التصاق المبيضات بزلالوم مصل الأبقار تحت القص السائل

الالتصاق هو خطوة أولى مهمة في الاستعمار والتسبب في المبيضات. هنا ، يتم وصف الفحص في المختبر لقياس التصاق C. parapsilosis عزلات للبروتينات المجمدة تحت قص السوائل. يتم استخدام جهاز الموائع الدقيقة متعدد القنوات لمقارنة عينات متعددة بالتوازي ، متبوعا بالقياس الكمي باستخدام التصوير الفلوري.

المطثية البالوبسيلوسيس (Cp) هو سبب ناشئ لالتهابات مجرى الدم لدى بعض السكان. تعمل كليد المبيضات ، بما في ذلك CP ، على تطوير مقاومة متزايدة للسطرين الأول والثاني من مضادات الفطريات. غالبا ما يتم عزل Cp عن اليدين وأسطح الجلد ، وكذلك الجهاز الهضمي. الاستعمار بواسطة المبيضات يهيئ الأفراد للإصابة بالتهابات مجرى الدم الغازية. لاستعمار المضيف أو غزوه بنجاح ، يجب أن تكون الخميرة قادرة على الالتصاق بسرعة بأسطح الجسم لمنع القضاء عليها بواسطة آليات دفاع المضيف. نصف هنا طريقة لقياس التصاق Cp بالبروتينات المجمدة تحت قص السوائل الفسيولوجية ، باستخدام مقايسة التصاق نقطة النهاية في جهاز موائع دقيقة متعدد القنوات متاح تجاريا. تم تحسين هذه الطريقة لتحسين قابلية التكاثر ، وتقليل الذاتية ، والسماح بالقياس الكمي الفلوري للعزلات الفردية. نوضح أيضا أن بعض العزلات السريرية ل Cp تظهر زيادة الالتصاق عند نموها في ظروف تحاكي مضيف الثدييات ، في حين أن سلالة المختبر المستخدمة بشكل متكرر ، CDC317 ، غير لاصقة تحت قص السوائل.

المبيضات هي كائنات متعايشة شائعة على جلد الإنسان والغشاء المخاطي يمكن أن تؤدي إلى أمراض غازية بين الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة مع مراضة ووفيات كبيرة مرتبطة بها وتكلفتها^1،2،3. على الرغم من أن المطثية البيضاء لا تزال سببا مهما لهذه العدوى ، إلا أن الأنواع غير البيضاء مثل C. parapsilosis و C. glabrata و C. krusei و C. tropicalis و C. auris يتم التعرف عليها بشكل متزايد ، خاصة في الفئات السكانية الضعيفة وذات المقاومة المتكررة للأدوية المضادة للفطريات^{المتاحة 4}. تقدم الأنواع غير البيضاء عناصر مميزة من علم الأحياء والتسبب في المرض قيد التحقيق النشط.

الالتصاق هو خطوة أولى مهمة في الاستعمار والتسبب في المرض. لذلك قد يوفر التدخل في هذه الخطوة فرصة لوقف تطور المرض في مرحلة مبكرة. ركزت دراسات التصاق المبيضات وغزوها في الغالب على الظروف الثابتة^5،6. ساعدت هذه الدراسات في تحديد بنية ووظائف الالتصاقات الفطرية في المرض^7،8،9. ومع ذلك ، يجب أن يحدث الالتصاق في مجرى الدم ، والجهاز الهضمي (GI) ، والمسالك البولية ، وفي القسطرة في ظل ظروف تدفق قص السوائل التي تضع قيودا فريدة على الالتصاق. يتطلب الالتصاق تحت القص تشكيلا سريعا لرابطة الصيد والقدرة على تحمل قوى السحب القوية الناتجة عن حركة السوائل^10،11. ال C. albicans اللاصق ، Als5 وقد ثبت أنه يسهل الالتصاق المعتمد على القص^12،13. لقد ثبت سابقا أن CpAls7 (CpALS4800) يتوسط في التصاق Cp بالخلايا الظهارية ، وأظهرت الضربة القاضية انخفاضا في الفوعة في نموذج عدوى المسالك^{البولية 14}. لقد أظهرنا أن CpALS4800 يعزز الالتصاق في ظل ظروف قص السوائل ذات الصلة من الناحية^{الفسيولوجية 15}.

تمت دراسة استعمار المبيضات والتسبب في المرض على نطاق واسع في النماذج الحيوانية^16،17،18. النماذج الأكثر استخداما هي التهابات الغشاء المخاطي ومجرى الدم في الفئران ، لكن نماذج اللافقاريات ، مثل يرقات الغاليريا ، يتم استخدامها بشكل متزايد بسبب التكلفة المنخفضة والإنتاجية السريعة والبساطة. تلخص النماذج الحيوانية العديد من خطوات عملية المرض البشري في كل من العامل الممرض والمضيف ، بما في ذلك الاستجابات المناعية التكيفية والفطرية للمضيف ، وتفاعلات الخميرة مع الأنسجة والميكروبات ، واستجابات الخميرة للبيئة المضيفة. في المقابل ، تسمح فحوصات الالتصاق المختبري بالتركيز بشكل خاص على خطوة الالتصاق ، وعلى التلاعب التجريبي بالمتغيرات مثل قوة القص ، وظروف نمو الخميرة ، والالتصاق بركائز معينة.

نظرا لأن Cp قادر على النمو في كل من البشر والمصادر البيئية ، فمن المحتمل أن يكون قادرا على استشعار البيئات المختلفة والاستجابة لها. دعما لهذه الفكرة ، تظهر العزلات السريرية المتعددة ل Cp التصاق منخفض تحت قص السوائل عند زراعتها في وسط نمو الخميرة القياسي ، الخميرة - البيبتون - سكر العنب (YPD) ، ولكنها تتحول إلى التصاق قوي عند نموها لبضع ساعات عند 37 درجة مئوية في وسط زراعة الأنسجة 199 (M199) ^15،19. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لمقايسة الإنتاجية المتوسطة التي تسمح بقياس التصاق عينات الخميرة المتعددة التي تعمل بالتوازي ، في ظل ظروف محددة من النمو وقص السوائل ودرجة الحرارة والركيزة. تم تصميم الاختبار لزيادة قابلية التكاثر إلى أقصى حد ، وللسماح باستخدام العزلات السريرية ل Cp ، بالإضافة إلى السلالات التي تم التلاعب بها تجريبيا في المختبر. يوضح الاختبار كما هو موضح هنا ، للتصاق Cp بركيزة ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، أن العزلات السريرية تظهر مجموعة من الالتصاق ، في حين أن سلالتين معمليتين شائعة الاستخدام ، CDC317 و CLIB214 تظهر ضعف التصاق.

المبيضات spp. تصنف على أنها كائنات من المستوى 2 من السلامة البيولوجية ويجب التعامل معها باستخدام الاحتياطات المناسبة.

1. نمو وتحريض السلالات السريرية

1. سلالات Streak Cp على مستخلص الخميرة 1٪ (م / حجم) ، 2٪ (م / حجم) بيبتون ، 2٪ (م / حجم) سكر العنب (YPD) 2٪ (م / حجم) ألواح أجار ، وتنمو عند 22 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق على مقعد المختبر وإعادة استخدامها خلال الأسبوع التالي.
2. في اليوم السابق لمقايسة الالتصاق ، انقل ما يقرب من 6 مستعمرات من كل سلالة إلى قارورة Erlenmeyer (مخروطية) سعة 250 مل تحتوي على 10 مل من وسط YPD. تنمو بين عشية وضحاها في شاكر ميكروبيولوجي مضبوطة على 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب أن ينمو Cp لمدة 20-24 ساعة للوصول إلى المرحلة الثابتة في الثقافة السائلة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتنفيذ الخطوات التالية في يوم فحص الالتصاق.
   1. انقل 1 مل من المزرعة السائلة من قارورة Erlenmeyer إلى أنبوب ميكرو فوج.
   2. جهاز الطرد المركزي للثقافة بأقصى سرعة في ميكرو فوج (16,000 × جم) لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الماء المعقم وكرر هذه الخطوة لما مجموعه ثلاث غسلات.
   3. في نهاية الغسيل الأخير ، قم بتعليق الحبيبات في 1 مل من الماء المعقم. استخدم أطراف ماصة ذات فتحة عريضة بأحجام 1 مل و 200 ميكرولتر للتعامل مع تعليق الخميرة أثناء هذه الخطوات والخطوات اللاحقة.
      ملاحظة: تلتصق العديد من السلالات اللاصقة من Cp بجوانب قارورة Erlenmeyer ، وتتطلب كشطا ميكانيكيا لإزالتها.
4. عد خلايا الخميرة باستخدام مقياس كثافة الدم أو جهاز مكافئ. خفف ثقافة الخميرة لتحقيق تركيز قابل للعد بشكل معقول من 50-200 خلية خميرة. استخدم مخففا بمقدار 500 ضعفا ، ضع 20 ميكرولتر في 10 مل من الماء.
   ملاحظة: تنمو معظم سلالات Cp إلى 10^{8-10 9} خلايا / مل في ثقافة اهتزاز بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتخفيف مزرعة الخميرة ب 2 مل من YPD أو Medium 199 (M199) ، بتركيز نهائي 3 × 10⁶ خلايا / مل في أنبوب ميكرو فوج سعة 2 مل. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.

2. طلاء القنوات الموائع الدقيقة

1. قم بإعداد محلول 2٪ (م / حجم) مسبقا من BSA في محلول الملح المتوازن من Hank الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS +). للقيام بذلك ، قم برش 4 جم من مسحوق BSA برفق على سطح 200 مل من HBSS + واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة دون إزعاج للسماح للبروتين بالتبلل ثم الذوبان. قم بتعقيم المحلول بتصفية وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. قم بتسخين 2.5 مل من هذا المحلول إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل ، مع إبقائه معقما.
   ملاحظة: الاحترار ضروري لتقليل تكوين الفقاعة في لوحة القناة الدقيقة.
3. أثناء ارتفاع درجة حرارة BSA ، انقل وحدة التحكم في الموائع الدقيقة إلى غطاء مزرعة الأنسجة ، وقم بتشغيل الجهاز وابدأ تشغيل البرنامج.
4. ضع واجهة السوائل داخل الحقل المعقم ، وقم بتنظيف حشية السيليكون برفق باستخدام مناديل ورقية خالية من النسالة مبللة بالكحول بنسبة 70٪ (حجم / حجم). تجنب ملامسة الكحول لفترات طويلة أو متكررة مع لوحة الأكريليك لمنع جنون البلاستيك أو تكسيره.
5. جفف الواجهة بالهواء (متجهة لأعلى) في غطاء المحرك باستخدام نظام تدفق الهواء لإزالة جميع آثار الكحول.
6. أضف 100 ميكرولتر من محلول BSA الدافئ مسبقا كقطرة في المسافة البادئة المركزية لكل قناة من قنوات "المخرج" (الشكل 1 أ) للوحة 48 بئر ، 24 قناة دقيقة.

الشكل 1. تخطيط فحص الموائع الدقيقة. (أ) زوج من القنوات، يبين تدفق السوائل العكسي من "المخرج" إلى "المدخل". يتم عرض الحقول المتتالية المتتالية التي تم التقاطها بواسطة المجهر بخطوط منقطة (1-10 للقناة العلوية ، و 11-20 للقناة السفلية). (ب) إعداد برنامج التحكم في الموائع الدقيقة للتدفق العكسي أثناء طلاء BSA (الخطوة 2.10). لقطات الشاشة المستنسخة هنا بإذن من الشركة المصنعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. ضع الواجهة في الجزء العلوي من لوحة القناة الدقيقة ، وقم بمحاذاة البراغي الأربعة للواجهة مع المقابس المقابلة لها في اللوحة.
8. شد البراغي باستخدام أصابع القفازات. اعلم أن مقاومة شد اليد تشير إلى اختلال المحاذاة. إذا حدث هذا ، ارفع الواجهة قليلا وأعد تثبيتها ، واستأنف تثبيت البراغي.
9. عندما تكون البراغي محكمة الإصبع ، استخدم مفتاح عزم الدوران لإحكام الواجهة بشكل أكبر.
10. باستخدام واجهة برنامج الموائع الدقيقة (الشكل 1 ب) ، اضبط الوضع على يدوي. استخدم خيار Fluid الافتراضي (Water@19degC) لكلتا مجموعتي الأعمدة واضبط القص على 1 dyn/cm^2.
    1. قم بتنشيط أعمدة "المخرج" (# 2،4،6،8) لضخ السائل نحو "المداخل". تشغيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
11. افحص بصريا كل "مدخل" جيدا من خلال النظر من خلال الجزء السفلي من لوحة القناة الدقيقة للتأكد من أن قطرة من محلول BSA قد تم تجميعها في كل "مدخل". هذا يؤكد أن جميع القنوات ال 24 قد تم ترطيبها وملؤها بنجاح.
12. قم بفك الواجهة وقم بتعبئة كل بئر ("مداخل" و "منافذ") ب 250 ميكرولتر من HBSS + بدون BSA لمنع جفاف القنوات ووضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 48 ساعة لامتصاص البروتينات بشكل موحد على أسطح القناة للوحة القناة الدقيقة. بعد طلاء البروتين ، يمكن تخزين الألواح لمدة تصل إلى أسبوعين في بيئة رطبة (مثل حاضنة زراعة الأنسجة ذات الرطوبة المشبعة بنسبة 100٪) قبل استخدامها في فحوصات الالتصاق. لفترات أطول ، لف الألواح بغشاء بلاستيكي لمنع التبخر.

3. فحص الالتصاق

1. أثناء حضانة الخميرة في YPD و M199 (الخطوة 1.5) ، قم بشفط آبار مدخل ومخرج لوحة القنوات الدقيقة المطلية ب BSA ، دون إزعاج القناة التي تمتد من المسافة البادئة المركزية لكل بئر (الشكل 1 أ). بدلا من ذلك ، استنشق من حافة البئر. أضف 1 مل من HBSS + إلى آبار "المخرج".
2. قم بتوصيل واجهة الموائع الدقيقة على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 2.5). استخدم إعداد السائل الافتراضي السائل عند (Water@19degC) والقص عند 2 دين/سم^2 في درجة حرارة الغرفة لغسل القناة وإزالة أي BSA غير مرتبط. يغسل لمدة 2-3 ساعات بمعدل التدفق هذا.
3. قم بإزالة الواجهة من لوحة القناة الدقيقة. قم بتشغيل وحدة تسخين اللوحة الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة وتأكد من ضبطها على 37 درجة مئوية.
4. قم بشفط الوسط من جميع الآبار الموجودة على اللوحة وأضف 0.5 مل من الخميرة المستحثة من الخطوة 1.5 إلى كل زوج من "المنافذ". أعد تعليق الخميرة تماما عن طريق قلب الأنابيب سعة 2 مل 3-6 مرات ، وقم بعمل الماصة برفق لأعلى ولأسفل مباشرة قبل إضافة الآبار. اترك آبار "المدخل" فارغة.
5. اربط واجهة السوائل بلوحة القناة الدقيقة كما في الخطوة 2.5 أعلاه. استخدم برنامج الجهاز لضبط Fluid على HBSS@37degC ، و Shear إلى 5 dyn/cm ^ 2.
   1. قم بتنشيط أعمدة "المخرج" (# 2،4،6،8) لضخ السائل نحو "المداخل". قم بتشغيله على سخان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، للسماح للخميرة بالالتصاق بالقناة المطلية ب BSA.
6. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد مخزن الغسيل. إلى 30 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +) أضف 5 ميكرومتر من الكالكوفلور ، والذي يتم تضمينه لجعل الخميرة فلورية لاكتشافها. تدفئ في الحمام عند 37 درجة مئوية.
7. في نهاية الالتصاق لمدة 30 دقيقة، أوقف التدفق مؤقتا باستخدام واجهة البرنامج دون تغيير ظروف التدفق الأخرى. قم بفك الواجهة واستنشاق جميع الآبار ("المداخل" و "المنافذ").
8. أضف 1 مل من محلول غسيل الكالكوفلور إلى "المنافذ". أعد توصيل واجهة الموائع ، واستأنف التدفق باستخدام البرنامج لمدة 10 دقائق أخرى. تم تصميم هذه الخطوة لغسل الخميرة غير الملتصقة والملتصقة بشكل فضفاض ، وفي نفس الوقت تلطيخ الخميرة الفلورية في القناة.
9. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة واجهة السوائل واستبدلها بغطاء. نظف الجزء السفلي من لوحة القناة الدقيقة برفق بمنديل خال من النسالة وانتقل إلى التصوير.

4. التصوير والقياس الكمي

1. ضع لوحة القناة الدقيقة في حامل مرحلة مجهر مناسب. استخدم عدسة موضوعية 20x ، والتي ستسمح بمجال رؤية بحيث تملأ القناة ما يقرب من نصف ارتفاع الصورة. حدد موقع الطرف الأيسر من القناة 1 (في "المدخل" 1). اضبط المرحلة بحيث يتم وضع القناة كما في الشكل 1 أ ، الموضع 1.
2. احصل على صورة واحدة للحقل الساطع للقناة. قم بقياس مساحة مساحة القناة بالميكرومتر² ، باستخدام أداة قياس المستطيل لتطبيع قياسات المنطقة أثناء تحليل البيانات (انظر المناقشة).
3. يؤدي التبديل إلى قناة الفلورسنت DAPI (الإثارة 395 نانومتر ، الإرسال 440/40 نانومتر) إلى ضبط التركيز البؤري على الخميرة الملتصقة على السطح السفلي للقناة. قفل التركيز البؤري التلقائي في هذه المستوى. اضبط شدة الإثارة الفلورية على 1.5٪ وظروف التعرض للكاميرا (تجميع 2x2 ، تعريض ضوئي 15 مللي ثانية ، 12 بت ، كسب 4) لتجنب تشبع مستشعر الصورة.
4. استخدام المرحلة الآلية واكتساب ND | يلتقط XY Imaging في برنامج التحكم في المجهر تلقائيا سلسلة متتالية من الصور غير المتداخلة متباعدة مجال رؤية واحد (666 ميكرومتر) من زوج القناة الأولى (1/2).
   1. اجمع 10 صور من اليسار إلى اليمين للقناة العلوية ، وقم بتحريك 666 ميكرومتر لأسفل واجمع 10 صور أخرى من اليمين إلى اليسار للقناة السفلية (كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 1 أ).
   2. استخدم الخيار Relative XY ، بحيث بمجرد تحديد مواضع الصورة ، يمكن تشغيل سلسلة مماثلة لكل زوج من القنوات ، بعد تحديد بداية القناة يدويا.
   3. جمع الصور في قناة DAPI (اكتساب ND | λ | DAPI).
5. راقب الصور للتأكد من بقاء القناة داخل مجال الرؤية حيث تحرك المرحلة الآلية اللوحة.
   ملاحظة: سيتم حفظ كل مجموعة من 20 صورة من زوج قنوات تلقائيا باسم ملف متتالي عن طريق الحصول على ND.
6. استخدم وظيفة autostep (XYZ Navigation | الخطوة XY) لتحريك 25750 ميكرومتر لأسفل إلى "المدخل" 3. ضبط موضع القناة يدويا كما في الخطوة 4.1. التقط المجموعة التالية من الصور (اكتساب ND) لزوج القنوات 3/4.
7. كرر هذه العملية ، حتى يتم تصوير جميع أزواج القنوات ال 12 ، مع حفظ النتائج في 12 ملفا. اتبع طلب الشركة المصنعة للقنوات من 1 إلى 24.
8. دمج جميع مجموعات الصور الفلورية البالغ عددها 12 في ملف واحد (ملف | دمج مستندات ND). تأكد من أن ترتيب الملفات يطابق الترتيب الذي تم التقاط مجموعات الصور ال 12 به.
9. استخدام ثنائي | عتبة لفصل الخميرة عن الخلفية بناء على مستوى تألقها. قم بتطبيق نفس الحد على مجموعة الصور بأكملها.
   ملاحظة: عادة ما يكون الحد الأدنى لشدة التدرج الرمادي 12 بت البالغ 500، والحد العالي الذي تم ضبطه على الحد الأقصى 4095 أمرا نموذجيا.
10. قياس منطقة العتبة (القياس | إجراء القياس | جميع الإطارات). فتح التقرير (عناصر تحكم التحليل | نتائج القياس الآلي) والتحقق من البيانات.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنشاء جدول قياسات ل 240 صورة (20 صورة من كل زوج من 12 زوجا من القنوات)، ويتم سرد منطقة العتبة لكل صورة في العمود المسمى BinaryArea [μm²].
11. تصدير البيانات إلى ملف نصي محدد بعلامات جدولة (تصدير).

باستخدام الطرق الموضحة في قسم البروتوكول ، تمت مقارنة التصاق 6 سلالات من Cp (الجدول 1)

الجدول 1. سلالات المبيضات المباراة المستخدمة في هذه الدراسة.

كانت أربع من السلالات عبارة عن عزلات سريرية حديثة برقم ممر^{منخفض 29،30} و CLIB214 و CDC317 هي سلالات شائعة الاستخدام كانت موجودة في ثقافة المختبر لسنوات عديدة. لوحظت مجموعة واسعة من مؤشرات الالتصاق ، من 0.2٪ إلى 91٪ (الشكل 2). أظهرت ثلاث عزلات سريرية (JMB81 و JMB77 و Ro75) التصاق قوي عند نموها في M199. ومن المثير للاهتمام أن كلتا السلالتين المختبريتين أظهرتا التصاق ضعيف نسبيا في أي من وسطي النمو. العزلة السريرية الثالثة ، WIH04 ، تشبه سلالات المختبر ذات الالتصاق الضعيف نسبيا.

الشكل 2. مقايسة الالتصاق تقارن 6 عزلات من المبيضات parapsilosis. نمت العزلات لمدة 3 ساعات في وسط YPD أو M199 قبل اختبار الالتصاق كما هو موضح في البروتوكول. يمثل الرسم البياني المتوسط ، ويمنع الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط من أربع تجارب متتالية ، مع قنوات مكررة في كل تجربة. يمثل مؤشر الالتصاق النسبة المئوية لسطح قناة التدفق التي كانت مغطاة بالخميرة. تم إجراء مقارنات مع تحليل التباين (ANOVA). تم إجراء مقارنات بين المجموعات مع اختبار هولم سيداك. * ، P < 0.001. مقارنات YPD-M199 ليست ذات دلالة إحصائية ل WIH04 و CLIB214 و CDC317. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج المعروضة هنا مأخوذة من أربع تجارب متتالية ، يتم إجراؤها في أيام مختلفة. إنها توضح قابلية تكرار مقايسة الالتصاق.

يمكن تحليل البيانات الناتجة عن البروتوكول أعلاه باستخدام برنامج جداول بيانات قياسي. يتم التعبير عن البيانات ك "مؤشر الالتصاق" ، والذي يتم حسابه على النحو التالي: يتم جمع قيمة BinaryArea لكل مجموعة من 10 صور (تمثل تغطية الخميرة لقناة واحدة) عبر الصور ، ويتم حساب المتوسط والانحراف المعياري للمساحة المجمعة لكل زوج من القنوات. تمثل مساحة القناة المقاسة في الخطوة 4.2 أقصى مساحة ممكنة في مجال رؤية واحد قد تكون مغطاة بالخميرة. في هذا البروتوكول ، يتم تسجيل الطول الكامل للقناة في 10 صور متتالية ، والتي تمثل مساحة تقارب 2.5 مم². يتم ضرب هذه المنطقة من الخطوة 4.2 في 10 لتمثيل طول القناة ، وتستخدم القيمة لتطبيع الوسائل والانحرافات المعيارية للتعبير عنها كنسب مئوية لمؤشر الالتصاق. يقيس هذا بشكل فعال مساحة سطح القناة المغطاة بالخميرة ، مع مؤشر التصاق بنسبة 100٪ يشير إلى أن طول القناة بالكامل كان مغطى بالخميرة من الحافة إلى الحافة ، وهي مساحة تبلغ حوالي 2.5 مم². يشير مؤشر الالتصاق البالغ 0٪ إلى أنه لم يحقق بكسل واحد عتبة التألق. تشير هذه الحالة إلى أن الأبيض الكالكوفلوري لم تتم إضافته ، أو أن القناة كانت مسدودة ، وفشلت خلايا الخميرة في الدخول.

تم قياس التصاق الخلية تحت قص السوائل المحدد لأول مرة باستخدام غرف تدفق الألواح المتوازية²⁰. عادة ما تستخدم غرف التدفق المصممة خصيصا شرائح المجهر أو زلات الغطاء كقواعد وقدمت قناة واحدة للقياس^21،22،23. باستخدام نسخة تجارية من غرفة التدفق هذه ، تم العثور على شكل الخميرة لاثنين من C. albicans سلالات ترتبط بقوة أكبر بالبطانة من الشكل الخيطي أو الخيوط^{الكاذب 24}.

فتح تطوير نظام غرفة التدفق متعدد القنوات إمكانية فحوصات التصاق الإنتاجية الأعلى. تعتبر أجهزة غرفة التدفق والإمدادات التي تستخدم لمرة واحدة مكلفة ، لكنها توفر توحيدا للتصنيع يقلل من التباين التجريبي. استخدم Finkel et al. هذا النظام لقياس التصاق C. albicans بمادة السيليكون المستخدمة في صنع وجه واحد للقناة كنموذج للمرض المرتبط بالقسطرة^{الوريدية 25}. استخدمته مجموعة أخرى لقياس التصاق C. albicans و Saccharomyces cerevisiae بالقنوات المطلية ب BSA ، متبوعا بتصوير تباين الطور (المجال الساطع) لمجال رؤية واحد ، متبوعا بعد الخلايا المستند إلى^{البرامج 12}. استخدمت مجموعة ثالثة نفس النظام متعدد القنوات لتقييم تكوين الأغشية الحيوية في C. albicans التي تتفاعل مع القنوات غير المطلية ، باستخدام التصوير الساطع على مدى عدة ساعات²⁶.

في البروتوكول الحالي ، تم استخدام نظام التدفق متعدد القنوات لقياس خطوة الالتصاق ل Cp على وجه التحديد. تساعد العديد من التعديلات على زيادة دقة القياس الكمي ، وتعظيم النطاق الديناميكي ، وتقليل احتمالية حدوث انسكابات بيولوجية ، وتقليل التباين. الأهم من ذلك ، أن نظام الموائع عادة ما يتم تشغيله في الاتجاه الأمامي ، مع تدفق السائل من "المدخل" إلى "المخرج". بالإضافة إلى قسم المشاهدة في القناة ، هناك أيضا منطقة أفعوانية أضيق لمسار التدفق والتي تستخدم لتوفير مقاومة هيدروليكية للتدفق. تميل هذه المنطقة إلى اصطياد الخميرة. في النهج الحالي ، يتم تشغيل تعليق الخميرة في اتجاه عكسي ، من "المخرج" إلى "المدخل" (الشكل 1 أ). في هذا الاتجاه ، تقع منطقة السربنتين في اتجاه مجرى قسم المشاهدة ، مما يقلل من القلق من محاصرة خلايا الخميرة.

تؤثر ظروف نمو Cp مباشرة قبل مقايسة الالتصاق بشدة على الالتصاق ، كما هو الحال مع طلاء القناة ببروتينات BSA أو مصفوفة خارج الخلية¹³. لقد تبين سابقا أن Cp يلتزم ب BSA ، والكولاجين ، والجيلاتين ، والفيبرونكتين ، وكذلك القنوات المطلية بالمصل¹⁵. لوحظ أن الالتصاق بسطح القناة غير المطلي ضعيف للغاية. أدى النمو في وسط خلايا الثدييات (M199) أو المصل إلى زيادة الالتصاق. من المهم ملاحظة أنه على عكس C. albicans ، لم يظهر Cp مورفولوجيا خيطية في مدة 5 ساعات من هذا الفحص. يؤثر معدل القص بشدة على الالتصاق ، حيث لوحظ أقصى قص عند 5 داينات / سم² ، وهو مشابه للدم في الشعيرات الدموية والأوردة ما بعد الشعيرات الدموية^27،28.

لتقليل احتمالية حدوث انسكابات بيولوجية ، يتم تنفيذ نمو الخميرة والالتصاق تحت قص السوائل وخطوات الغسيل باستخدام احتياطات علم الأحياء الدقيقة من المستوى 2 للسلامة البيولوجية على مقعد المختبر. بعد هذه الخطوات ، يتم فك لوحة الموائع الدقيقة عن الجهاز ، ويتم تنظيف اللوحة الخارجية وتغطيتها ، ويتم تصوير اللوحة المغلقة في مرحلة المجهر. يقلل هذا النهج من خطر تلوث منطقة المجهر.

يستخدم هذا البروتوكول اللون الأبيض الكالكوفلوري لتلطيخ جدران خلايا الخميرة. تم تصميم هذا النهج للسماح بالتصوير الفلوري للعزلات السريرية ، دون الحاجة إلى التلاعب الجيني لإضافة علامات بروتين الفلورسنت مثل GFP. تسمح عتبة الفلورسنت بقياس مساحة السطح المغطاة بخلايا الخميرة. لتقليل التداخل المحتمل مع الالتصاق ، تضاف الصبغة بعد خطوة الالتصاق ، أثناء الغسيل. تلطيخ الكيتين هو الأكثر كثافة في ندبات البراعم ، ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم سلالات CP ، يوجد تلطيخ منتشر حول المحيط بأكمله. في نظام الفحص الحالي ، يسمح استخدام التكبير المنخفض ، وتجميع البكسل ، والضبط الدقيق لعتبة التألق بقياس خلية الخميرة بأكملها. ومع ذلك ، من المهم مراعاة كفاءة التلوين للسلالات التي تختلف اختلافا كبيرا في محتوى الكيتين. وينبغي تحديد ذلك في التجارب الأولية، أو عن طريق فحص جزء من القناة تحت تكبير أعلى قبل الحصول على الصورة.

قد يختلف الالتصاق على طول قناة العرض. من خلال جمع التألق على طول القناة ، يتم تقليل التباين والذاتية التي يوفرها واحد أو عدد صغير من مجالات الرؤية. وبدلا من ذلك، يستخرج النهج الحالي أقصى قدر من المعلومات المتاحة من لوحة الموائع الدقيقة عن طريق التقاط القناة بأكملها. يتم تسهيل التصوير بشكل كبير من خلال المرحلة الآلية وآلية التركيز البؤري التلقائي للتصوير السريع المبلط لطول القناة (الشكل 1 أ) مع القليل نسبيا من المدخلات اليدوية. يؤدي استخدام أهداف الطاقة المنخفضة إلى زيادة مجال الرؤية ، مما يسمح بدوره بالانجراف الطفيف في الموضع حيث يتم مسح القناة ضوئيا بواسطة المرحلة الآلية. نظرا لأن التفاوتات في تصنيع اللوحة تؤدي إلى تباين طفيف في المواقع الدقيقة للقنوات ، فلا يمكن تصوير جميع القنوات ال 24 / 240 صورة في عملية واحدة. النهج المستخدم هنا (قناتان و 20 صورة في المرة الواحدة) هو حل وسط. ومع ذلك ، باستخدام هذا النهج ، من الممكن إكمال إجراء التصوير والقياس الكمي (الخطوات 4.1-4.11) في حوالي 15 دقيقة.

باستخدام هذا الإعداد لقياس التصاق العزلات السريرية ، لوحظت مجموعة واسعة من مؤشرات الالتصاق من 0.2٪ إلى 91٪. ومن المثير للاهتمام ، أن سلالتين من سلالات Cp المستخدمة بشكل متكرر ، CLIB214 و CDC317 أظهرتا التصاق ضعيف (الشكل 2). تشير هذه الملاحظات إلى أن هناك تباينا كبيرا بين عزلات Cp ، وأن الاختبار يمكن أن يوفر بيانات الالتصاق عبر نطاق ديناميكي واسع.

تشمل الاختلافات أو التعديلات المحتملة لهذا الاختبار استخدام أنواع مختلفة من الفطريات. تقريبا يمكن استخدام أي نوع يلطخ بالفلور بالكالكوفلور في هذا الاختبار ، على الرغم من أنه قد يتطلب ركائز أو ظروف نمو مختلفة. يمكن استيعاب الفطريات التي تختلف اختلافا كبيرا في قوة الالتصاق عن طريق تغيير قوة القص أو مدة الالتصاق أو خطوات الغسيل. من الممكن أيضا زراعة طبقات أحادية من الخلايا البطانية أو الخلايا الظهارية في قنوات التدفق ، وقياس التصاق الخميرة بالخلايا المضيفة. تميل خلايا الثدييات إلى استبعاد الكالكوفلور ، وتقدم عموما خلفية فلورية منخفضة ، بحيث لا يزال من الممكن الكشف الدقيق عن الخميرة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن فحوصات الالتصاق بين نوعين من الخلايا تتطلب جهدا أكبر بكثير للحفاظ على كل من الخلايا الفطرية والثديية في حالة فسيولوجية مثالية.

تشمل قيود الفحص صعوبة تحليل السلالات شديدة الالتصاق. قد تفشل السلالات الفطرية التي تشكل كتل كبيرة في دخول القناة الدقيقة ، أو تعيق التدفق داخل القناة. تواجه هذه الصعوبة مع خيوط المطثية البيضاء البيضاء. إذا سمح لها بالنمو لفترة طويلة ، فإن خيوط الخيوط تشكل حصائر لزجة تسد القناة. قيد آخر هو تحديد ظروف النمو التي تعزز الالتصاق. قد تختلف هذه باختلاف الأنواع أو أشكال النمو أو حتى لمسارات التصاق محددة. أخيرا ، قد تتطلب بعض جزيئات الالتصاق اتصالا طويلا مع الروابط لحدوث ارتباط قوي. في مثل هذه الحالات ، قد يكون من الأفضل إجراء مقايسة الالتصاق الساكن ، مثل التي يتم إجراؤها بشكل متكرر في ألواح 96 بئرا.

لا إفصاحات.

تم دعم هذا العمل بمنحة من أستاذية ويليام وماري أوه ويليام وإلسا زوفي في طب الأطفال لأبحاث الفترة المحيطة بالولادة ، ومركز أبحاث كيلجوس ، وجائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم P30GM114750.