדיקה היסטולוגית ואחסן חלק אחר בחנקן נוזלי לניתוח מולקולרי.
      הערה: יש לדלל סלידרוסיד במים חמים לפני השימוש.

3. הערכת פגיעה ברקמות כלי הדם באמצעות צביעת HE, VK, EVG

הערה: תקן רקמת כלי דם (אבי העורקים הבטני) ב-4% פרפורמלדהיד, מיובש באתנול לאחר 48 שעות, ומוטבע בפרפין. חותכים את גושי הפרפין המוטבעים לפרוסות של 5 מיקרומטר לצביעה של המטוקסילין-אאוזין (HE), אלסטיקה ואן גיסון (EVG) ופון-קוסה (VK), ומתבוננים במורפולוגיה ההיסטולוגית תחת מיקרוסקופ אור. צביעת HE משמשת להערכת שינויים במורפולוגיה של הרקמות. ברקמת כלי הדם, הוא מדגיש שינויים מבניים בדופן כלי הדם, כולל התפשטות תאי שריר חלק, סידור תאים לא מאורגן ודלקת. צביעת EVG מדמיינת סיבים אלסטיים וקולגן, החיוניים להערכת נזק לסיבים אלסטיים או שיפוץ ברקמת כלי הדם ומסייעים בהבנת השפעת ההסתיידות על גמישות כלי הדם. צביעת VK מזהה משקעי סידן, תכונה מרכזית ב-VC, מה שהופך אותה לקריטית להערכת היקף והתפלגות ההסתיידות ברקמת כלי הדם^22,23.

1. צביעת HE לזיהוי נזק לרקמות כלי הדם
   1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. הפחת חלקים בשני שינויים של קסילן למשך 8 דקות כל אחד והתייבש מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 85%, 75%) למשך 3 דקות לכל שלב. לאחר מכן יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 2 דקות.
   2. מכתים המטוקסילין
      1. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5-10 דקות ושוטפים להסרת כתמים עודפים, ולאחר מכן שוטפים במי ברז זורמים.
         הערה: מומלץ כתם בהיר של 5 דקות כדי למנוע כתמים כהים מדי, שעלולים להשפיע על הצבע הציטופלזמי.
   3. בידול
      1. הבדיל בין החלקים בתמיסת בידול למשך 30 שניות, ולאחר מכן שתי שטיפות במי ברז למשך 3 דקות כל אחת.
   4. צביעה נגדית של אאוזין
      1. מניחים את החלקים בכתם אאוסין למשך דקה. לאחר הסרת הכתם העודף, בצע התייבשות מהירה.
   5. התייבשות, הבהרה והרכבה
      1. להתייבשות מהירה, טבלו את החלקים ב-75%, 85%, 95% ו-100% אתנול למשך 3 שניות כל אחד, ולאחר מכן 100% אתנול למשך דקה.
         הערה: התייבשות מהירה מומלצת מכיוון שאאוזין עלול לאבד צבע במים ובשיפועי אתנול.
2. צביעת VK לזיהוי סידן
   1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. בצע שלב זה לאחר שלב 3.1.1.
   2. תגובת כסף חנקתי
      1. כתם את החלקים יבשים, מתאר בעזרת מברשת עדינה וצבוע עם פון קוסה (ראה טבלת חומרים). חשפו אותם לאור אולטרה סגול למשך 4 שעות, ולאחר מכן שטפו היטב במי ברז זורמים.
   3. צביעה נגדית עם המטוקסילין
      1. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות, שוטפים במי ברז זורמים, מבדילים ושוטפים שוב, ולאחר מכן שוטפים מי ברז זורמים.
   4. צביעה נגדית של אאוזין
      1. ייבשו את החלקים באמצעות אתנול מדורג (85% ו-95% למשך 5 דקות כל אחד), ולאחר מכן צבעו באאוזין למשך 5 דקות.
   5. התייבשות והרכבה
      1. ייבשו את החלקים באמבטיות אתנול (100% אתנול I, II, III למשך 5 דקות כל אחד) והבהירו באמבטיות קסילן (קסילן I ו-II למשך 5 דקות כל אחת). לאחר מכן, הרכיבו את החלקים עם בלסם ניטרלי.
   6. בדיקה מיקרוסקופית ולכידת תמונות
      1. בחנו את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור וצלמו תמונות לניתוח.
         הערה: ודא שמשקעי הסידן נראים חומים-שחורים עד שחורים כהים, הגרעינים כחולים והרקע אדום. הכן את תמיסת חנקת הכסף להכתמת VK טרייה מיד לפני השימוש.
3. צביעת EVG לסיבי אלסטיות וקולגן
   1. דה-פרפיניזציה והחזרת נוזלים
      1. טפלו בקטעי הפרפין בחום למשך 50 דקות, ולאחר מכן טבלו אותם בקסילן למשך 20 דקות להסרת פרפין. המשך על ידי הכפפת החלקים לסדרת אתנול מדורגת (100%, 95%, 85%, 75%) למשך 5 דקות כל אחד, ומסתיים בשטיפה במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
   2. צביעת EVG
      1. מרחו את תמיסת הצביעה EVG (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו לזמן קצר במי ברז זורמים למשך 5 שניות כדי להסיר כתמים עודפים.
      2. לאחר מכן, יש למרוח את תמיסת העבודה של Verhoeff (ראה טבלת חומרים) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטיפה קצרה נוספת במי ברז זורמים למשך 5 שניות. יש למרוח את תמיסת ההבחנה של Verhoeff למשך 5 שניות עד שסיבי האלסטין נראים בבירור, ולאחר מכן לשטוף במי ברז זורמים למשך 5 שניות.
         הערה: מערבבים את הרכיבים A, B ו-C (מסופקים בערכה הזמינה מסחרית) ביחס של 5:2:2 כדי להכין את פתרון העבודה של Verhoeff לפני השימוש. השתמש בתמיסה תוך שעתיים וחדש לפי הצורך במהלך תהליך הצביעה כדי למנוע התייבשות של החלקים.
   3. התייבשות והרכבה
      1. יבש את החלקים באמצעות סדרת אתנול מדורגת (75%, 85%, 95% ו-100%) למשך 5 שניות כל אחד, ולאחר מכן הבהרה בשני שינויים של קסילן למשך דקה אחת כל אחד. לאחר תקופת ייבוש אוויר קצרה, הרכיבו את החלקים עם בלסם ניטרלי.
   4. בדיקה מיקרוסקופית וניתוח תמונה
      1. בחן את החלקים המוכתמים במיקרוסקופ אור כדי להמחיש סיבי אלסטיות וקולגן, וצלם תמונות לניתוח לאחר מכן.

4. בדיקת פוספטאז אלקליין (ALP).

הערה: השתמש ב-ALP כאינדיקטור מרכזי להערכת היעילות של טיפולים נגד הסתיידות.

1. הכנת ריאגנטים
   1. ממיסים את המצע מפתח הצבע במאגר קרבונט קר כקרח של 0.05 M pH 9.6 לנפח סופי של 2.5 מ"ל.
      הערה: הכן את המאגר על ידי המסת 1.59 גרם נתרן פחמתי ו-2.93 גרם נתרן ביקרבונט ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים כפולים.
2. דילול מצע
   1. יש לדלל 10 מיקרוליטר של תמיסת p-nitrophenol (10 מ"מ) עם 0.05 מ"מ pH 9.6 מאגר קרבונט לנפח סופי של 0.2 מ"ל כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
3. הכנת מדגם
   1. הומוגניזציה של אבי העורקים הבטני במאגר ליזה. צנטריפוגה את ההומוגנאט (~12,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) ואוספים את הסופרנטנט לזיהוי פעילות ALP.
      הערה: ודא שמאגר הליזיס נקי ממעכבי פוספטאז. אחסן דגימות בדיקה ממתינות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
4. הכנת מיקרופלייט לבדיקה
   1. הכן צלחת של 96 בארות עם בארות ריקות, סטנדרטיות ודוגמאות. הוסף 50 מיקרוליטר של התמיסה הסטנדרטית לבארות סטנדרטיות ו-50 מיקרוליטר של דגימות בדיקה ממתינות לדגימת בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. סיום תגובה ומדידת ספיגה
   1. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה. מדוד את הספיגה ב-405 ננומטר וחשב את פעילות ה-ALP על סמך ערכי הספיגה (בהתאם להוראות היצרן, ראה טבלת חומרים).
      הערה: בארות המכילות את התקן או דגימות עם פעילות ALP יציגו גוונים שונים של צהוב. הצבע יציב עד שעתיים.

5. קביעת תכולת סידן

הערה: קביעת תכולת הסידן היא קריטית להערכת מידת המינרליזציה ברקמות ביולוגיות.

1. הכנת רקמות
   1. טוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות והופכים להומוגניזציה במאגר ליזה.
2. דילול וצנטריפוגה לדוגמא
   1. מדללים את הרקמה במאגר ליזה ביחס של 1:10. הומוגניזציה של התערובת והצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 12,000 x גרם למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט לניתוח.
      הערה: הכן דילולים סטנדרטיים של סידן (0-1.0 מ"מ) באמצעות תמיסה סטנדרטית של סידן של 5 מ"מ (ראה טבלת חומרים).
3. הגדרת צלחת ודגירה
   1. הוסף 50 מיקרוליטר של דגימות סטנדרטיות או בדיקה לכל באר של צלחת של 96 בארות. מוסיפים 150 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לבדיקה, מערבבים היטב ודוגרים את הצלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב-575 ננומטר ובנה עקומה סטנדרטית.
4. חישוב תכולת הסידן
   1. חשב את תכולת הסידן באמצעות העקומה הסטנדרטית, תוך שילוב גורם הדילול, נפח הדגימה והמשקל האטומי של הסידן.

6. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA) לציטוקינים דלקתיים (IL-6, TNF-α, IL-1β)

הערה: IL-6, IL-1β ו-TNF-α הם ציטוקינים מעודדי דלקת מרכזיים המעידים על נוכחות וחומרה של תגובה דלקתית. מדידת הציטוקינים הללו חיונית להבנת התהליך הדלקתי ולהערכת יעילותם של טיפולים אנטי דלקתיים.

1. איסוף דוגמאות
   1. יש לאסוף נסיוב מאבי העורקים הבטני של החולדה. הניחו לו להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. צנטריפוגה את הדגימה ב-3,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנטנט.
2. הכנת מיקרופלייט לבדיקה
   1. הכן צלחת של 96 בארות עם בארות המיועדות לתקנים ודגימות בדיקה. הוסף 50 מיקרוליטר של תקנים (ראה טבלת חומרים) בריכוזים משתנים לבארות המתאימות.
3. הכנת מדגם
   1. הוסף 40 מיקרוליטר של מדלל דגימה לכל באר המיועדת לדגימות בדיקה. הוסף 10 מיקרוליטר מהדגימה לאותן בארות, וכתוצאה מכך דילול פי 5.
4. דגירה עם ריאגנטים עם תווית אנזימים
   1. הוסף 100 מיקרוליטר של ריאגנטים מסומנים באנזים ספציפיים ל-IL-6, TNF-α או IL-1β לכל הבארות מלבד הריק. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
5. כביסה
   1. השלך את הנוזל מכל הבארות למעט הריק. שוטפים את הבארות בתמיסת שטיפה 1x (מוכנה כדילול פי 20 במים מזוקקים). חזור על שלב כביסה זה חמש פעמים וייבש את הבארות.
6. התפתחות וסיומת צבע
   1. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסות מצע A ו-B (מהערכה הזמינה מסחרית, ראה טבלת חומרים) לכל באר. מערבבים בעדינות ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה.
7. מדידת ספיגה וניתוח נתונים
   1. הגדר את הריק כאפס. מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. צור עקומה סטנדרטית המבוססת על ערכי OD וריכוזים סטנדרטיים. חשב את ריכוזי הדגימה באמצעות אינטרפולציה והתאם את גורם הדילול.

7. בדיקת פרופיל שומנים

הערה: בדיקת פרופיל השומנים מזהה רמות שומנים חריגות, כאשר רמות שומנים גבוהות או לא מאוזנות עלולות להאיץ את הסיכון להסתיידות כלי הדם.

1. סה"כ כולסטרול וטריגליצרידים (TC ו-TG)
   1. אסוף סרום והכן צלחת של 96 בארות עם בארות ייעודיות לדגימות בדיקה ריקות, כיול וממתינות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של סרום, תקן כיול או תמיסה ריקה לכל באר.
   2. הוסף 250 מיקרוליטר מתמיסת העבודה לכל באר. מערבבים בעדינות ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב-500 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
2. ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה וליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (LDL-C ו-HDL-C)
   1. אסוף סרום והכן צלחת של 96 בארות עם בארות המיועדות לדגימות בדיקה ריקות, כיול וממתינות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של סרום, תקן כיול או תמיסה ריקה לבארות המתאימות.
   2. הוסף את המגיב המתאים (מגיב אחד עבור 180 מיקרוליטר או מגיב שני עבור 60 מיקרוליטר, ראה טבלת חומרים) לכל באר כמפורט בהוראות ערכת הבדיקה. דגירה בטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ולמשך הזמן (מגיב אחד למשך 5 דקות או מגיב שני למשך 10 דקות) המומלץ לכל מגיב.
   3. מדוד את הספיגה באורך הגל הספציפי (600 ננומטר) המצוין עבור LDL-C או HDL-C באמצעות קורא מיקרו-פלטות.

8. כתמים מערביים

הערה: כתם מערבי (WB) הוא חיוני בהערכת רמות הביטוי של חלבוני מפתח, ומאפשר זיהוי של צורות כוללות וזרחניות כאחד.

1. הכנת רקמות
   1. שוקלים 0.05 גרם טישו ושוטפים היטב עם PBS כדי להסיר עודפי פסולת. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל 1x מעכבי פוספטאז ופרוטאז. דגרו את הרקמה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והומוגניזציה באמצעות מטחנת טישו.
2. מיצוי חלבון
   1. אפשר לדגימה ההומוגנית לעמוד למשך דקה אחת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-12,000 x גרם למשך 15 דקות. אסוף את הסופרנטנט לניתוח חלבון. קבע את ריכוז החלבון בשיטת BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). השתמש בעקומה סטנדרטית כדי לחשב את הריכוז.
      הערה: יש לקרר מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מדוד את ריכוז החלבון ב-562 ננומטר.
3. הכנת מדגם
   1. מערבבים את דגימת החלבון עם מאגר טעינה פי 5 המכיל β-מרקפטואתנול ו-SDS ביחס של 4:1. מחממים את התערובת בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבונים.
      הערה: אם נדרש מאגר טעינה 1x, יש לדלל את המאגר 5x עם מאגר ליזה.
4. הכנת ג'ל SDS-PAGE
   1. הכן ג'ל SDS-PAGE 12% והנח אותו במנגנון האלקטרופורזה. הוסף מאגר אלקטרופורזה 1x עד לסימון האמצע לפי ההוראות (ראה טבלה משלימה 2).
5. אלקטרופורזה
   1. אחזר את דגימות החלבון מ-20 מעלות צלזיוס. טען 60 מיקרוגרם חלבון לבאר והפעל את הג'ל.
   2. הגדר את הזרם ל-50 mA למשך 20 דקות עבור ג'ל הערימה, ולאחר מכן הגדל ל-100 mA למשך 60 דקות עבור הג'ל המפריד עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית.
6. העברת ממברנה
   1. הפעל את קרום ה-PVDF במתנול למשך 5 דקות.
   2. הרכיבו את כריך ההעברה בסדר הבא: נייר סינון → ג'ל SDS-PAGE → קרום PVDF → נייר סינון. העבירו חלבונים ב -300 mA למשך 60 דקות.
      הערה: ודא שאין בועות אוויר כלואות בין ג'ל SDS-PAGE לממברנת PVDF.
7. חסימת
   1. דגרו את קרום ה-PVDF ב-5% BSA (מוכן ב-1x TBST) בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך 60 דקות. שוטפים את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
8. דגירה ראשונית של נוגדנים
   1. לדגור את הממברנה ב-5 מ"ל של הנוגדן הראשוני המתאים (למשל, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα) מדולל במאגר חוסם בטמפרטורת החדר למשך 2.5 שעות.
9. דגירה משנית של נוגדנים
   1. שטפו את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים. דגירה עם הנוגדן המשני המתאים בטמפרטורת החדר למשך שעה. שוטפים שוב את הממברנה עם 1x TBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
10. זיהוי
    1. דמיין רצועות חלבון באמצעות זיהוי כימילומינסנציה ECL²⁴ (ראה טבלת חומרים).
11. ניתוח צפיפות
    1. כימות רצועות חלבון באמצעות תוכנת ImageJ. עקוב אחר תהליך עבודה זה ב- ImageJ: Image → 8 סיביות → Process → Subtract Background. לנתח מדידות → סט → לנתח קנה מידה → סט. ערוך → הפוך → נתח → מדוד → תוצאות. → הקובץ שמור בשם → intDen.
    2. צור גרפים סטטיסטיים באמצעות תוכנות גרפים וניתוח סטטיסטי.
       הערה: ודא שהתוצאות עקביות בין שכפולים כדי לאמת את הממצאים.

9. ניתוח סטטיסטי

1. אסוף וארגן נתונים באמצעות GraphPad Prism 9.0.
2. חשב והתווה קווי שגיאה באמצעות ± SD ממוצע מנתונים גולמיים.
3. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן הפוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.
4. קבע את המובהקות הסטטיסטית ב-P < 0.05, כאשר ערכי P קטנים יותר מצביעים על הבדלים גדולים יותר בתוצאות.

ניתוח פרמקולוגיה ברשת

באמצעות מאגרי מידע כגון HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA ו-STITCH, זוהו 388 גני מטרה פוטנציאליים לסלידרוסיד. בנוסף, 2871 גנים פוטנציאליים הקשורים ל-VC אוחזרו ממאגרי מידע כמו GeneCards, OMIM, PharmGkb ו-DrugBank. ניתוח הצטלבות באמצעות דיאגרמות VENN חשף 208 מטרות חופפות, הנחשבות למטרות מפתח להתערבות סלידרוסיד ב-VC (איור 1A).

ניתוח רשת PPI

פלטפורמת STRING שימשה לניתוח האינטראקציות בין 208 יעדי המפתח, מהם נבחרו 100 הצמתים המובילים. צמתים אלה יובאו לאחר מכן ל-Cytoscape 3.9.1 כדי לבנות רשת PPI מפורטת. ניתוח טופולוגיית רשת באמצעות פרמטרים כמו EC, BC, NC, LAC, CC ו-DC זיהה 37 יעדי ליבה. חידוד נוסף המתמקד בתואר, MCC ו-MNC איתר את 10 יעדי הליבה המובילים, כולל IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 ו-STAT3 (איור 1B).

ניתוח מסלולי GO פונקציונלי ו-KEGG

ניתוח פונקציונלי של GO של 208 המטרות העיקריות זיהה 4808 תהליכים ביולוגיים, 294 רכיבים תאיים ו-515 פונקציות מולקולריות. ניתוח מסלול KEGG דיווח על 281 מסלולי איתות, הכוללים בעיקר חילוף חומרים, עיבוד מידע גנטי וסביבתי, מערכות אורגניזמים, תהליכים תאיים ומחלות אנושיות. נמצא שרוב הגנים שזוהו היו מועשרים במסלול השומנים וטרשת העורקים, מה שמצביע על כך שמנגנון המפתח שבאמצעותו SAL משפר VC עשוי לכלול ויסות שינויים חריגים בשומנים ובגורמים דלקתיים (איור 2).

אימות ניסוי in vivo

בהשוואה לקבוצת Ctrl, חולדות קבוצת המודל הפגינו השמנת יתר, עייפות ופרווה עמומה. פרופילי השומנים בסרום הראו עלייה משמעותית ברמות TC, TG ו-LDL-C וירידה ב-HDL-C בקבוצת המודל (p < 0.05). לעומת זאת, קבוצות SAL-L, SAL-H ו-SIM הראו שיפורים משמעותיים בפרמטרים אלה, עם השפעה תלוית מינון בקבוצות SAL (p < 0.05) (איור 4).

צביעת HE שימשה לזיהוי שינויים מבניים באבי העורקים הבטני של החולדה, בעוד צביעת EVG העריכה את מצב הסיבים האלסטיים, וצביעת VK שימשה לזיהוי משקעי סידן. בקבוצת הביקורת, צביעת ה-HE תוחמת את השכבות המובהקות של רקמת אבי העורקים הבטני, והצביעה של EVG חשפה סידור מסודר של סיבים אלסטיים עם הפרעות מינימליות. מרבצי סידן לא היו נוכחים באופן ניכר לפי צביעת VK. לעומת זאת, קבוצת המודל הציגה רקמת כלי דם עם היפרפלזיה אינטימית וחדירת תאים דלקתיים, יחד עם אי סדר מבני נרחב בשכבת המדיה. ההבחנה בין סיבים אלסטיים לתאי שריר חלק לא הייתה ברורה, והסיבים היו מסודרים בצורה לא סדירה, עם הסתיידות נמקית נראית לעין. כמו כן נצפתה חדירת לימפוציטים אדוונטיציאליים. צביעת EVG בקבוצה זו הציגה דפוס לא מסודר של סיבים אלסטיים, עם הפסקות נרחבות, וצביעת VK אישרה מרבצי סידן משמעותיים.

בעקבות התערבות SAL, נצפתה שיפור ניכר בנזק לכלי הדם על ידי VC. צביעת HE הצביעה על כך שלקבוצות SAL-L ו-SAL-H היו מבני שכבת כלי דם מוגדרים היטב, עם ניוון מינימלי של תאי שריר חלק במדיה. לאחר צביעת EVG, הסיבים האלסטיים בשתי הקבוצות היו מיושרים בצורה מסודרת עם מעט שיבושים, כאשר קבוצת SAL-H עלתה על קבוצת SAL-L. צביעת VK לא הראתה מרבצי סידן משמעותיים באף אחת מהקבוצות, מה שמרמז על כך ש-SAL מיתן את השינויים המבניים בכלי הדם שנגרמו על ידי VC.

לאחר התערבות SIM, השינויים המבניים בכלי הדם שיקפו את אלה של קבוצת SAL-H. צביעת HE הדגימה ארכיטקטורת אבי עורקים בטנית ברורה עם ניוון מינימלי של תאי שריר חלק בתקשורת. צביעת EVG אישרה את הסידור המסודר של סיבים אלסטיים עם מעט שיבושים, וצביעה של פון קוסה לא זיהתה משקעי סידן משמעותיים. ממצאים אלה מצביעים על כך שקבוצת SAL שיפרה באופן משמעותי את התסמינים השליליים הקשורים ל-VC (איור 5).

גם יון הסידן (Ca²⁺) וגם רמות ה-ALP היו גבוהות משמעותית בקבוצת המודל ביחס לקבוצת Ctrl (p < 0.05). עם זאת, רמות אלו ירדו באופן ניכר בקבוצות SAL-L ו-SAL-H, כאשר המינון הגבוה יותר של SAL הראה יעילות גבוהה יותר (איור 6A,B). בנוסף, הביטוי של חלבון מורפוגנטי בעצם-2 (BMP2) השתפר באופן משמעותי בקבוצת המודל (p < 0.001), בעוד שקבוצות SAL הראו ירידה בביטוי BMP2 בהיקפים משתנים (p < 0.01) (איור 6C). ניתוח גורמים דלקתיים חשף ויסות מוגבר משמעותי של TNF-α ו-IL-6 בקבוצת המודל (p < 0.05), מה שמצביע על תגובה דלקתית עקב VC (איור 6D-F). לאחר הטיפול ב-SAL, סמני דלקת אלה פחתו באופן משמעותי (p < 0.05), עם תוצאות טובות יותר בקבוצת SAL-H.

ניתוח ביטוי חלבון ברקמת כלי הדם הראה רמות זרחון מוגברות של JAK2, STAT3 ו-NF-κB p65, וירידה בביטוי של IκBα בקבוצת המודל (p < 0.05). גם טיפולי SAL-L וגם SAL-H הפחיתו משמעותית את רמות הזרחן של JAK2, STAT3 ו-NF-κB p65, תוך הגברת ביטוי IκBα, מה שמצביע על כך שסלידרוסיד ממתן את התקדמות VC דרך מסלול האיתות JAK2/STAT3 (איור 7).

תוצאות אלו מדגישות את ההשפעות הטיפוליות הפוטנציאליות של SAL על VC, הנתמכות על ידי פרמקולוגיה ברשת ואימות in vivo תוך מתן תובנות לגבי מנגנוני הפעולה האפשריים שלה.

איור 1: רשת אינטראקציה של מטרות ליבה בין סלידרוסיד להסתיידות כלי דם. (A) תרשים הזרימה של רשת האינטראקציה של מטרות הליבה בין סלידרוסיד להסתיידות כלי הדם. (B) דיאגרמת ון שמראה את החפיפה בין מטרות סלידרוסיד (סגול) ומטרות הסתיידות כלי דם (ירוק). המטרות המצטלבות מסומנות בטקסט שחור. (C) רשת אינטראקציית הליבה הפוטנציאלית המעורבת בהשפעות של סלידרוסיד על VC. (1) 100 הצמתים השכנים המובילים של רשת PPI. כל צומת מייצג מטרה, וכל קצה מייצג אינטראקציה בין מטרות. (2) רשת גנים רכזת (37 צמתים שזוהו באמצעות תוסף CytoNCA). (3) 20 הצמתים השכנים המובילים של רשת PPI. (4-6) יעדים מרכזיים שזוהו על סמך קריטריונים של Degree, MCC ו-MNC באמצעות התוסף CytoHubba (10 צמתים כל אחד). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות ניתוח העשרה. (A) העשרה לטווח של 20 GO המובילים. ציר ה-X מייצג את הגורם העשיר, וציר ה-Y מייצג את מונחי ה-GO. גודל הנקודות מציין את מספר הגנים, והצבע מייצג -log₁₀ (ערך P ), כאשר אדום מציין ערך P קטן יותר. (ב) הערת העשרה במסלול KEGG. ציר ה-X מייצג את מספר הגנים, וציר ה-Y מייצג רמות שונות של מידע הערות. צבעים שונים מייצגים קטגוריות שונות של ביאורים ברמה הראשונה. (ג) העשרת 20 המסלולים המובילים. ציר ה-X מייצג את הגורם העשיר, וציר ה-Y מייצג את מונחי ה-GO. גודל הנקודות מציין את מספר הגנים, והצבע מייצג -log₁₀ (ערך P ), כאשר אדום מציין ערך P קטן יותר. (D) מפת מסלול שומנים וטרשת עורקים. קופסאות אדומות מציינות את המטרות הפוטנציאליות של התערבות סלידרוסיד ב-VC המועשרות במסלול השומנים וטרשת העורקים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: חקירת ההשפעה של סלידרוסיד על הסתיידות כלי דם בחולדות באמצעות ניסויים in vivo . תרשים זרימה של תכנון הניסוי. חולדות וויסטאר שימשו לניסוי של 11 וואט. במהלך השבוע הראשון, החולדות התאקלמו ואז חולקו באופן אקראי לחמש קבוצות: Ctrl, Model, SAL-L, SAL-H ו-SIM עבור הניסויים הבאים. שבועות 1-9 כללו האכלה של קבוצת Ctrl בדיאטה רגילה (ND), בעוד שהקבוצות האחרות קיבלו דיאטה עתירת שומן (HFD) החל מ-8w לאחר זריקה בודדת של 600,000 IU/kg VD3, ולאחר מכן זריקות שבועיות של 100,000 IU/kg VD3. משבועות 9 עד 10, כל הקבוצות עברו ל-HFD (למעט קבוצת Ctrl), כאשר קבוצות SAL-L ו-SAL-H קיבלו זריקות תוך-צפקיות של סלידרוסיד במינון 5 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, בעוד שקבוצת ה-SIM קיבלה סימבסטטין במינון 5 מ"ג/ק"ג (n = 8). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: רמות שומנים בסרום בחולדות VC שטופלו בסלידרוסיד. רמות השומנים בסרום בחולדות VC נמדדו באמצעות GPO-PAP מגיב יחיד ושיטות ישירות עם מגיב כפול. (A) רמות TG (שיטת GPO-PAP עם מגיב יחיד). (B) רמות TC (שיטת GPO-PAP עם מגיב יחיד). (C) רמות HDL-C (שיטה ישירה של מגיב כפול). (ד) רמות LDL-C (שיטה ישירה של מגיב כפול). כל עמודה מייצגת ממוצע ± SD (n = 8). בהשוואה לקבוצת Ctrl, P < 0.001; בהשוואה לקבוצת המודל, ^###P < 0.001, ^##P <0.01, ^#P < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הערכה היסטולוגית של נזק לרקמת כלי הדם בחולדות VC. צביעת HE שימשה להערכת נזק לרקמות, כאשר חיצים אדומים מצביעים על הסתיידות מדיאלית וחצים ירוקים מצביעים על חדירה לימפוציטית באדוונטיטיה. הגרעינים צבועים בכחול, והציטופלזמה צבועה באדום. צביעת EVG שימשה לצפייה בנזק לסיבים אלסטיים באבי העורקים הבטני, עם חיצים כחולים המצביעים על אזורים של קרע וחוסר ארגון של סיבים אלסטיים. סיבים אלסטיים נראים אדומים, והשריר נראה אדום חיוור. צביעת VK שימשה לצפייה בשקיעת סידן באבי העורקים הבטני, כאשר אזורים כתומים מצביעים על משקעי סידן, הנראים שחורים (פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר, n = 8). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ביטוי של סמני הסתיידות עצם וציטוקינים דלקתיים בחולדות VC שטופלו בסלידרוסיד. (A) פעילות ALP (סמן להסתיידות כלי דם). (B) תכולת יוני סידן. (C) ביטוי BMP2 (חלבון מורפוגנטי בעצם). (D) ביטוי IL-6 (ציטוקין פרו-דלקתי). (E) ביטוי TNF-α (ציטוקין פרו-דלקתי). (F) ביטוי IL-1β (ציטוקין פרו-דלקתי). כל עמודה מייצגת ממוצע ± SD (n = 8). בהשוואה לקבוצת Ctrl, P < 0.001, ^**P < 0.01; בהשוואה לקבוצת המודל, ^###P < 0.001, ^##P < 0.01, ^#P < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ניתוח כתמים מערביים של ביטוי חלבון מפתח בחולדות VC שטופלו בסלידרוסיד. (A) ניתוח כתמים מערביים של רמות ביטוי חלבון p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65 ו-IκBα. (B) ביטוי חלבון יחסי של P-JAK2/JAK2 בקבוצות שונות. (C) ביטוי חלבון יחסי של p-NF-κB p65, NF-κB p65 בקבוצות שונות. (D) ביטוי חלבון יחסי של IκBα בקבוצות שונות.  (E) ביטוי חלבון יחסי של P-STAT3/STAT3 בקבוצות שונות. כל עמודה מייצגת ממוצע ± SD (n = 8). בהשוואה לקבוצת Ctrl, P < 0.001; בהשוואה לקבוצת המודל, ^###P < 0.001, ^##P < 0.01, ^#P < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: מנגנון מולקולרי מוצע של התערבות סלידרוסיד בחולדות VC. המנגנון המולקולרי המוצע שבאמצעותו סלידרוסיד מתערב ב-VC כרוך בעיכוב של גורמים הקשורים לשומנים וציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β, IL-6, TNF-α). סלידרוזיד מדכא את ההפעלה של IκBα וזרחן של JAK2, ובכך מעכב את המסלול החיסוני הדלקתי NF-κB/STAT3. זה בסופו של דבר מפחית את הנזק לרקמות כלי הדם הקשור להתקדמות VC. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: מידע על מסד נתונים של פרמקולוגיה ברשת. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2: מרכיבי SDS-PAGE (עבור מדגם אחד). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

VC מאופיין בשינויים ניווניים בתאי כלי הדם וברקמות, עם משקעי מינרלים פתולוגיים בתוך כלי הדם המובילים להתקשות דפנות כלי הדם או להיווצרות פלאק טרשת עורקים, מה שעלול לגרום למחלות כלי דם חסימתיות²⁵. מחקרים מראים שכ-85% מפלאק VC עלול להתפתח לפקקת, שעלולה לעורר אירועים קרדיווסקולריים חריפים. בנוסף, VC הוא אינדיקטור מכריע לאירועים קרדיווסקולריים חריפים פוטנציאליים, שבץ מוחי ומחלות כלי דם היקפיות²⁶. שיטות הטיפול הנוכחיות מתמקדות בעיקר בנוגדי קרישה, תרופות להורדת שומנים בדם וויסות מתח כלי הדם, אך לגישות אלו יש לרוב יעילות ותופעות לוואי מוגבלות, במיוחד בשלבים מתקדמים של הסתיידות.

סלידרוזיד (SAL), תרכובת המזוהה כ-p-hydroxyphenethyl-beta-D-glucopyranoside, הדגימה פוטנציאל טיפולי משמעותי במצבים שונים של כלי דם המשפיעים על מערכת העצבים, הלב וכלי הדם והחיסון, כמו גם במחלות כליות כרוניות^27,28. מחקר מודרני אישר את ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי אייג'ינג, האימונומודולטוריות והאנטי דלקתיות^שלו 29,30,31. סלידרוזיד משפר באופן משמעותי את תפקוד האנדותל ומשפר את גמישות כלי הדם על ידי עיכוב מכווצי כלי דם וקידום מרחיבי כלי דם³². האלסטיות של כלי הדם משקפת ישירות את השינויים בעקבות ההסתיידות, כאשר אובדן גמישות מלווה לעתים קרובות בפירוק של חלבונים אלסטיים, ופוגע בשכבות הפנימיות והאמצעיות של כלי הדם. נזק זה מתבטא לעתים קרובות בהפעלת תאים דלקתיים. מחקרים רבים מדגישים את הקשר ההדוק בין VC לדלקת. דלקת כרונית נתפסת כמניע מרכזי להסתיידות חוץ רחמית, שבה תאים פרו-דלקתיים מתרבים ומשחררים גורמים התורמים ל-VC דרך מסלולים מרובים 33,34,35,36. הפוטנציאל של סלידרוזיד כסוכן טיפולי רב-מטרתי רלוונטי במיוחד בהתחשב בכך שהסתיידות כלי הדם היא תהליך פתולוגי מורכב הכולל דלקת, מטבוליזם של שומנים ומתח חמצוני. הגישה הרב-מטרתית של סלידרוזיד, המעכבת מסלולים דלקתיים תוך ויסות הצטברות שומנים ועקה חמצונית, מציגה יתרון מובהק על פני תרופות חד-מטרה הנמצאות בשימוש כיום. לכן, במחקר זה, ביטוי גורמים דלקתיים ייבדק כדי לחקור עוד יותר האם סלידרוסיד משפיע על VC על ידי הפחתת דלקת.

הרעיון של פרמקולוגיה רשתית, שהוצג על ידי הופקינס ב-2007, כולל שימוש בגישות מבוססות רשת כדי לבחון כיצד תרופות, מחלות ומטרות מתקשרות על פני רכיבים, מטרות ומסלולים מרובים³⁷. במחקר זה, נעשה שימוש בפרמקולוגיה של רשת כדי לחזות כיצד SAL מקיים אינטראקציה עם VC, תוך איתור מטרות חיוניות כמו IL6, STAT3, TNF, TP53 ו-ALB. התוצאות הצביעו על ריכוז של גנים אלה במטבוליזם של שומנים ובמסלולי טרשת עורקים, מה שמרמז על כך ש-VC עשוי להיות קשור להצטברות שומנים ודלקת בעורקים. כדי לאמת את התחזיות הללו, נעשה שימוש במודל חולדה של VC המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן בשילוב עם VD3. מודל זה איפשר חקירה נוספת של השפעת SAL על קרנות הון סיכון. הממצאים חשפו כי VC העלה את רמות TC, TG ו-LDL-C תוך הורדת HDL-C. יתר על כן, SAL במינונים שונים הראה השפעות שונות בוויסות אינדיקטורים חריגים אלה. תוצאות מחקר נוספות הצביעו על כך ש-SAL הפחית ביעילות את שקיעת הסידן באבי העורקים הבטני, תיקן רמות יוני סידן חריגות והפחית את חדירת התאים הדלקתיים, תוך הפחתת הביטוי של סמנים הקשורים להסתיידות כגון ALP ו-BMP2.

מסלול JAK/STAT ממלא תפקיד מכריע בתהליכי גדילה ואיתות שונים, מווסת תגובות חיסוניות והתמיינות תאים, מה שהופך אותו לחלק בלתי נפרד מתגובות דלקתיות³⁸. STAT3, המופעל על ידי IL-6, הוא חלק מתגובה בשלב חריף, כאשר IL-6 גורם לזרחון JAK, אשר בתורו מזרחן את STAT3. הפעלה זו שולטת בביטוי גנים הקשורים לצמיחת תאים, התמיינות והישרדות. זרחון מתמשך של STAT3 נקשר למחלות כלי דם ויכול להוביל לביטוי חריג של מולקולות הדבקה, אשר בשלבי VC מוקדמים מקל על הידבקות של מונוציטים לאינטימה של כלי הדם, ופוגע עוד יותר במבנה כלי הדם^39,40. תוצאות הניסוי מראות כי SAL מעכב את הביטוי של JAK2, STAT3 ו-NF-κB p65 זרחניים, תוך קידום הביטוי של IκBα, מה שמרמז על כך שתפקידו של SAL בעיכוב התקדמות VC מתווך באמצעות מסלול האיתות IL-6/JAK2/STAT3 (איור 8).

במחקר זה, פרמקולוגיה של הרשת ניבאה בהצלחה מנגנוני מפתח המעורבים בהתקדמות VC, וזיהתה את המטרות והמסלולים שדרכם SAL מתערב. ההקבלות הפיזיולוגיות והפתולוגיות בין החולדות למערכות אנושיות הופכות את המודלים של החולדות לבעלי ערך מיוחד למחקר קליני בעתיד. יתר על כן, חולדות חסכוניות וקלות לטיפול, מה שהופך אותן למתאימות לחקר מחלות וגילוי תרופות. למרות היתרונות של מודלים של בעלי חיים, ישנן מגבלות. מודלים של חולדות, למרות שהם מועילים, אינם יכולים ללכוד באופן מלא את המורכבות של פיתוח הון סיכון בבני אדם. מחקרים עתידיים צריכים לכלול מודלים מגוונים יותר ולשקול גורמים כמו מחלות נלוות ורקע משתנה של מטופלים.

עם זאת, למחקר זה יש מספר מגבלות. תקופת הניסוי הייתה 10 שבועות, במהלכם החולדות הוזנו בתזונה עתירת שומן (HFD) עם מינון גבוה ראשוני ואחריו מינונים נמוכים יותר של VD3 כדי לגרום ל-VC. שיעור התמותה הגבוה שנצפה במודל החולדות צוין לראשונה במהלך ניסויים ראשוניים, שם נמצא כי מינונים גבוהים וממושכים של VD3 הפחיתו משמעותית את שיעורי ההישרדות של חולדות, ובסופו של דבר השפיעו על איכות וציר הזמן של הניסוי. זה מדגיש את הצורך לייעל את המודל כדי לשפר את שיעורי ההישרדות ולהשיג נתונים חזקים יותר. בעוד שמחקר זה אישר את ההשפעות של SAL על VC בחולדות, המורכבות של VC ותהליך ההתפתחות הממושך שלו פירושם שמחקר בבעלי חיים בודד עשוי שלא ללכוד את הפתופיזיולוגיה שלו במלואה. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בחידוד המודל כדי לשפר את שיעורי ההישרדות של חולדות. בנוסף, בעוד שהניסויים in vivo הראו כי SAL מפחית VC על ידי ויסות גורמים דלקתיים דרך מסלול JAK2/STAT3, מחקרים נוספים צריכים לחקור מטרות במעלה הזרם ובמורד הזרם במבחנה. לבסוף, המחקרים הקליניים על SAL מוגבלים, ויש צורך במחקר נוסף כדי להעריך את יעילותו ובטיחותו בבני אדם. VC קשור למספר מצבים, כולל מחלת כליות כרונית, מחלות כלי דם במוח וטרשת עורקים כלילית. מחקר זה ביסס בהצלחה מודל VC שניתן להשתמש בו עוד יותר כדי לחקור טיפולים למצבים הקשורים לכלי דם. התכנון הניסויי והטכניקות המשמשות כאן מספקים גם בסיס רב ערך לגילוי תרופות הקשורות ל-VC.

לסיכום, מחקר זה השתמש בפרמקולוגיה של רשת וביולוגיה מולקולרית כדי לחקור את ההשפעה של סלידרוסיד על הסתיידות כלי הדם. התוצאות מראות כי SAL מעכב VC על ידי הפחתת דלקת, הורדת ביטוי גורמי השומנים והפחתת סמני VC דרך מסלול JAK2/STAT3, מה שמרמז על גישה טיפולית מבטיחה לטיפול ב-VC.

ודא שכל המחברים חשפו כל ניגוד אינטרסים.

עבודה זו נתמכה כספית על ידי פרויקט המחלקה המחוזית למדע וטכנולוגיה של ג'ילין (YDZJ202301ZYTS460), ופרויקט מחלקת החינוך של מחוז ג'ילין (JJKH20230991KJ).