Préparation de coupes cérébrales aiguës du pôle dorsal de l’hippocampe chez des rongeurs adultes

Le but de ce protocole est de décrire une méthode permettant de produire des tranches de l’hippocampe dorsal pour un examen électrophysiologique. Cette procédure utilise la perfusion avec de l’ACSF réfrigéré avant la préparation de la tranche avec un angle de tranchage proche de la coronale qui permet de préserver les neurones principaux sains.

Les enregistrements de cellules entières à partir de tranches de cerveau de rongeurs aigus sont un pilier de la recherche neurophysiologique moderne, permettant une mesure précise des propriétés cellulaires et synaptiques. Néanmoins, il est de plus en plus nécessaire d’effectuer des analyses corrélées entre différents modes expérimentaux en plus de l’électrophysiologie en tranches, par exemple : immunohistochimie, biologie moléculaire, imagerie in vivo ou enregistrement électrophysiologique ; pour répondre à des questions de plus en plus complexes sur le fonctionnement du cerveau. Cependant, il n’est pas simple de tirer des conclusions significatives de ces diverses approches expérimentales, car même au sein de structures cérébrales relativement bien décrites, il existe un degré élevé de variation sous-régionale de la fonction cellulaire. Cela n’est nulle part mieux illustré que dans le CA1 de l’hippocampe, qui a des propriétés dorso-ventrales bien définies, basées sur des propriétés cellulaires et moléculaires. Néanmoins, de nombreuses études publiées examinent les modèles d’expression des protéines ou l’activité in vivo corrélée au comportement dans l’étendue dorsale de l’hippocampe ; et expliquer les résultats de manière mécanique avec l’électrophysiologie cellulaire de la région ventro-médiale. Ceci est encore plus compliqué par le fait que de nombreuses expériences électrophysiologiques en tranches aiguës sont effectuées sur des animaux juvéniles, alors que d’autres modes expérimentaux sont réalisés sur des animaux plus matures. Pour résoudre ces problèmes, cette méthode intègre la perfusion transcardique de rongeurs matures (rongeurs matures âgés de >60 jours) avec du liquide céphalo-rachidien artificiel, suivie de la préparation de coupes coronales modifiées, y compris le pôle septal de l’hippocampe dorsal pour enregistrer à partir de cellules pyramidales CA1. Ce processus conduit à la génération de tranches aiguës saines de l’hippocampe dorsal, permettant une interrogation électrophysiologique cellulaire basée sur des tranches et associée à d’autres mesures.

L’hippocampe est sans doute la structure la mieux étudiée du cerveau des mammifères, en raison de sa taille relativement grande et de sa structure laminaire proéminente. L’hippocampe a été impliqué dans un certain nombre de processus comportementaux : navigation spatiale, mémoire contextuelle et formation d’épisodes. Cela est dû en partie à la facilité relative d’accès aux parties dorsales de l’hippocampe chez les rongeurs pour l’analyse in vivo . En effet, les principales cellules de sortie sont généralement à moins de 2 mm de la surface piale.

Chez les rongeurs, l’hippocampe est une structure relativement grande, formée d’une invagination du télencéphale s’étendant de la cloison dorsale au néocortex ventral. Il est composé de 2 grandes régions : le gyrus denté et le cornu ammonis (CA) ; ce dernier est divisé en 3 sous-régions bien décrites (CA1-3) qui s’étendent dans le gyrus hilus denté (anciennement connu sous le nom de CA4), sur la base de la connectivité, de l’anatomie cellulaire et des propriétés génétiques¹. Cette structure est maintenue le long de l’étendue dorso-ventrale de l’hippocampe, bien qu’avec des variations majeures dans les propriétés synaptiques ^2,3,4, l’anatomie⁵, la diversité génétique ^6,7,8 et la fonction comportementale ^9,10. Parmi les régions CA, le sous-domaine CA1 est composé en grande partie de cellules pyramidales glutamatergiques CA1 (PC CA1), pour lesquelles 3 sous-types ont été définis¹¹, et d’interneurones inhibiteurs qui représentent ~10 % des neurones, mais sont très diversifiés avec plus de 30 sous-types définis 12,13,14. En plus des différences spécifiques régionales, il a été démontré que le vieillissement normal a des effets spectaculaires sur la transmission synaptique ^15,16,17, l’anatomie¹⁸ et le profil génétique¹⁹. La méthode de référence actuelle pour évaluer les subtilités des propriétés cellulaires et synaptiques de manière contrôlée consiste à utiliser des enregistrements patch-clamp de cellules entières à partir de tranches cérébrales aiguës²⁰.

La compréhension de la fonction hippocampique repose en grande partie sur la manipulation dorsale en raison de la facilité avec laquelle elle est accessible chirurgicalement ou anatomiquement pour des tâches comportementales, l’implantation d’électrodes ou de fenêtres d’imagerie, ou l’expression de plasmides viraux. De plus, dans de nombreuses études, ces procédures sont effectuées avec des rongeurs juvéniles ou adultes tardifs pour prévenir la variabilité de la structure du cerveau au cours du développement. Malgré cela, de nombreuses approches pour examiner l’électrophysiologie cellulaire et subcellulaire sont effectuées chez les rongeurs juvéniles précoces à moyens, principalement à partir de la partie ventro-médiale de l’hippocampe dans son plan transversal 21,22,23,24,25. Lorsque toute l’étendue dorso-ventrale a été évaluée, un hachoir à tissus est utilisé pour maintenir l’étendue transversale ^4,26, ou l’expérience a été réalisée chez de jeunes rats²⁷ ou souris²⁸. De plus, le refroidissement des tissus avant la dissection du cerveau est connu pour préserver la structure de l’hippocampe chez le rat²⁹ et les neurones néocorticaux chez la souris^30,31. Néanmoins, il y a peu de détails concernant la production de coupes de cerveau à partir de l’axe transversal dorsal de l’hippocampe, telles que générées par des tranches coronales modifiées, chez les rats matures.

Ce protocole décrit une approche par laquelle des enregistrements de cellules entières peuvent être obtenus à partir d’un seul ou de paires de neurones dans des tranches coronales modifiées de l’hippocampe dorsal de rats âgés, suivis d’une identification morphologique post-hoc. Des coupes de cerveau sain sont obtenues après perfusion transcardique de liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré (ACSF), facilitant la mesure des propriétés électrophysiologiques à partir de PC CA1 et d’interneurones locaux.

Tous les animaux ont été générés et entretenus conformément aux directives du Home Office and Institutional (HO# P135148E). Tous les rats ont été maintenus sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Perfusion transcardique d’ACSF réfrigéré

1. Avant toutes les expériences, placer ~200 mL de saccharose-ACSF (tableau 1) dans le congélateur à -20 °C (jusqu’à ce qu’il soit semi-congelé, pour le tranchage) et ~100-200 mL supplémentaires de saccharose-ACSF filtré sur de la glace (pour la perfusion), en bouillonnant avec du carbogène (95 % O₂/5 % CO₂).
2. Prélevez un rat adulte de sa cage d’origine et placez-le pendant ~30 minutes dans une cage de détention dans la salle d’intervention pour l’acclimater aux niveaux de bruit et de lumière.
3. Préparez les outils de dissection (figure 1A), la zone de perfusion et l’anesthésique injectable (environ 1 mL de pentobarbital sodique à 200 mg/mL pour une concentration finale de 100 mg/kg).
4. Préparez une chambre d’anesthésie appropriée en plaçant à l’intérieur un petit coton-tige de papier de soie ou de coton. Introduire 1 à 2 mL d’anesthésique isoflurane volatil dans le matériau absorbant de la chambre.
5. Placez le rat dans une chambre d’anesthésie pour le mettre sous sédatif. Surveillez la respiration jusqu’à ce que la fréquence respiratoire tombe à ~1 respiration superficielle par seconde.
6. À ce stade, commencez à faire bouillonner du saccharose-ACSF semi-congelé avec du carbogène sur de la glace pour l’utiliser lors du tranchage.
7. Pesez le rat et notez son poids.
8. Anesthésier le rat en phase terminale en injectant le pentobarbital sodique préparé dans la cavité intrapéritonéale. La dose de pentobarbital sodique doit être de 100 mg/kg, calculée à partir du poids précédemment pris et de la concentration d’origine du médicament. Placez le rat dans une chambre de rétention et attendez 0,5 à 5 minutes pour le début de l’anesthésie terminale.
9. Confirmez l’arrêt des réflexes : testez à la fois le clignement cornéen (toucher la pupille) et le pincement de la patte arrière (lever la patte et pincer la patte arrière) à l’aide d’une sonde émoussée (c’est-à-dire une pince arrondie). Une fois que les réflexes ont cessé, épinglez le rat à la planche chirurgicale en polystyrène ou en liège à l’aide d’aiguilles hypodermiques.
10. Ouvrez la cavité thoracique et placez la canule à la base du ventricule gauche du cœur. Percer l’oreillette droite et commencer immédiatement la perfusion avec le saccharose-ACSF glacé (0-1 °C) (à l’aide d’une pompe péristaltique à 50 mL/minute).
11. Une fois que l’échange complet de fluides et le refroidissement du corps ont eu lieu (<5 minutes), retirez la canule et les épingles, puis décapitez à l’aide d’une guillotine.
12. Retirez soigneusement et rapidement le crâne à l’aide de ciseaux à os et d’outils en os Rongeur (Figure 1A, 1B).
    1. Commencez par faire 2 incisions bilatérales à travers le foramen magnum à l’aide des ciseaux à os et retirez le crâne jusqu’à la suture lambda avec les Rongeurs. Coupez soigneusement le long de la suture médiane avec les ciseaux à os jusqu’à juste derrière les yeux.
    2. Faites 2 coupes bilatérales à travers le crâne, perpendiculairement à la ligne médiane. À l’aide des Rongeurs, ouvrez le crâne le long de la ligne médiane. Prenez des précautions supplémentaires pour enlever la pie-mère à l’aide de ciseaux fins ou d’une aiguille crochue.
13. Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une spatule émoussée, en sectionnant les nerfs crânien et optique avec une compression latérale à côté. Placez le cerveau dans du saccharose-ACSF carbogéné, semi-congelé (0 à 1 °C) pendant 1 à 2 minutes avant de le trancher.

2. Préparation de tranches de cerveau de l’hippocampe dorsal

1. Retirez le cerveau perfusé du saccharose-ACSF semi-congelé (0-1 °C) et placez-le dans une boîte de Pétri en verre recouverte de papier filtre. Placez le cerveau sur sa surface ventrale.
2. À l’aide d’un scalpel (lame n° 22), retirez la partie postérieure du cerveau à ~10° de la verticale pour créer une surface plane pour coller le cerveau à la scène (Figure 1C).
3. Appliquez une petite quantité de colle cyanoacrylate sur l’étage du vibratome. Étalez la colle pour former une fine pellicule d’environ 50 % plus grande que la section transversale de la surface coupée du cerveau.
4. Soulevez le cerveau hors du plat en verre sur une spatule, côté coupé vers le bas, à l’aide d’un pinceau pour guider le tissu. Épongez le cerveau avec un morceau de tissu pour enlever l’excès d’ACSF et faites glisser le cerveau, surface coupée vers le bas, au centre de la colle. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez 1 à 2 ml de saccharose-ACSF glacé sur le cerveau pour enlever la colle loin du bloc cérébral.
5. Placez le cerveau dans la chambre de tranchage et inondez-le de saccharose semi-congelé ACSF. À l’aide d’une cuillère ou d’une spatule, éloignez l’excès de glace du bloc cérébral, puis du carbogénate (figure 1D).
6. Déplacez la lame du vibratome en position : ~1 mm de la surface dorsale du cerveau et verticalement ~1 mm en avant du bregma. Assurez-vous que la lame est complètement immergée et éliminez les bulles à l’aide d’un pinceau.
7. Commencez à trancher le cerveau. Pour réduire jusqu’à l’hippocampe dorsal, utilisez une vitesse de 0,1 à 0,2 mm/s, avec un mouvement horizontal de la lame de 1 à 1,5 mm et une fréquence d’oscillation réciproque de ~90 Hz. Lorsque vous coupez l’hippocampe dorsal, réduisez la vitesse à 0,05-0,1 mm/s.
8. Prélever des tranches d’hippocampe dorsal (nominalement 3-4 tranches complètes ou 6-8 tranches hémiquées) par cerveau. Si des tranches longitudinales de l’hippocampe ventro-médial sont nécessaires, continuez le tranchage. Une fois que l’hippocampe dorsal a été tranché, il n’est pas nécessaire de couper du tissu supplémentaire au-delà de la position approximative du 3e ventricule. Arrêtez le vibratome, séparez la tranche à l’aide d’une aiguille hypodermique pliée et recueillez-la à la base de la chambre de tranchage.
   REMARQUE : Les tranches peuvent avoir une épaisseur de 250 à 500 μm, selon les exigences expérimentales. Pour les enregistrements de l’hippocampe dorsal, utilisez généralement des coupes de 400 μm d’épaisseur pour préserver autant que possible le réseau local, tout en permettant les conditions de microscopie appropriées.
9. Coupez les tranches pour qu’elles ne contiennent que l’hippocampe et le cortex sus-jacent à l’aide d’un microscope à dissection. Transférez les tranches dans la chambre préchauffée à 35 °C, la surface antérieure vers le haut.
10. Déterminez la chambre de stockage en fonction de l’expérience à réaliser. Pour obtenir des enregistrements de terrain extracellulaires ou par patch-clamp de cellules entières de haute qualité près de la surface de la tranche dans les chambres d’enregistrement immergées, stockez-les dans des chambres immergées. Vous pouvez également stocker dans une chambre d’interface liquide/gaz pour les enregistrements de l’activité du réseau oscillatoire ou des enregistrements de champ extracellulaire d’interface.
11. Pour les conditions de stockage immergées, laissez les tranches récupérer à 35 ºC pendant 30 minutes à partir du moment où la dernière tranche entre dans la chambre de stockage. Cela permet de réactiver les processus métaboliques et de refermer les neurites coupées. Après 30 minutes, transférez la chambre de stockage à température ambiante.

3. Enregistrement des neurones dorsaux de l’hippocampe

1. Fabriquer des pipettes d’enregistrement en verre capillaire. Ce protocole utilise du verre borosilicaté de 1,5 mm de diamètre extérieur et de 0,86 mm de diamètre intérieur avec filament, ce qui donne une résistance de pointe de 3 à 5 MΩ lorsqu’il est rempli d’une solution intracellulaire (Tableau 1). Conserver les solutions intracellulaires réfrigérées sur de la glace pour éviter la dégradation des composants énergétiques et filtrées avant utilisation (filtre à seringue, taille des pores : 0,2 μm).
2. Enregistrement au carbbogénate ACSF et préchauffage au bain-marie (35-40 ºC). Administrer l’ACSF carbogéné et préchauffé à la chambre d’enregistrement via une tubulure de perfusion assistée d’une pompe péristaltique. Commencez la perfusion plusieurs minutes avant de transférer une tranche dans la chambre.
3. Arrêtez la perfusion et transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement avec la surface antérieure vers le haut. Maintenez la tranche en place avec un anneau en platine avec des fibres simples de soie attachées pour former une forme de « harpe ». Positionnez les tranches de manière à ce que la couche pyramidale de CA1 soit perpendiculaire à l’axe de la première pipette d’enregistrement.
4. Redémarrer le flux d’ACSF carbogéné et préchauffé (35-40 ºC) en enregistrant (Tableau 1) à un débit optimal de 6-8 mL∙^min-1.
   REMARQUE : Des débits élevés (6-8 mL∙^min-1) sont optimaux pour maintenir l’activité du réseau en tranches³². Des débits plus faibles (c’est-à-dire 2-3 mL∙^min-1) peuvent être utilisés pour maintenir la stabilité de la tranche pour les expériences d’imagerie ou lorsque l’activité du réseau biologiquement pertinente n’est pas requise.
5. Évaluez la qualité de la coupe à l’aide d’une optique infrarouge à contraste d’inférence différentielle (IR-DIC) avec un grossissement d’objectif de 40x (visualisée avec une caméra CCD). On suppose que la coupe est de bonne qualité si un grand nombre de CA1 PC de forme ovoïde et modérément contrastés peuvent être observés dans la pyramidale à des profondeurs de 20 à 30 μm sous une surface lisse et légèrement alvéolée (figure 2A). Les tranches de mauvaise qualité contiennent un grand nombre de cellules très contrastées, rétrécies ou gonflées, avec une surface de coupe inégale.
6. Remplir les pipettes patch avec une solution intracellulaire (p. ex., basée sur un [Cl^-] intracellulaire de 24 mM) pour permettre la comparaison avec d’autres données publiées.
7. Effectuez des enregistrements patch-clamp de cellules entières comme décrit précédemment²². Exclure les cellules de l’analyse si le potentiel de membrane (V_M) à la rupture est plus dépolarisé que -50 mV, la résistance série est de >30 MΩ ; ou la résistance en série change de >20 % au cours de l’enregistrement. Dans ces conditions d’enregistrement, la résistance série est généralement comprise entre 8 et 25 MΩ et stable jusqu’à 1 heure.
8. Pour examiner l’excitabilité intrinsèque de CA1 de l’hippocampe dorsal, testez les propriétés physiologiques intrinsèques avec des enregistrements de cellules entières avec les protocoles suivants en configuration de pince de courant :
   1. À partir du potentiel de membrane au repos sans courant de polarisation appliqué, appliquez de petits pas de courant (-10 pA, 500 ms) répétés 30 fois.
   2. À partir de -70 mV avec courant de polarisation appliqué, appliquez des paliers de courant hyper à dépolarisant d’une durée de 500 ms (-100 à +400 pA, pas de 25 pA) avec 3 répétitions d’une famille de traces.
   3. Appliquez une onde sinusoïdale d’amplitude crête à crête de 100 pA, avec une fréquence variable de 0,1 à 20 Hz. Répétez l’opération 3 fois.
   4. Appliquez 5 stimuli de 2 nA, 2 ms pour piloter des potentiels d’action à 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 balayages par fréquence.
   5. À partir d’une pince de tension de -70 mV, appliquez 5 minutes de courants postsynaptiques excitateurs spontanés (EPSC) pour l’enregistrement.
9. Pour refermer les cellules pour l’analyse histologique après un enregistrement réussi, produisez des patchs vers l’extérieur en rétractant lentement la pipette patch. Lorsqu’une augmentation de la résistance en série est observée à partir des niveaux expérimentaux à >1 GΩ mesurée par une impulsion d’essai de -5 mV, augmentez le potentiel de maintien à -40 mV et rétractez complètement la pipette.
10. Effectuez des enregistrements supplémentaires dans la même tranche pour satisfaire la puissance statistique requise du plan d’expérience.
11. Retirez de la chambre d’enregistrement les tranches de cerveau contenant des neurones enregistrés, placez-les dans une plaque à 24 puits, remplacez l’ACSF par du paraformaldéhyde à 4 % (dans un tampon de phosphate à 0,1 M) et laissez reposer toute la nuit.
12. Le lendemain, remplacer le PFA par un tampon phosphate de 0,1 M et le stocker jusqu’au traitement histologique. Visualisez des cellules avec de la streptavidine conjuguée par fluorescence comme décrit précédemment²².

Le protocole décrit ci-dessus permet de préparer des tranches viables à partir du pôle septal de l’hippocampe dorsal chez les rats matures. Un facteur clé de ce protocole est la perfusion de saccharose-ACSF réfrigéré, avant la préparation de la tranche, ce qui permet d’obtenir des PC CA1 sains à proximité de la surface de la tranche. La qualité de la tranche produite est évaluée visuellement sous optique IR-DIC, et les cellules saines identifiées comme ayant de grands corps cellulaires de forme ovoïde sont situées dans toute l’étendue de la strate pyramidale, de la couche compacte à la stratum oriens (Figure 2A, flèche noire). Les coupes malsaines sont identifiées comme ayant des cellules mortes à la surface et rarement dans les profondeurs de la tranche (Figure 2A, flèche rouge), qui sont identifiées sur la base de somates condensés et très contrastés, ou de grands somates « ballonnés » avec des noyaux condensés.

La confirmation de la santé de la tranche est obtenue en effectuant des enregistrements de patch-clamp de cellules entières à partir de neurones sains présumés. Des enregistrements patch-clamp à cellules entières sont réalisés avec une formation rapide et spontanée de joints gigaohm (15,5 ± 2,9 s ; figure 2B), comparables à celles précédemment signalées³¹. Lorsque la membrane est rompue, les neurones sains chez les rats matures possèdent des potentiels de membrane de repos hyperpolarisés (moyenne : -65,6 ± 1,5 mV, plage : -55,6 à -73,9 mV ; 15 PC de 4 rats) et des résistances d’entrée relativement faibles (moyenne : 90,3 ± 5,2 MΩ, plage : 54,9 à 134,2 MΩ ; 19 PC de 4 rats). La qualité générale des coupes est confirmée par des EPSC spontanés haute fidélité (Figure 2C, 2D), compte tenu d’un faible bruit électrique (<10 pA crête à crête) lorsqu’ils sont filtrés à 10 kHz. De plus, les enregistrements cellulaires stables de neurones hyperpolarisés nécessitent généralement un courant de maintien de <200 pA, qui est stable sur de longues périodes, en raison de l’absence d’activité du réseau dans les conditions d’enregistrement immergées de cette préparation de tranche.

Les enregistrements de patch-clamps à cellules entières à partir de PC CA1 dorsaux permettent de mesurer directement les propriétés de décharge du potentiel d’action. À condition que la qualité de la tranche soit suffisamment élevée, de nombreuses cellules peuvent être enregistrées à partir d’une seule tranche dans un court laps de temps (~1 heure). Un déterminant clé de la viabilité cellulaire est la présence d’un arbre dendritique intact et la survie de l’axone au-delà du segment initial. L’angle de tranchage de 10° par rapport à la verticale permet de préserver cette anatomie cellulaire, les cellules étant préservées dans le plan de tranchage (Figure 3A). Les PC CA1 sains de rats adultes ont généralement un potentiel de membrane hyperpolarisé de -60 mV à -70 mV, des résistances d’entrée de 100 à 200 MΩ et des constantes de temps membranaires de 20 à 40 ms lorsqu’elles sont mesurées au soma (figure 3B). Une condition clé pour l’inclusion des neurones dans les ensembles de données est la présence de potentiels d’action en réponse à des stimuli dépolarisants. Les PC CA1 chez le rat adulte présentent un nombre croissant de potentiels d’action aux stimuli dépolarisants, du courant de rhéobase aux courants maximaux testés (400 pA), auxquels les courants de potentiels d’action présentent à la fois l’adaptation des temps entre les pointes et l’accommodation de l’amplitude du potentiel d’action (Figure 3C). L’utilisation d’une onde sinusoïdale à fréquence variable (0,1 -20 Hz sur 20 s) permet de caractériser la résonance membranaire des neurones enregistrés (Figure 3D). Enfin, des trains d’action contrôlés dans le temps décharge potentielle sur une gamme de fréquences permettent de comparer l’accommodation et le recrutement des canaux K⁺ associés à l’hyperpolarisation résultante (Figure 3E). Suite à la confirmation post-hoc des dendrites intactes à l’aide de la visualisation de la streptaviridine du marquage de la biocytine effectuée pendant les enregistrements, la fréquence EPSC spontanée mesurée à partir de l’enregistrement continu (figure 2B, en haut) permet de caractériser l’intégration du PC CA1 dans le réseau local.

En résumé, l’optimisation de la qualité des tranches de l’étendue dorsale de l’hippocampe permet d’enregistrer des cellules entières de plusieurs neurones par tranche. Cette préparation de tranches facilite la collecte de grands ensembles de données d’excitabilité intrinsèque, l’établissement de mesures de variabilité intra-animale et la production de tranches de qualité suffisante pour effectuer des enregistrements appariés à partir de neurones couplés synaptiquement.

Figure 1 : Vue d’ensemble du dispositif expérimental et du schéma de dissection. (A) Outils expérimentaux pour tous les aspects de la préparation des tranches, étiquetés en fonction de l’utilisation. (B) Caricature représentant la direction des incisions avec des coupe-os et le mouvement de la spatule (flèches roses) pour retirer le cerveau du crâne. (C) Vue d’ensemble de l’angle de coupe (ligne rouge pointillée) pour permettre la préservation du CA1 dorsal. (D) Vue d’ensemble de la chambre de tranchage avec le cerveau monté, face antérieure vers le haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Identification de neurones sains de la région CA1 de l’hippocampe dorsal. (A) Micrographie de l’aire CA1 d’une tranche d’hippocampe dorsale aiguë, produite à partir d’une tranche de cerveau presque coronale. La pipette patch est représentée dans une configuration de cellule entière à partir d’un neurone sain dans la tranche (indiquée par une flèche noire). Un neurone voisin très contrasté à éviter pour l’enregistrement est indiqué (flèche rouge). (B) Enregistrements continus représentatifs d’EPSC spontanés réalisés à -70 mV voltage-clamp à partir d’un enregistrement stable d’un PC CA1 sain (noir), avec des EPSC spontanés identifiés (cercles verts) et une cellule instable/malsaine enregistrée dans les mêmes conditions (rouge). Le courant de maintien nécessaire pour maintenir la tension clamp de -70 mV est indiqué. (C) Vue agrandie à partir de la région de la trace en (B) indiquée par une case ombrée. Notez l’EPSC présent dans la trace stable supérieure (noir) et la trace instable et bruyante (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Identification cellulaire et électrophysiologie intrinsèque, mesurées par l’enregistrement par patch-clamp de cellules entières à partir de PC CA1 de l’hippocampe dorsal. (A) Visualisation de la biocytine avec marquage de la streptavidine conjuguée fluorescente, suivie d’une imagerie confocale, à partir d’une tranche contenant plusieurs (6) PC CA1 enregistrés séquentiellement, confirmant l’identité cellulaire des neurones enregistrés. (B) Réponse moyenne à un petit pas d’hyperpolarisation de -10 pA, 500 ms pour déterminer les propriétés de la membrane passive. (C) Réponse en tension d’un PC CA1 identifié à des paliers de courant d’hyper à dépolarisation (-100 à +400 pA, durée 500 ms). Le potentiel d’action de décharge est montré à la fois au courant de rhéobase (balayage gris) et à la décharge maximale à 400 pA. (D) Réponse de la membrane à une onde sinusoïdale de 100 pA, modulée en fréquence de 0,1 à 20 Hz. Notez la réponse de tension plus importante aux taux de cycle les plus bas. (E) Trains de potentiels d’action générés en réponse à des trains de 5 stimuli (durée 2 nA, 2 ms) sur une gamme de fréquences (indiquées). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des solutions utilisées pour la préparation et l’enregistrement des coupes de cerveau. Les solutions sont répertoriées avec leurs composants signalés en mM de concentration. Les notes spécifiques avant l’utilisation sont énumérées.

Ici, un protocole est décrit pour produire des coupes cérébrales de haute qualité à partir de l’extension dorsale du CA1 de l’hippocampe, permettant des enregistrements de plusieurs neurones viables dans cette région. L’approche combinatoire de l’enregistrement de cellules entières à partir de coupes quasi-coronales suivie d’une visualisation des neurones est essentielle à la confirmation de la viabilité et de l’identité cellulaires.

Ce protocole produit de manière fiable des tranches viables pour 2 raisons principales. Tout d’abord, la modification de l’angle de coupe, en tant que déviation de la véritable coronale, permet une plus grande préservation de l’axe somatodendritique et donc une fonction biologiquement pertinente des neurones. Étant donné que l’orientation de l’axe somatodendritique des PC CA1 dans l’extension la plus dorsale de l’hippocampe n’est pas dans le plan d’une véritable section coronale¹, cette modification permet une plus grande préservation des tissus. Alternativement, il est possible d’enlever complètement l’hippocampe et d’utiliser un hachoir à tissus pour préparer des coupes de cerveau, comme décrit précédemment pour les tranches aiguës ^4,33 et pour la culture de tranches^34,35. Un inconvénient de cette approche est le risque d’endommager l’hippocampe lors de son extraction et de son hachage (dans des mains inexpérimentées), ce qui est évité en gardant le cerveau intact. Cette approche ressemble davantage à celle d’études antérieures qui maintiennent les neurones de l’hippocampe dans le plan transversal, par rapport à l’axe septal/temporal^21,22. Le deuxième facteur majeur qui contribue à la viabilité des neurones chez les rats matures est l’utilisation d’une perfusion glaciale de saccharose-ACSF immédiatement avant la décapitation, la dissection et la préparation de la tranche. Étant donné que le crâne du rat à l’âge de plus de 3 mois est généralement épais et beaucoup plus difficile à couper avec des outils traditionnels de préparation de tranches de cerveau (c’est-à-dire des ciseaux fins, des scalpels et des pinces), la durée de la dissection à l’aide de Ronger et de coupe-os est par nature plus longue, de sorte que le pré-refroidissement du cerveau donne au chercheur plus de temps pour la dissection et le tranchage. La vitesse à laquelle le cerveau peut être refroidi et tranché a longtemps été considérée comme avantageuse pour la qualité de la tranche³⁶, en particulier lorsque l’ACSF glacé est perfusé avant que le système cardiovasculaire n’ait été isolé du cerveau 30,31,37,38. Néanmoins, il a été suggéré récemment que des températures plus physiologiques pourraient également être utiles pour l’étude de certaines régions du cerveau³⁹.

La qualité de la tranche produite par la combinaison de la perfusion de saccharose glacé-ACSF et de l’angle de coupe modifié près de la coronale offre une qualité de coupe presque comparable à celle des tranches horizontales préparées au même stade de développement. En effet, l’optimisation de cette technique, en utilisant une composition saccharose-ACSF avec une composition ionique similaire à celle utilisée pour l’enregistrement, permet une grande cohérence entre les conditions utilisées dans l’expérience et les approches de préparation de coupes utilisées pour les rats nouveau-nés. L’un des principaux inconvénients de l’utilisation des conditions de stockage et d’enregistrement des tranches submergées, comme décrit ici, est que l’activité des réseaux neuronaux dans les tranches de cerveau est considérablement réduite par rapport au cadre in vivo. Ce problème est résolu par le transfert des tranches coupées dans une chambre d’interface fonctionnant avec un enregistrement ACSF à 35 °C pour le stockage. Cette approche améliore significativement l’activité du circuit local, permettant de mesurer les oscillations neuronales et les décharges neuronales fonctionnellement pertinentes^40,41. D’autres méthodes de production de tranches à partir de rongeurs plus âgés, telles que l’utilisation de la récupération NMDG, peuvent également produire des tranches de très haute qualité^30,31, qui conviennent aux mêmes enregistrements que ceux décrits. L’avantage spécifique de cette approche ici est qu’elle permet une comparaison directe entre les enregistrements effectués chez des rongeurs plus jeunes, sur la base des préparations de tranches décrites précédemment^21,22 en raison de la base ionique identique des solutions et des conditions de récupération des tranches. Une combinaison de cette approche avec une récupération basée sur les NMDG pourrait également produire des tranches de haute qualité.

Dans l’ensemble, le protocole de préparation et d’enregistrement des coupes cérébrales décrit ici permet une comparaison directe de la physiologie et de l’anatomie neuronales à haut débit, avec d’autres modalités expérimentales réalisées dans l’hippocampe dorsal, comme dans d’autres zones du cerveau, telles que le néocortex. En effet, il existe un nombre croissant d’études qui abordent les différences neurophysiologiques entre l’hippocampe dorsal et l’hippocampe ventral 27,28,38,42,43. Cependant, peu d’études effectuent des enregistrements à un âge comparable à celui utilisé pour les études comportementales, anatomiques ou électrophysiologiques in vivo. Ainsi, la combinaison de procédures de tranchage améliorées et d’un choix approprié de l’âge des rongeurs permettra une corrélation plus réaliste entre la physiologie neuronale et la fonction cérébrale. Les protocoles ci-dessus ont été appliqués à des rats âgés de moins d’un an, mais il n’y a aucune raison de croire qu’ils ne pourraient pas être effectués sur des rats plus âgés si on leur donnait les autorisations appropriées.

En résumé, le protocole présenté ici fournit une méthode fiable pour produire des coupes de cerveau de rats adultes, permettant ainsi de comparer les propriétés électrophysiologiques des neurones à des expériences in vivo et anatomiques.

L’auteur déclare qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’auteur tient à remercier le professeur David JA Wyllie, le Dr Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira et le professeur Peter C Kind pour leurs commentaires utiles sur l’optimisation du manuscrit et du protocole, ainsi que l’Initiative Simons pour le développement du cerveau pour les frais de publication.