Preparazione di fette cerebrali acute dal polo dorsale dell'ippocampo da roditori adulti

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per produrre fette dell'ippocampo dorsale per l'esame elettrofisiologico. Questa procedura impiega la perfusione con ACSF raffreddato prima della preparazione della fetta con un angolo di taglio vicino alla coronale che consente la conservazione dei neuroni principali sani.

Le registrazioni di patch-clamp su cellule intere da fette di cervello di roditori acuti sono un pilastro della moderna ricerca neurofisiologica, consentendo una misurazione precisa delle proprietà cellulari e sinaptiche. Ciononostante, oltre all'elettrofisiologia a fette, vi è una sempre maggiore necessità di eseguire analisi correlate tra diverse modalità sperimentali, ad esempio: immunoistochimica, biologia molecolare, imaging in vivo o registrazione elettrofisiologica; per rispondere a domande sempre più complesse sulla funzione cerebrale. Tuttavia, trarre conclusioni significative da questi vari approcci sperimentali non è semplice, poiché anche all'interno di strutture cerebrali relativamente ben descritte, esiste un alto grado di variazione sub-regionale della funzione cellulare. In nessun altro luogo questo è meglio esemplificato che nel CA1 dell'ippocampo, che ha proprietà dorso-ventrali ben definite, basate su proprietà cellulari e molecolari. Tuttavia, molti studi pubblicati esaminano i modelli di espressione proteica o l'attività in vivo correlata comportamentale nell'estensione dorsale dell'ippocampo; e spiegare i risultati meccanicisticamente con l'elettrofisiologia cellulare dalla regione ventro-mediale. Ciò è ulteriormente confuso dal fatto che molti esperimenti elettrofisiologici di taglio acuto vengono eseguiti in animali giovani, mentre altre modalità sperimentali vengono eseguite in animali più maturi. Per affrontare questi problemi, questo metodo incorpora la perfusione transcardica di roditori maturi (>60 giorni) con liquido cerebrospinale artificiale, seguita dalla preparazione di fette coronali modificate, compreso il polo settale dell'ippocampo dorsale, per registrare dalle cellule piramidali CA1. Questo processo porta alla generazione di fette acute sane dell'ippocampo dorsale, consentendo l'interrogazione elettrofisiologica cellulare basata su fette abbinata ad altre misure.

L'ippocampo è probabilmente la struttura più studiata nel cervello dei mammiferi, a causa delle sue dimensioni relativamente grandi e della struttura laminare prominente. L'ippocampo è stato implicato in una serie di processi comportamentali: navigazione spaziale, memoria contestuale e formazione di episodi. Ciò è, in parte, dovuto alla relativa facilità di accesso alle porzioni dorsali dell'ippocampo nei roditori per l'analisi in vivo . Infatti, le principali celle di uscita sono in genere a meno di 2 mm dalla superficie del pial.

Nei roditori, l'ippocampo è una struttura relativamente grande, formata da un'invaginazione del telencefalo che si estende dal setto dorsale alla neocorteccia ventrale. È composto da 2 regioni principali: il giro dentato e il cornu ammonis (CA); quest'ultimo è diviso in 3 sottoregioni ben descritte (CA1-3) che si estendono nel giro ilato dentato (precedentemente noto come CA4), in base alla connettività, all'anatomia cellulare e alle proprietà genetiche¹. Questa struttura è mantenuta lungo l'estensione dorso-ventrale dell'ippocampo, anche se con importanti variazioni nelle proprietà sinaptiche ^2,3,4, nell'anatomia⁵, nella diversità genetica ^6,7,8 e nella funzione comportamentale ^9,10. Delle regioni CA, il sottocampo CA1 è composto in gran parte da cellule piramidali CA1 glutammatergiche (CA1 PC), per le quali sono stati definiti 3 sottotipi¹¹, e interneuroni inibitori che costituiscono ~10% dei neuroni, ma sono altamente diversificati con oltre 30 sottotipi definiti 12,13,14. Oltre alle differenze specifiche regionali, è stato dimostrato che l'invecchiamento normale ha effetti drammatici sulla trasmissione sinaptica ^15,16,17, sull'anatomia¹⁸ e sul profilo genetico¹⁹. L'attuale metodo gold standard per valutare la complessità delle proprietà cellulari e sinaptiche in modo controllato è attraverso l'uso di registrazioni di patch-clamp su cellule intere da fette cerebrali acute²⁰.

La comprensione della funzione dell'ippocampo si basa in gran parte sulla manipolazione dorsale a causa della facilità con cui vi si accede chirurgicamente o anatomicamente per compiti comportamentali, impianto di elettrodi o finestre di imaging o espressione di plasmidi virali. In molti studi, inoltre, queste procedure vengono eseguite con roditori tardivamente giovani o adulti per prevenire la variabilità della struttura cerebrale durante lo sviluppo. Nonostante ciò, molti approcci per esaminare l'elettrofisiologia cellulare e subcellulare vengono eseguiti in roditori giovani precoci e medi, per lo più dalla porzione ventro-mediale dell'ippocampo nel suo piano trasversale 21,22,23,24,25. Quando è stata valutata l'intera estensione dorso-ventrale, si utilizza un trincia-tessuto per mantenere l'estensione trasversale ^4,26, oppure l'esperimento è stato eseguito su giovani ratti²⁷ o topi²⁸. Inoltre, è noto che il raffreddamento del tessuto prima della dissezione del cervello preserva la struttura ippocampale nei ratti²⁹ e i neuroni neocorticali nei topi^30,31. Tuttavia, c'è una scarsità di dettagli riguardo alla produzione di fette di cervello dall'asse trasversale dorsale dell'ippocampo, come generato da fette coronali modificate, nei ratti maturi.

Questo protocollo descrive un approccio mediante il quale è possibile ottenere registrazioni di patch-clamp su cellule intere da singoli neuroni o coppie in fette coronali modificate di ippocampo dorsale da ratti anziani, seguite da un'identificazione morfologica post-hoc. Fette di cervello sane sono ottenute in seguito alla perfusione transcardica del liquido cerebrospinale artificiale raffreddato (ACSF), facilitando la misurazione delle proprietà elettrofisiologiche dai PC CA1 e dagli interneuroni locali.

Tutti gli animali sono stati generati e mantenuti secondo le linee guida del Ministero dell'Interno e delle Istituzioni (HO# P135148E). Tutti i ratti sono stati mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua.

1. Perfusione transcardica di ACSF refrigerato

1. Prima di tutti gli esperimenti, mettere ~200 mL di saccarosio-ACSF (Tabella 1) nel congelatore a -20 °C (fino a semi-congelamento, per affettare) e altri ~100-200 mL di saccarosio-ACSF filtrato su ghiaccio (per perfusione), gorgogliando con carbogeno (95% O₂/5% CO₂).
2. Raccogli un ratto adulto dalla sua gabbia domestica e mettilo per ~30 minuti in una gabbia di contenimento nella sala operatoria per acclimatarsi ai livelli di rumore e luce.
3. Preparare gli strumenti di dissezione (Figura 1A), l'area di perfusione e l'anestetico iniettabile (circa 1 mL di 200 mg/mL di pentobarbital sodio per una concentrazione finale di 100 mg/kg).
4. Preparare un'adeguata camera di anestesia inserendo all'interno un piccolo tampone di carta velina o cotone idrofilo. Introdurre 1-2 mL di anestetico isoflurano volatile nel materiale assorbente nella camera.
5. Metti il ratto in una camera di anestesia per sedarlo. Monitorare la respirazione fino a quando la frequenza respiratoria non scende a ~1 respiro superficiale al secondo.
6. A questo punto, iniziare a far bollire il saccarosio-ACSF semicongelato con carbogeno su ghiaccio da utilizzare durante l'affettatura.
7. Pesa il topo e annota il suo peso.
8. Anestetizzare terminalmente il ratto iniettando il pentobarbital di sodio preparato nella cavità intraperitoneale. La dose di pentobarbital sodico deve essere di 100 mg/kg, calcolata in base al peso precedentemente assunto e alla concentrazione di stock del farmaco. Posizionare il ratto in una camera di detenzione e attendere 0,5-5 minuti per l'inizio dell'anestesia terminale.
9. Confermare la cessazione dei riflessi: testare sia i riflessi del battito di ciglia corneale (toccare la pupilla) che quello del pizzicamento della zampa posteriore (sollevare la gamba e pizzicare la zampa posteriore) utilizzando una sonda smussata (cioè una pinza arrotondata). Una volta cessati i riflessi, inchiodare il ratto al pannello chirurgico di polistirene o sughero usando aghi ipodermici.
10. Aprire la cavità toracica e posizionare la cannula alla base del ventricolo sinistro del cuore. Forare l'atrio destro e iniziare immediatamente la perfusione con il saccarosio-ACSF ghiacciato (0-1 °C) (utilizzando una pompa peristaltica a 50 mL/minuto).
11. Una volta avvenuto il completo scambio di liquidi e il raffreddamento del corpo (<5 minuti), rimuovere la cannula e gli spilli, quindi decapitare utilizzando una ghigliottina.
12. Rimuovere con cautela e rapidità il cranio utilizzando le forbici per ossa e gli strumenti per ossa Rongeur (Figura 1A, 1B).
    1. Inizia facendo 2 tagli bilaterali attraverso il forame magno usando le forbici ossee e rimuovi il cranio dalla sutura lambda con i Rongeurs. Taglia con cura lungo la sutura della linea mediana con le forbici ossee fino a dietro gli occhi.
    2. Esegui 2 tagli bilaterali attraverso il cranio, perpendicolarmente alla linea mediana. Usando i Rongeurs, apri il teschio lungo la linea mediana. Prestare particolare attenzione a rimuovere la pia madre usando forbici sottili o un ago uncinato.
13. Estrarre il cervello dal cranio usando una spatola smussata, recidendo i nervi cranici e ottici con una compressione da un lato all'altro. Mettere il cervello in saccarosio-ACSF carbogenato, semicongelato (0-1 °C) per 1-2 minuti prima di affettare.

2. Preparazione di fette di cervello dall'ippocampo dorsale

1. Togliere il cervello perfuso dal saccarosio-ACSF semi-congelato (0-1 °C) e metterlo in una capsula di Petri di vetro rivestita con carta da filtro. Posiziona il cervello sulla sua superficie ventrale.
2. Usando un bisturi (lama n. 22), rimuovere la parte posteriore del cervello a ~10° dalla verticale per creare una superficie piana per incollare il cervello al tavolino (Figura 1C).
3. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilica sul palco del vibratomo. Stendere la colla per creare un film sottile più grande di circa il 50% rispetto all'area della sezione trasversale della superficie tagliata del cervello.
4. Solleva il cervello dal piatto di vetro su una spatola, con il lato tagliato verso il basso, usando un pennello per guidare il tessuto. Tamponare il cervello con un pezzo di tessuto per rimuovere l'eccesso di ACSF e far scorrere il cervello, la superficie tagliata verso il basso, al centro della colla. Usando una pipetta Pasteur, aggiungi 1-2 ml di saccarosio-ACSF ghiacciato sul cervello per rimuovere la colla dal blocco cerebrale.
5. Posizionare il cervello nella camera di affettatura e inondare con saccarosio semicongelato ACSF. Usa un cucchiaio o una spatola per tenere il ghiaccio in eccesso lontano dal blocco cerebrale, quindi carbognato (Figura 1D).
6. Spostare la lama del vibratomo in posizione: ~1 mm dalla superficie dorsale del cervello e verticalmente ~1 mm anteriormente alla bregma. Assicurarsi che la lama sia completamente immersa e rimuovere le bolle con un pennello.
7. Inizia a tagliare il cervello. Per tagliare fino all'ippocampo dorsale, utilizzare una velocità di 0,1-0,2 mm/s, con un movimento orizzontale della lama di 1-1,5 mm e una frequenza oscillatoria reciproca di ~90 Hz. Quando si affetta l'ippocampo dorsale, ridurre la velocità a 0,05-0,1 mm/s.
8. Raccogli fette di ippocampo dorsale (nominalmente 3-4 fette intere o 6-8 fette emiscate) per cervello. Se sono necessarie fette longitudinali di ippocampo ventro-mediale, continuare ad affettare. Una volta che l'ippocampo dorsale è stato tagliato, non è necessario tagliare il tessuto extra oltre approssimativamente la posizione del 3^{° ventricolo} . Fermare il vibratomo, separare la fetta con un ago ipodermico piegato e raccoglierla alla base della camera di affettamento.
   NOTA: Le fette possono avere uno spessore di 250-500 μm, a seconda dei requisiti sperimentali. Per le registrazioni dall'ippocampo dorsale, in genere utilizzare fette spesse 400 μm per preservare la maggior parte della rete locale, consentendo al contempo le condizioni di microscopia adeguate.
9. Taglia le fette in modo che contengano solo l'ippocampo e la corteccia sovrastante sotto un microscopio da dissezione. Trasferire le fette nella camera preriscaldata a 35 °C con la superficie anteriore rivolta verso l'alto.
10. Determinare la camera di stoccaggio in base all'esperimento da eseguire. Per ottenere registrazioni di alta qualità con patch-clamp a cellula intera o sul campo extracellulare vicino alla superficie della fetta in camere di registrazione sommerse, conservare in camere sommerse. In alternativa, conservare in una camera di interfaccia liquido/gas per le registrazioni dell'attività oscillatoria della rete o per le registrazioni del campo extracellulare dell'interfaccia.
11. In condizioni di conservazione sommersa, lasciare che le fette si riprendano a 35 ºC per 30 minuti dal momento in cui l'ultima fetta è entrata nella camera di conservazione. Ciò consente la riattivazione dei processi metabolici e la risigillatura dei neuriti tagliati. Dopo 30 minuti, trasferire la camera di conservazione a temperatura ambiente.

3. Registrazione dei neuroni dell'ippocampo dorsale

1. Fabbricare pipette di patch di registrazione da vetro capillare. Questo protocollo utilizza vetro borosilicato di 1,5 mm di diametro esterno e 0,86 mm di diametro interno con filamento, che produce una resistenza della punta di 3-5 MΩ quando riempito con soluzione intracellulare (Tabella 1). Conservare le soluzioni intracellulari refrigerate su ghiaccio per evitare la degradazione dei componenti energetici e filtrate prima dell'uso (filtro per siringa, dimensione dei pori: 0,2 μm).
2. Registrazione dell'ACSF del carbogenato e preriscaldamento a bagnomaria (35-40 ºC). Erogare l'ACSF carbogenato e preriscaldato alla camera di registrazione tramite un tubo di perfusione assistito da una pompa peristaltica. Iniziare la perfusione alcuni minuti prima di trasferire una fetta nella camera.
3. Fermare la perfusione e trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione con la superficie anteriore rivolta verso l'alto. Tieni la fetta in posizione con un anello di platino con singole fibre di seta attaccate per formare una forma ad "arpa". Posizionare le fette in modo che lo strato piramidale di CA1 scorra perpendicolarmente all'asse della prima pipetta di registrazione.
4. Riavviare il flusso di ACSF di registrazione carbogenato e preriscaldato (35-40 ºC) (Tabella 1) a una velocità ottimale di 6-8 mL∙^min-1.
   NOTA: Portate elevate (6-8 mL∙^min-1) sono ottimali per mantenere l'attività di rete nelle sezioni³². Portate più basse (ad esempio, 2-3 mL∙^min-1) possono essere utilizzate per mantenere la stabilità della fetta per esperimenti di imaging o dove non è richiesta un'attività di rete biologicamente rilevante.
5. Valuta la qualità delle fette utilizzando ottiche a contrasto di inferenza differenziale a infrarossi (IR-DIC) con ingrandimento dell'obiettivo 40x (visualizzato con una telecamera CCD). Si presume una buona qualità della fetta se si può vedere un gran numero di PC CA1 di forma ovoidale, moderatamente contrastati nella piramide str. a profondità di 20-30 μm al di sotto di una superficie liscia e leggermente increspata (Figura 2A). Le sezioni di scarsa qualità contengono un gran numero di cellule altamente contrastate, rimpicciolite o gonfie, con una superficie irregolare.
6. Riempire le pipette per cerotti con una soluzione intracellulare (ad es. basata su un [Cl^-] intracellulare di 24 mM) per consentire il confronto con altri dati pubblicati.
7. Eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere come descritto in precedenza²². Escludere le cellule dall'analisi se il potenziale di membrana (V_M) al breakthrough è più depolarizzato di -50 mV, la resistenza in serie è >30 MΩ; oppure la resistenza in serie cambia del >20% nel corso della registrazione. In queste condizioni di registrazione, la resistenza in serie è tipicamente compresa tra 8 e 25 MΩ ed è stabile fino a 1 ora.
8. Per esaminare l'eccitabilità intrinseca del CA1 dall'ippocampo dorsale, testare le proprietà fisiologiche intrinseche con registrazioni di cellule intere con i seguenti protocolli in configurazione current-clamp:
   1. Dal potenziale di membrana a riposo senza corrente di polarizzazione applicata, applicare piccoli passi di corrente (-10 pA, 500 ms) ripetuti 30 volte.
   2. Da -70 mV con corrente di polarizzazione applicata, applicare passi di corrente da iper a depolarizzanti della durata di 500 ms (da -100 a +400 pA, passi di 25 pa) con 3 ripetizioni di una famiglia di tracce.
   3. Applicare un'onda sinusoidale di 100 pA di ampiezza picco-picco, con frequenza variabile da 0,1 a 20 Hz. Ripetere 3 volte.
   4. Applicare stimoli 5x 2 nA, 2 ms per guidare i potenziali d'azione a 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 sweep per frequenza.
   5. Da un voltage-clamp a -70 mV, applicare 5 minuti di correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee (EPSC) per la registrazione.
9. Per richiudere le cellule per l'analisi istologica dopo la registrazione riuscita, produrre cerotti outside-out ritraendo lentamente la pipetta del cerotto. Quando si osserva un aumento della resistenza in serie dai livelli sperimentali a >1 GΩ misurato da un impulso di prova a -5 mV, aumentare il potenziale di mantenimento a -40 mV e ritrarre completamente la pipetta.
10. Eseguire registrazioni aggiuntive nella stessa fetta per soddisfare la potenza statistica richiesta dal disegno sperimentale.
11. Rimuovere le fette di cervello contenenti i neuroni registrati dalla camera di registrazione, posizionarle in una piastra a 24 pozzetti, sostituire l'ACSF con paraformaldeide al 4% (in tampone fosfato 0,1 M) e lasciare riposare per una notte.
12. Il giorno successivo, sostituire il PFA con un tampone fosfato 0,1 M e conservare fino al trattamento istologico. Visualizzare le cellule con streptavidina coniugata fluorescente come descritto in precedenza²².

Il protocollo sopra descritto consente la preparazione di fette vitali dal polo settale dell'ippocampo dorsale nei ratti maturi. Un fattore chiave in questo protocollo è la perfusione di saccarosio-ACSF refrigerato, prima della preparazione della fetta, che si traduce in PC CA1 sani prossimali alla superficie della fetta. La qualità della fetta prodotta viene valutata visivamente in ottica IR-DIC e le cellule sane identificate come dotate di grandi corpi cellulari di forma ovoidale si trovano in tutta l'estensione dello strato piramidale, dallo strato compatto, allo strato oriens (Figura 2A, freccia nera). Le fette malsane sono identificate come aventi cellule morte sulla superficie e raramente nelle profondità della fetta (Figura 2A, freccia rossa), che vengono identificate sulla base dell'avere somata condensati e altamente contrastati, o grandi somata "a palloncino" con nuclei condensati.

La conferma della salute della fetta si ottiene eseguendo registrazioni di patch clamp su intere cellule da presunti neuroni sani. Le registrazioni patch-clamp su cellule intere si ottengono con la formazione rapida e spontanea di sigilli gigaohm (15,5 ± 2,9 s; Figura 2B), paragonabile a quelli precedentemente riportati³¹. Quando la membrana è rotta, i neuroni sani nei ratti maturi possiedono potenziali di membrana a riposo iperpolarizzati (media: -65,6 ± 1,5 mV, intervallo: da -55,6 a -73,9 mV; 15 PC da 4 ratti) e resistenze di ingresso relativamente basse (media: 90,3 ± 5,2 MΩ, intervallo: da 54,9 a 134,2 MΩ; 19 PC da 4 ratti). La qualità generale delle fette è confermata da EPSC spontanee ad alta fedeltà (Figura 2C,2D), dato il basso rumore elettrico (<10 pA picco-picco) quando filtrate a 10 kHz. Inoltre, le registrazioni cellulari stabili di neuroni iperpolarizzati richiedono tipicamente una corrente di mantenimento di <200 pA, che è stabile per lunghi periodi, a causa dell'assenza di attività di rete nelle condizioni di registrazione sommersa di questa preparazione a fette.

Le registrazioni del patch clamp a cellula intera dai PC CA1 dorsali consentono la misurazione diretta delle proprietà di scarica del potenziale d'azione. A condizione che la qualità della sezione sia sufficientemente elevata, è possibile registrare molte cellule da una singola sezione in un breve lasso di tempo (~1 ora). Un fattore determinante della vitalità cellulare è la presenza di un albero dendritico intatto e la sopravvivenza dell'assone oltre il segmento iniziale. L'angolo di taglio di 10° rispetto alla verticale consente la conservazione di questa anatomia cellulare, con le cellule conservate all'interno del piano di taglio (Figura 3A). I PC CA1 sani di ratti adulti hanno tipicamente un potenziale di membrana iperpolarizzato da -60 mV a -70 mV, resistenze di ingresso di 100-200 MΩ e costanti di tempo di membrana di 20-40 ms quando misurati al soma (Figura 3B). Un requisito chiave per l'inclusione dei neuroni nei set di dati è la presenza di potenziali d'azione in risposta a stimoli depolarizzanti. I PC CA1 nei ratti adulti presentano un numero crescente di potenziali d'azione agli stimoli depolarizzanti, dalla corrente di reobase alle correnti massime testate (400 pA), alle quali treni di potenziali d'azione mostrano sia l'adattamento dei tempi inter-spike che l'accomodazione dell'ampiezza del potenziale d'azione (Figura 3C). L'uso di un'onda sinusoidale a frequenza variabile (0,1 -20 Hz su 20 s) consente la caratterizzazione della risonanza di membrana dei neuroni registrati (Figura 3D). Infine, i treni temporalmente controllati di scarica del potenziale d'azione su una gamma di frequenze consentono di confrontare l'accomodazione e il reclutamento dei canali K⁺ associati all'iperpolarizzazione risultante (Figura 3E). Dopo la conferma post-hoc di dendriti intatti utilizzando la visualizzazione con streptavidina della marcatura della biocitina eseguita durante le registrazioni, la frequenza EPSC spontanea misurata dalla registrazione continua (Figura 2B, in alto) consente la caratterizzazione dell'integrazione del PC CA1 nella rete locale.

In sintesi, l'ottimizzazione della qualità della fetta dell'estensione dorsale dell'ippocampo consente registrazioni di cellule intere da più neuroni per fetta. Questa preparazione di fette facilita la raccolta di grandi set di dati di eccitabilità intrinseca, la definizione di misure di variabilità intra-animale e la produzione di fette di qualità sufficiente per eseguire registrazioni accoppiate da neuroni accoppiati sinapticamente.

Figura 1: Panoramica dell'impostazione sperimentale e dello schema di dissezione. (A) Strumenti sperimentali per tutti gli aspetti della preparazione delle fette, etichettati in base all'uso. (B) Cartone animato raffigurante le direzioni dei tagli con cesoie per ossa e il movimento della spatola (frecce rosa) per rimuovere il cervello dal cranio. (C) Panoramica dell'angolo di taglio (linea rossa tratteggiata) per consentire la conservazione del CA1 dorsale. (D) Panoramica della camera di affettamento con il cervello montato, l'aspetto anteriore rivolto verso l'alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Identificazione di neuroni sani dalla regione CA1 dell'ippocampo dorsale. (A) Micrografia dell'area CA1 da una fetta di ippocampo dorsale acuta, prodotta da una fetta di cervello vicino alla corona. La pipetta del cerotto è mostrata in una configurazione a cellula intera da un neurone sano nella fetta (indicata con una freccia nera). Viene indicato un neurone vicino ad alto contrasto da evitare per la registrazione (freccia rossa). (B) Registrazioni continue rappresentative di EPSC spontanee eseguite a voltage-clamp di -70 mV da una registrazione stabile di un PC CA1 sano (nero), con EPSC spontanee identificate (cerchi verdi) e di una cellula instabile/malsana registrata nelle stesse condizioni (rosso). Viene indicata la corrente di mantenimento necessaria per mantenere una pinza di tensione di -70 mV. (C) Vista espansa dalla regione della traccia in (B) indicata con un riquadro ombreggiato. Notare l'EPSC presente nella parte superiore, la traccia stabile (nero) e la traccia instabile e rumorosa (rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Identificazione cellulare ed elettrofisiologia intrinseca, misurata mediante registrazione di patch-clamp a cellula intera da PC CA1 dell'ippocampo dorsale. (A) Visualizzazione della biocitina con marcatura della streptavidina coniugata fluorescente, seguita da imaging confocale, da una fetta contenente più (6) PC CA1 registrati in sequenza, confermando l'identità cellulare dei neuroni registrati. (B) Risposta media a un piccolo passo iperpolarizzante di -10 pA, 500 ms per accertare le proprietà passive della membrana. (C) Risposta in tensione di un PC CA1 identificato a passi di corrente da iperpolarizzanti a depolarizzanti (da -100 a +400 pA, durata 500 ms). La scarica del potenziale d'azione è mostrata sia alla corrente di reobase (spazzata grigia) che alla scarica massima a 400 pA. (D) Risposta della membrana a un'onda sinusoidale di 100 pA, modulata in frequenza da 0,1 a 20 Hz. Si noti la maggiore risposta di tensione alle velocità di ciclo più basse. (E) Treni di potenziali d'azione generati in risposta a treni di 5 stimoli (2 nA, durata 2 ms) in un intervallo di frequenze (indicato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco delle soluzioni utilizzate nella preparazione e nella registrazione di fette di cervello. Le soluzioni sono elencate con i loro componenti riportati come concentrazione mM. Sono elencate le note specifiche prima dell'uso.

Qui, viene descritto un protocollo per produrre fette di cervello di alta qualità dall'estensione dorsale del CA1 dell'ippocampo, consentendo registrazioni da più neuroni vitali all'interno di questa regione. L'approccio combinatorio della registrazione di intere cellule da fette quasi coronali seguita dalla visualizzazione neuronale è fondamentale per la conferma della vitalità e dell'identità cellulare.

Questo protocollo produce in modo affidabile sezioni valide per 2 motivi principali. In primo luogo, la modifica dell'angolo di taglio, come deviazione dal vero coronale, consente una maggiore conservazione dell'asse somatodendritico e quindi una funzione biologicamente rilevante dei neuroni. Dato che l'orientamento dell'asse somatodendritico dei PC CA1 nella massima estensione dorsale dell'ippocampo non è in piano con una vera sezione coronale¹, questa modifica consente una maggiore conservazione dei tessuti. In alternativa, è possibile rimuovere completamente l'ippocampo e utilizzare un tritatessuto per preparare fette di cervello, come precedentemente descritto per le fette acute ^4,33 e per la coltura di fette^34,35. Uno svantaggio di questo approccio è il potenziale danno all'ippocampo durante la sua estrazione e taglio (in mani inesperte), che viene evitato mantenendo intatto il cervello. Questo approccio assomiglia più da vicino a quello di studi precedenti che mantengono i neuroni dell'ippocampo sul piano trasverso, rispetto all'asse settale/temporale ^21,22. Il secondo fattore importante che contribuisce alla vitalità dei neuroni nei ratti maturi è l'uso della perfusione saccarosio-ACSF ghiacciata immediatamente prima della decapitazione, della dissezione e della preparazione della fetta. Dato che il cranio di ratto di età superiore ai 3 mesi è tipicamente spesso e molto più difficile da tagliare con i tradizionali strumenti di preparazione delle fette di cervello (ad esempio, forbici sottili, bisturi e pinze), la durata della dissezione con Rongeur e tagliaossa è per sua stessa natura più lunga, quindi il pre-raffreddamento del cervello offre al ricercatore più tempo per la dissezione e l'affettatura. La velocità con cui il cervello può essere raffreddato e affettato è stata a lungo considerata vantaggiosa per affettare la qualità³⁶, specialmente quando l'ACSF ghiacciato viene perfuso prima che il sistema cardiovascolare sia stato isolato dal cervello 30,31,37,38. Tuttavia, è stato recentemente suggerito che temperature più fisiologiche possono anche essere utili per studiare alcune regioni del cervello³⁹.

La qualità della fetta prodotta dalla combinazione di perfusione saccarosio-ACSF ghiacciata e l'angolo di taglio vicino alla corona modificato fornisce una qualità della fetta quasi paragonabile a quella delle fette orizzontali preparate nella stessa fase di sviluppo. Infatti, l'ottimizzazione di questa tecnica, utilizzando una composizione saccarosio-ACSF con una composizione ionica simile a quella utilizzata per la registrazione, consente una grande coerenza tra le condizioni utilizzate nell'esperimento e gli approcci di preparazione delle fette utilizzati per i ratti neonatali. Uno dei principali svantaggi dell'uso delle condizioni di archiviazione e registrazione delle fette sommerse, come descritto qui, è che l'attività delle reti neuronali nelle fette cerebrali è significativamente ridotta rispetto all'impostazione in vivo. Questo problema viene superato trasferendo alternativamente le fette tagliate in una camera di interfaccia che scorre con ACSF di registrazione a 35 °C per la conservazione. Questo approccio migliora significativamente l'attività del circuito locale, consentendo la misurazione delle oscillazioni neuronali e l'attivazione neuronale funzionalmente rilevante^40,41. Altri metodi di produzione di fette da roditori più anziani, come l'uso del recupero NMDG, possono produrre fette^30,31 di altissima qualità, adatte per le stesse registrazioni descritte. Il vantaggio specifico di questo approccio è che consente un confronto diretto tra le registrazioni eseguite nei roditori più giovani, sulla base delle preparazioni di fette descritte in precedenza^21,22 a causa dell'identica base ionica delle soluzioni e delle condizioni di recupero della fetta. Una combinazione di questo approccio con il recupero basato su NMDG potrebbe anche produrre fette di alta qualità.

Nel complesso, il protocollo di preparazione e registrazione della fetta di cervello qui descritto consente un confronto diretto della fisiologia e dell'anatomia neuronale in modo ad alto rendimento, con altre modalità sperimentali eseguite nell'ippocampo dorsale, come eseguite in altre aree cerebrali, come la neocorteccia. Infatti, c'è un numero crescente di studi che affrontano le differenze neurofisiologiche tra l'ippocampo dorsale e quello ventrale 27,28,38,42,43. Tuttavia, pochi studi eseguono registrazioni a un'età paragonabile a quella utilizzata per studi comportamentali, anatomici o elettrofisiologici in vivo. Pertanto, la combinazione di procedure di affettamento migliorate e una scelta appropriata dell'età dei roditori consentirà una correlazione più realistica della fisiologia neuronale con la funzione cerebrale. I protocolli di cui sopra sono stati eseguiti su ratti fino a 1 anno di età, ma non c'è motivo di credere che ciò non possa essere eseguito su ratti più anziani con le autorizzazioni appropriate.

In sintesi, il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile per produrre fette di cervello da ratti adulti, consentendo così il confronto delle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni con esperimenti in vivo e anatomici.

L'autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'autore desidera ringraziare il Prof. David JA Wyllie, la Dr. Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira e il Prof. Peter C Kind per gli utili commenti sull'ottimizzazione del manoscritto e del protocollo, e The Simons Initiative for the Developing Brain per aver fornito i costi di pubblicazione.