Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

L'adesione è un primo passo importante nella colonizzazione e nella patogenesi della Candida. Qui, viene descritto un test in vitro per misurare l'adesione degli isolati di C. parapsilosis alle proteine immobilizzate sotto taglio fluido. Un dispositivo microfluidico multicanale viene utilizzato per confrontare più campioni in parallelo, seguito dalla quantificazione utilizzando l'imaging a fluorescenza.

C. parapsilosis (Cp) è una causa emergente di infezioni del flusso sanguigno in alcune popolazioni. Il clade della Candida , incluso il Cp, sta sviluppando sempre più resistenza alla prima e alla seconda linea di antimicotici. La CP è spesso isolata dalle mani e dalle superfici cutanee, nonché dal tratto gastrointestinale. La colonizzazione da Candida predispone gli individui a infezioni invasive del flusso sanguigno. Per colonizzare o invadere con successo l'ospite, il lievito deve essere in grado di aderire rapidamente alle superfici corporee per prevenire l'eliminazione da parte dei meccanismi di difesa dell'ospite. Qui descriviamo un metodo per misurare l'adesione di Cp alle proteine immobilizzate sotto taglio fisiologico del fluido, utilizzando un saggio di adesione end-point in un dispositivo microfluidico multicanale disponibile in commercio. Questo metodo è ottimizzato per migliorare la riproducibilità, ridurre al minimo la soggettività e consentire la quantificazione fluorescente dei singoli isolati. Dimostriamo anche che alcuni isolati clinici di Cp mostrano una maggiore adesione quando vengono coltivati in condizioni che imitano un ospite mammifero, mentre un ceppo di laboratorio usato frequentemente, CDC317, non è adesivo sotto taglio fluido.

Sono organismi commensali comuni sulla pelle e sulle mucose umane che possono portare a malattie invasive tra gli immunocompromessi con sostanziale morbilità, mortalità e costo associati ^1,2,3. Sebbene C. albicans rimanga una causa importante di queste infezioni, le specie non albicans come C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis e C. auris sono sempre più riconosciute, soprattutto nelle popolazioni vulnerabili e con frequente resistenza ai farmaci antifungini disponibili⁴. Le specie non albicans presentano elementi distinti di biologia e patogenesi che sono oggetto di indagine attiva.

L'adesione è un primo passo importante nella colonizzazione e nella patogenesi. L'interferenza con questa fase può quindi offrire l'opportunità di arrestare la progressione della malattia in una fase precoce. Gli studi sull'adesione e l'invasione della Candida si sono concentrati prevalentemente sulle condizioni statiche ^5,6. Questi studi hanno contribuito a definire la struttura e le funzioni delle adesine fungine nella malattia ^7,8,9. Tuttavia, l'adesione nel flusso sanguigno, nei tratti gastrointestinali (GI) e nelle vie urinarie e nei cateteri deve avvenire in condizioni di flusso di taglio del fluido che pone vincoli unici all'adesione. L'adesione sotto taglio richiede una rapida formazione di legami di cattura e la capacità di resistere a forti forze di trazione prodotte a causa del movimento dei liquidi^10,11. L'adesina di C. albicans, Als5, ha dimostrato di facilitare l'adesione dipendente dal taglio^12,13. CpAls7 (CpALS4800) ha precedentemente dimostrato di mediare l'adesione di Cp alle cellule epiteliali e un knockout ha mostrato una diminuzione della virulenza in un modello di infezione del tratto urinario¹⁴. Abbiamo dimostrato che CpALS4800 promuove l'adesione in condizioni di taglio del fluido fisiologicamente rilevanti¹⁵.

La colonizzazione e la patogenesi della candida sono state ampiamente studiate nei modelli animali 16,17,18. I modelli più frequentemente utilizzati sono le infezioni della mucosa murina e del flusso sanguigno, ma i modelli di invertebrati, come le larve di Galleria, sono sempre più utilizzati a causa del basso costo, della rapidità di produzione e della semplicità. I modelli animali ricapitolano molte fasi del processo patologico umano sia nel patogeno che nell'ospite, comprese le risposte immunitarie adattative e innate dell'ospite, le interazioni del lievito con i tessuti e il microbiota e le risposte del lievito all'ambiente ospite. Al contrario, i saggi di adesione in vitro consentono di concentrarsi specificamente sulla fase di adesione e sulla manipolazione sperimentale di variabili come la forza di taglio, le condizioni di crescita del lievito e l'adesione a substrati specifici.

Poiché il Cp è in grado di crescere sia negli esseri umani che nelle fonti ambientali, è probabile che sia in grado di percepire e rispondere a diversi ambienti. A sostegno di questa nozione, diversi isolati clinici di Cp mostrano una bassa adesione al taglio fluido quando vengono coltivati nel terreno di crescita standard del lievito, lievito-peptone-destrosio (YPD), ma passano a una forte adesione quando vengono coltivati per alcune ore a 37 °C nel terreno di coltura tissutale 199 (M199)^15,19. Qui viene fornito un protocollo dettagliato per un saggio a media produttività che consente la misurazione dell'adesione di più campioni di lievito eseguiti in parallelo, in condizioni definite di crescita, taglio del fluido, temperatura e substrato. Il test è stato progettato per massimizzare la riproducibilità e per consentire l'uso di isolati clinici di Cp, nonché di ceppi che sono stati manipolati sperimentalmente in laboratorio. Il test qui descritto, per l'adesione di Cp a un substrato di albumina sierica bovina (BSA), dimostra che gli isolati clinici mostrano un intervallo di adesione, mentre due ceppi di laboratorio comunemente usati, CDC317 e CLIB214 mostrano una scarsa adesione.

La Candida spp. è classificata come organismo di livello di biosicurezza 2 e deve essere maneggiata utilizzando le opportune precauzioni.

1. Crescita e induzione di ceppi clinici

1. Streak Cp ceppa su piastre di agar all'1% (m/v) di estratto di lievito, al 2% (m/v) di peptone, al 2% (m/v) di destrosio (YPD) e al 2% (m/v) e cresce a 22 °C.
   NOTA: Le piastre possono essere conservate sul banco del laboratorio e riutilizzate nel corso della settimana successiva.
2. Il giorno prima del test di adesione, trasferire circa 6 colonie di ciascun ceppo in un pallone di Erlenmeyer (conico) da 250 mL contenente 10 mL di terreno YPD. Coltivare per una notte in un agitatore microbiologico impostato a 250 giri/min a 37 °C.
   NOTA: Il Cp deve crescere per 20-24 ore per raggiungere la fase stazionaria in coltura liquida a 37 °C.
3. Eseguire i seguenti passaggi il giorno del test di adesione.
   1. Trasferire 1 mL di coltura liquida dal pallone di Erlenmeyer a una provetta per microfuge.
   2. Centrifugare la coltura alla massima velocità in microfuga (16.000 x g) per 3 minuti. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile e ripetere questo passaggio per un totale di tre lavaggi.
   3. Al termine dell'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di acqua sterile. Utilizzare puntali per pipette a orifizio largo da 1 mL e 200 μL per la manipolazione delle sospensioni di lievito durante questa fase e quelle successive.
      NOTA: Molti ceppi adesivi di Cp si attaccano ai lati del pallone di Erlenmeyer e richiedono una raschiatura meccanica per essere rimossi.
4. Contare le cellule di lievito utilizzando un emocitometro o un dispositivo equivalente. Diluire la coltura di lievito per ottenere una concentrazione ragionevolmente numerabile di 50-200 cellule di lievito. Utilizzare una diluizione di 500 volte, mettendo 20 μL in 10 mL di acqua.
   NOTA: La maggior parte dei ceppi di Cp cresce fino a 10^{8-10 9} cellule/mL in una coltura di agitazione notturna a 37 °C.
5. Diluire la coltura di lievito con 2 mL di YPD o Medium 199 (M199), a una concentrazione finale di 3 x 10⁶ cellule/mL in una provetta microfusa da 2 mL. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 3 ore.

2. Rivestimento di canali microfluidici

1. Preparare in anticipo una soluzione al 2% (m/v) di BSA nella soluzione salina bilanciata di Hank contenente calcio e magnesio (HBSS+). Per fare ciò, cospargere delicatamente 4 g di polvere di BSA sulla superficie di 200 ml di HBSS+ e incubare a 37 °C per 30-60 minuti indisturbati per consentire alla proteina di bagnarsi e poi sciogliersi. Sterilizzare la soluzione con filtro e conservare a 4 °C.
2. Scaldare 2,5 mL di questa soluzione a 37 °C per almeno 1 ora, mantenendola sterile.
   NOTA: Il riscaldamento è necessario per ridurre la formazione di bolle nella piastra a microcanali.
3. Mentre il BSA si sta riscaldando, spostare il controller microfluidico sulla cappa di coltura tissutale, accendere il dispositivo e avviare il software.
4. Posizionare l'interfaccia fluidica all'interno del campo sterile e pulire delicatamente la guarnizione in silicone con una carta velina priva di lanugine bagnata con alcol al 70% (v/v). Evitare il contatto prolungato o ripetuto dell'alcol con la lastra acrilica per evitare screpolature o screpolature della plastica.
5. Asciugare all'aria l'interfaccia (rivolta verso l'alto) nella cappa con un sistema di flusso d'aria per rimuovere ogni traccia di alcol.
6. Aggiungere 100 μl della soluzione BSA preriscaldata sotto forma di gocciolina nella rientranza centrale di ciascuno dei canali di "uscita" (Figura 1A) di una piastra a 48 pozzetti e 24 microcanali.

Figura 1. Layout del saggio di microfluidica. (A) Una coppia di canali, che mostrano il flusso inverso del fluido dall'"uscita" all'"ingresso". I campi tassellati consecutivi catturati dal microscopio sono mostrati da linee tratteggiate (1-10 per il canale superiore e 11-20 per quello inferiore). (B) Configurazione del software di controllo della microfluidica per il flusso inverso durante il rivestimento BSA (Passaggio 2.10). Screenshot riprodotti qui con il permesso del produttore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Posizionare l'interfaccia sulla parte superiore della piastra a microcanali, allineando i quattro bulloni dell'interfaccia con le prese corrispondenti nella piastra.
8. Serrare i bulloni con le dita guantate. Tenere presente che la resistenza al serraggio manuale indica un disallineamento. In tal caso, sollevare leggermente l'interfaccia e riposizionarla, quindi riprendere a fissare i bulloni.
9. Quando i bulloni sono serrati a mano, utilizzare la chiave dinamometrica per serrare ulteriormente l'interfaccia.
10. Utilizzando l'interfaccia del software microfluidics (Figura 1B), impostare la modalità su Manuale. Utilizzare l'opzione predefinita Fluido (Water@19degC) per entrambi i set di colonne e impostare il taglio su 1 dyn/cm^2.
    1. Attivare le colonne di "uscita" (#2,4,6,8) per pompare il liquido verso gli "ingressi". Far funzionare a temperatura ambiente per 30 min.
11. Ispezionare visivamente ogni pozzetto di "ingresso" sbirciando attraverso il fondo della piastra del microcanale per assicurarsi che una goccia della soluzione BSA si sia accumulata in ogni "ingresso". Ciò conferma che tutti i 24 canali sono stati bagnati e riempiti con successo.
12. Sganciare l'interfaccia e rabboccare ogni pozzetto ("ingressi" e "uscite") con 250 μl di HBSS+ senza BSA per evitare che i canali si secchino e mettere la piastra in un incubatore per colture tissutali.
    NOTA: Sono necessarie almeno 48 ore affinché le proteine vengano adsorbite uniformemente sulle superfici dei canali della piastra dei microcanali. Dopo il rivestimento delle proteine, le piastre possono essere conservate per un massimo di due settimane in un ambiente umido (come un incubatore per colture tissutali con il 100% di umidità di saturazione) prima di essere utilizzate nei saggi di adesione. Per periodi più lunghi, avvolgere le piastre in una pellicola di plastica per evitare l'evaporazione.

3. Saggio di adesione

1. Durante l'incubazione del lievito in YPD e M199 (fase 1.5), aspirare i pozzetti di ingresso e di uscita della piastra a microcanali rivestita BSA, senza disturbare il canale che parte dalla rientranza centrale di ciascun pozzetto (Figura 1A). Invece, aspirare dal bordo del pozzo. Aggiungere 1 mL di HBSS+ ai pozzetti di "uscita".
2. Collegare l'interfaccia microfluidica come sopra (passaggio 2.5). Utilizzare l'impostazione predefinita del fluido Fluido a (Water@19degC) e Taglio a 2 dyn/cm^2 a temperatura ambiente per lavare il canale e rimuovere eventuali BSA non legati. Lavare per 2-3 ore a questa portata.
3. Rimuovere l'interfaccia dalla piastra a microcanali. Accendere l'unità di riscaldamento della piastra del dispositivo microfluidico e verificare che sia impostata su 37 °C.
4. Aspirare il terreno da tutti i pozzetti sulla piastra e aggiungere 0,5 mL di lievito indotto dal passaggio 1.5 a ciascuna coppia di "uscite". Risospendere completamente il lievito capovolgendo le provette da 2 ml 3-6 volte e pipettare delicatamente su e giù immediatamente prima dell'aggiunta ai pozzetti. Lasciare vuoti i pozzetti "di ingresso".
5. Fissare l'interfaccia fluidica alla piastra del microcanale come al punto 2.5 sopra. Utilizzare il software del dispositivo per impostare Fluido su HBSS@37degC e Taglio su 5 dyn/cm^2.
   1. Attivare le colonne di "uscita" (#2,4,6,8) per pompare il liquido verso gli "ingressi". Far funzionare il riscaldatore della piastra a 37 °C per 30 minuti, in modo che il lievito aderisca al canale rivestito di BSA.
6. Durante questo periodo, preparare il tampone di lavaggio. A 30 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS+) aggiungere 5 μM di calcofluor, che è incluso per rendere il lievito fluorescente per la loro rilevazione. Scaldare in un bagno a 37 °C.
7. Al termine dei 30 minuti di adesione, mettere in pausa il flusso utilizzando l'interfaccia software senza alterare altre condizioni di flusso. Sganciare l'interfaccia e aspirare tutti i pozzetti ("ingressi" e "uscite").
8. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio calcofluor alle "uscite". Ricollegare l'interfaccia fluidica e riprendere il flusso utilizzando il software per altri 10 minuti. Questo passaggio è progettato per lavare via il lievito non aderente e debolmente legato e contemporaneamente colorare in modo fluorescente il lievito nel canale.
9. Dopo 10 minuti, rimuovere l'interfaccia fluidica e sostituirla con un coperchio. Pulire delicatamente la parte inferiore della piastra a microcanali con un panno privo di lanugine e procedere all'imaging.

4. Imaging e quantificazione

1. Posizionare la piastra a microcanali in un supporto per tavolino per microscopio appropriato. Utilizzare un obiettivo 20x, che consentirà un campo visivo tale che il canale riempia circa la metà dell'altezza dell'immagine. Individuare l'estremità sinistra del canale 1 (in "ingresso" 1). Regolare il tavolino in modo che il canale sia posizionato come nella Figura 1A, posizione 1.
2. Acquisisci una singola immagine in campo chiaro del canale. Misurare l'area dell'area del canale in μm², utilizzando lo strumento di misurazione rettangolare per normalizzare le misurazioni dell'area durante l'analisi dei dati (vedere la discussione).
3. Passando al canale fluorescente DAPI (eccitazione 395 nm, emissione 440/40 nm) regolare la messa a fuoco sul lievito aderente sulla superficie inferiore del canale. Bloccare l'autofocus su questo piano. Impostare l'intensità di eccitazione della fluorescenza su 1,5% e le condizioni di esposizione della fotocamera (binning 2x2, esposizione 15 ms, 12 bit, guadagno 4) per evitare la saturazione del sensore di immagine.
4. Utilizzo dello stadio motorizzato e dell'acquisizione ND | XY Imaging nel software di controllo del microscopio, acquisisce automaticamente una serie consecutiva di immagini non sovrapposte distanziate di un campo visivo (666 μm) dalla prima coppia di canali (1/2).
   1. Raccogli 10 immagini da sinistra a destra per il canale superiore, spostale verso il basso di 666 μm e raccogline altre 10 da destra a sinistra per il canale inferiore (come mostrato schematicamente nella Figura 1A).
   2. Utilizzare l'opzione XY relativo , in modo che, una volta definite le posizioni dell'immagine, sia possibile attivare una serie simile per ogni coppia di canali, dopo che l'inizio del canale è stato definito manualmente.
   3. Raccogli immagini nel canale DAPI (Acquisizione ND | λ | DAPI).
5. Monitora le immagini per confermare che il canale rimanga all'interno del campo visivo mentre il tavolino motorizzato sposta la lastra.
   NOTA: Ogni set di 20 immagini da una coppia di canali verrà salvato automaticamente con un nome di file consecutivo tramite l'acquisizione ND.
6. Utilizzare la funzione autostep (Navigazione XYZ | passo XY) per spostare 25750 μm verso il basso fino a "ingresso" 3. Regolare manualmente la posizione del canale come al punto 4.1. Acquisire la serie successiva di immagini (acquisizione ND) della coppia di canali 3/4.
7. Ripetere questo processo, fino a quando tutte le 12 coppie di canali sono state riprese, con i risultati salvati in 12 file. Seguire l'ordine dei canali da 1 a 24 stabilito dal produttore.
8. Unisci tutti i 12 set di immagini fluorescenti in un unico file (File | Unisci documenti ND). Verificare che l'ordine dei file corrisponda all'ordine in cui sono stati acquisiti i 12 set di immagini.
9. Uso del sistema binario | Soglia per separare il lievito dal fondo in base al loro livello di fluorescenza. Applica la stessa soglia all'intera pila di immagini.
   NOTA: una soglia bassa di intensità della scala di grigi a 12 bit di 500 e una soglia alta impostata al massimo di 4095 è tipica.
10. Misurare l'area di soglia (Misura | Esecuzione della misurazione | Tutti i fotogrammi). Aprire il report (Controlli analisi | Risultati di misurazione automatizzati) e controllare i dati.
    NOTA: Questo genererà una tabella di misurazioni per 240 immagini (20 immagini da ciascuna delle 12 coppie di canali) e l'area di soglia per ciascuna immagine è elencata nella colonna etichettata BinaryArea [μm²].
11. Esportare i dati in un file di testo delimitato da tabulazioni (Esporta).

Utilizzando i metodi descritti nella sezione Protocollo, è stata confrontata l'adesione di 6 ceppi di Cp (Tabella 1)

Tabella 1. Ceppi di parapsilosi da Candida utilizzati in questo studio.

Quattro dei ceppi erano isolati clinici recenti con un numero di passaggio basso^{di 29,30} e CLIB214 e CDC317 sono ceppi comunemente usati che sono stati in coltura di laboratorio per molti anni. È stata osservata un'ampia gamma di indici di adesione, dallo 0,2% al 91% (Figura 2). Tre isolati clinici (JMB81, JMB77 e Ro75) hanno mostrato una forte adesione quando sono cresciuti in M199. È interessante notare che entrambi i ceppi di laboratorio hanno mostrato un'adesione relativamente scarsa in entrambi i mezzi di crescita. Il terzo isolato clinico, WIH04, assomigliava ai ceppi di laboratorio con un'adesione relativamente scarsa.

Figura 2. Saggio di adesione che confronta 6 isolati di Candida parapsilosis. Gli isolati sono stati coltivati per 3 ore in terreno YPD o M199 prima del test di adesione come descritto nel protocollo. Il grafico rappresenta la media e le barre di errore l'errore standard della media di quattro esperimenti consecutivi, con canali duplicati in ogni esperimento. L'indice di adesione rappresenta la percentuale della superficie del canale di flusso che è stata ricoperta di lievito. I confronti sono stati effettuati con l'analisi della varianza (ANOVA). I confronti tra i gruppi sono stati effettuati con il test di Holm-Sidak. *, P < 0,001. I confronti YPD-M199 non sono significativi per WIH04, CLIB214 e CDC317. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati mostrati qui provengono da quattro esperimenti consecutivi, eseguiti in giorni diversi. Dimostrano la riproducibilità del test di adesione.

I dati risultanti dal protocollo di cui sopra possono essere analizzati utilizzando un software per fogli di calcolo standard. I dati sono espressi come "indice di adesione", che viene calcolato come segue: il valore BinaryArea per ogni set di 10 immagini (che rappresenta la copertura del lievito per un singolo canale) viene sommato tra le immagini e la media e la deviazione standard vengono calcolate per l'area sommata di ciascuna coppia di canali. L'area del canale misurata nel passaggio 4.2 rappresenta l'area massima possibile in un singolo campo visivo che potrebbe mai essere coperta da lievito. In questo protocollo, l'intera lunghezza del canale viene registrata in 10 immagini consecutive, che rappresentano un'area di quasi 2,5 mm². Quest'area del passaggio 4.2 viene moltiplicata per 10 per rappresentare la lunghezza del canale e il valore viene utilizzato per normalizzare le medie e le deviazioni standard per esprimerle come percentuali dell'indice di adesione. In pratica, questo misura la superficie di un canale che è ricoperto di lievito, con un indice di adesione del 100% che indica che l'intera lunghezza del canale è stata tappezzata di lievito da un bordo all'altro, un'area di quasi 2,5 mm². Un indice di adesione dello 0% indicherebbe che non un singolo pixel ha raggiunto la soglia di fluorescenza. Questa condizione suggerirebbe che il bianco calcofluor non è stato aggiunto, o che il canale è stato ostruito e le cellule di lievito non sono riuscite ad entrare.

L'adesione delle celle sotto il taglio del fluido definito è stata misurata per la prima volta utilizzando camere di flusso a piastre parallele²⁰. Queste camere di flusso costruite su misura utilizzavano tipicamente vetrini da microscopio o vetrini coprioggetti come basi e offrivano un unico canale per la misurazione 21,22,23. Utilizzando una versione commerciale di tale camera di flusso, si è scoperto che la forma di lievito di due ceppi di C. albicans si lega più fortemente all'endotelio rispetto alla forma ifale o pseudoifa²⁴.

Lo sviluppo di un sistema di camere a flusso multicanale ha aperto la possibilità di saggi di adesione a più alta produttività. L'hardware della camera di flusso e le forniture monouso sono costosi, ma offrono un'uniformità di produzione che riduce la variabilità sperimentale. Finkel et al. hanno utilizzato questo sistema per misurare l'adesione di C. albicans al materiale siliconico utilizzato per realizzare una faccia del canale come modello di malattia associata al catetere endovenoso²⁵. Un altro gruppo lo ha utilizzato per misurare l'adesione di C. albicans e Saccharomyces cerevisiae ai canali rivestiti di BSA, seguito dall'imaging a contrasto di fase (campo chiaro) di un singolo campo visivo, seguito dal conteggio delle cellule¹² basato su software. Un terzo gruppo ha utilizzato lo stesso sistema multicanale per valutare la formazione di biofilm in C. albicans che interagisce con i canali non rivestiti, utilizzando anche l'imaging in campo chiaro per diverse ore²⁶.

Nel protocollo attuale, il sistema di flusso multicanale è stato utilizzato per misurare in modo specifico la fase di adesione di Cp. Diverse modifiche aiutano ad aumentare l'accuratezza della quantificazione, massimizzare la gamma dinamica, ridurre il potenziale di fuoriuscite di rischio biologico e ridurre la variazione. È importante sottolineare che il sistema fluidico viene solitamente eseguito con l'orientamento in avanti, con il fluido che scorre da "ingresso" a "uscita". Oltre alla sezione di osservazione del canale, c'è anche una regione a serpentina più stretta del percorso del flusso che viene utilizzata per offrire resistenza idraulica al flusso. Questa regione tende a intrappolare il lievito. Nell'approccio attuale, le sospensioni di lievito vengono fatte funzionare con orientamento inverso, da "uscita" a "ingresso" (Figura 1A). In questo orientamento, la regione serpentina cade a valle della sezione di osservazione, riducendo la preoccupazione di intrappolare le cellule di lievito.

Le condizioni di crescita della Cp immediatamente prima del test di adesione influenzano fortemente l'adesione, così come il rivestimento del canale con BSA o proteine della matrice extracellulare¹³. In precedenza è stato dimostrato che il Cp aderisce alla BSA, al collagene, alla gelatina, alla fibronectina e anche ai canali¹⁵ rivestiti di siero. È stato osservato che l'adesione alla superficie del canale non rivestita è molto debole. La crescita nel terreno cellulare di mammifero (M199) o nel siero ha portato ad un aumento dell'adesione. È importante notare che, a differenza di C. albicans, Cp non ha mostrato una morfologia filamentosa nella durata di 5 ore di questo test. La velocità di taglio influenza fortemente l'adesione, con un taglio massimo osservato a 5 dine/cm², che è simile a quello del sangue nei capillari e nelle venule post-capillari^27,28.

Per ridurre il rischio biologico, le fasi di crescita del lievito, adesione sotto il taglio del fluido e lavaggio vengono eseguite utilizzando le precauzioni microbiologiche di livello 2 di biosicurezza al banco di laboratorio. Dopo questi passaggi, la piastra microfluidica viene svincolata dall'hardware, l'esterno della piastra viene pulito e coperto e la piastra chiusa viene ripresa al microscopio. Questo approccio riduce il rischio di contaminazione dell'area del microscopio.

Questo protocollo utilizza il bianco di calcofluor per colorare le pareti cellulari del lievito. Questo approccio è progettato per consentire l'imaging fluorescente di isolati clinici, senza la necessità di manipolazione genetica per aggiungere tag proteici fluorescenti come la GFP. La soglia fluorescente consente di misurare la superficie ricoperta di cellule di lievito. Per ridurre la potenziale interferenza con l'adesione, il colorante viene aggiunto dopo la fase di adesione, durante il lavaggio. La colorazione della chitina è la più intensa in corrispondenza delle cicatrici delle gemme, tuttavia, per la maggior parte dei ceppi di Cp, la colorazione diffusa è presente intorno all'intera periferia. Nell'attuale sistema di analisi, l'uso dell'ingrandimento inferiore, del pixel binning e di un'attenta regolazione della soglia di fluorescenza consentono di misurare l'intera cellula di lievito. Tuttavia, è importante tenere conto dell'efficienza di colorazione per i ceppi che variano notevolmente nel contenuto di chitina. Questo dovrebbe essere determinato in esperimenti preliminari o esaminando una porzione del canale con un ingrandimento maggiore prima dell'acquisizione dell'immagine.

L'adesione lungo la lunghezza del canale di visualizzazione può variare. Sommando la fluorescenza lungo la lunghezza del canale, si riduce la variabilità e la soggettività offerte da uno o da un piccolo numero di campi visivi. L'approccio attuale invece estrae la massima informazione disponibile dalla piastra microfluidica catturando l'intero canale. L'imaging è notevolmente facilitato da un tavolino motorizzato e da un meccanismo di messa a fuoco automatica per l'imaging rapido affiancato della lunghezza del canale (Figura 1A) con un input manuale relativamente ridotto. L'uso di obiettivi di potenza inferiore si traduce in un aumento del campo visivo, che a sua volta consente la leggera deviazione della posizione quando il canale viene scansionato dallo stadio motorizzato. Poiché le tolleranze della produzione della lastra comportano lievi variazioni nelle posizioni precise dei canali, non è possibile visualizzare tutte le immagini a 24 canali/240 in un'unica operazione. L'approccio utilizzato qui (2 canali e 20 immagini alla volta) è un compromesso. Tuttavia, utilizzando questo approccio, è possibile completare la procedura di imaging e quantificazione (passaggi 4.1-4.11) in circa 15 minuti.

Utilizzando questa configurazione per misurare l'adesione degli isolati clinici, è stata osservata un'ampia gamma di indici di adesione dallo 0,2% al 91%. È interessante notare che due ceppi di Cp utilizzati frequentemente, CLIB214 e CDC317, hanno mostrato una debole adesione (Figura 2). Queste osservazioni indicano che esiste una variazione significativa tra gli isolati di Cp e che il test può fornire dati di adesione in un ampio intervallo dinamico.

Potenziali variazioni o modifiche di questo test includono l'uso di diverse specie di funghi. Praticamente qualsiasi specie che colora in modo fluorescente con calcofluor può potenzialmente essere utilizzata in questo saggio, sebbene possa richiedere substrati o condizioni di crescita diversi. I funghi che differiscono in modo significativo nella forza di adesione possono essere sistemati modificando la forza di taglio o la durata delle fasi di adesione o lavaggio. È anche possibile far crescere monostrati di cellule endoteliali o cellule epiteliali nei canali di flusso e misurare l'adesione del lievito alle cellule ospiti. Le cellule di mammifero tendono ad escludere il calcofluor e generalmente offrono un basso fondo fluorescente, in modo che sia ancora possibile la rilevazione specifica del lievito. Tuttavia, va notato che i saggi di adesione tra due tipi di cellule richiedono uno sforzo sostanzialmente maggiore per mantenere sia le cellule fungine che quelle di mammifero in condizioni fisiologiche ottimali.

I limiti del test includono la difficoltà di analisi dei ceppi iperadesivi. I ceppi fungini che formano grandi grumi possono non riuscire a entrare nel microcanale, oppure ostruire il flusso all'interno del canale. Questa difficoltà si incontra con le ife di C. albicans. Se lasciati crescere a lungo, i filamenti ifali formano stuoie appiccicose che intasano il canale. Un altro limite è l'identificazione delle condizioni di crescita che favoriscono l'adesione. Questi possono variare per diverse specie, forme di crescita o anche per specifiche vie di adesione. Infine, alcune molecole di adesione possono richiedere un contatto prolungato con i ligandi affinché si verifichi un forte legame. In tali casi, può essere preferibile un saggio di adesione statica, come quello spesso eseguito in piastre a 96 pozzetti.

Nessuna divulgazione.

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della cattedra William e Mary Oh-William e Elsa Zopfi in Pediatria per la ricerca perinatale, dal Kilguss Research Core e da un Institutional Development Award (IDeA) dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P30GM114750.