从成年啮齿动物的海马背极制备急性脑切片

该协议的目的是描述一种产生背侧海马切片用于电生理检查的方法。该程序在切片制备之前采用冷冻 ACSF 灌注，具有近冠状切片角度，可以保留健康的主要神经元。

来自急性啮齿动物脑切片的全细胞膜片钳记录是现代神经生理学研究的支柱，可以精确测量细胞和突触特性。然而，除了切片电生理学之外，还需要在不同实验模式之间进行相关分析，例如：免疫组织化学、分子生物学、 体内 成像或电生理记录;回答越来越复杂的大脑功能问题。然而，从这些不同的实验方法中得出有意义的结论并不简单，因为即使在相对描述良好的大脑结构中，也存在细胞功能的高度亚区域变异。这在海马体的 CA1 中表现得最为明显，它根据细胞和分子特性具有明确的背腹特性。尽管如此，许多已发表的研究检查了海马背侧的蛋白质表达模式或行为相关的 体内 活性;并用腹内侧区域的细胞电生理学机械地解释发现。这进一步混淆了以下事实：许多急性切片电生理实验是在幼年动物中进行的，而其他实验模式是在更成熟的动物中进行的。为了解决这些问题，该方法结合了成熟 （>60 天龄啮齿动物） 与人工脑脊液的经心灌注，然后制备改良的冠状切片，包括背侧海马的间隔极，以记录 CA1 锥体细胞。这个过程导致产生背侧海马体的健康急性切片，从而允许与其他措施相匹配的基于切片的细胞电生理询问。

海马体可以说是哺乳动物大脑中研究最充分的结构，因为它的体积相对较大，层状结构突出。海马体与许多行为过程有关：空间导航、情境记忆和发作形成。这部分是由于啮齿动物相对容易进入海马体的背侧进行 体内 分析。事实上，主要输出单元通常距离软脑膜表面不到 2 毫米。

在啮齿动物中，海马体是一个相对较大的结构，由端脑内陷形成，从背隔延伸到腹侧新皮层。它由 2 个主要区域组成：齿状回和山茱萸 （CA）;后者根据连通性、细胞解剖学和遗传特性分为 3 个描述明确的亚区域 （CA1-3），延伸到齿状回肺门（以前称为 CA4）¹。这种结构沿海马体的背腹范围保持，尽管突触特性 ^2,3,4、解剖结构⁵、遗传多样性 6、7、8 和行为功能 ^9,10 存在重大变化。在 CA 区域中，CA1 亚域主要由谷氨酸能 CA1 锥体细胞 （CA1 PC） 组成，其中 3 种亚型已被定义¹¹，抑制性中间神经元占神经元的 ~10%，但高度多样化，定义了 30 多种亚型 12,13,14。除了区域特异性差异外，正常衰老已被证明对突触传递^15、16、17、解剖学¹⁸ 和遗传谱¹⁹ 有显着影响。目前以受控方式评估细胞和突触特性复杂性的金标准方法是使用来自急性脑切片的全细胞膜片钳记录²⁰。

对海马功能的理解主要基于背侧作，因为它很容易通过手术或解剖学进入以进行行为任务、植入电极或成像窗口或病毒质粒表达。此外，在许多研究中，这些程序是对晚年或成年啮齿动物进行的，以防止发育过程中大脑结构的变化。尽管如此，许多检查细胞和亚细胞电生理学的方法都是在早期到中期的幼年啮齿动物中进行的，主要是从海马体的腹内侧部分在其横向平面 21,22,23,24,25。在评估了整个背腹范围的情况下，使用组织切碎器来维持横向范围 ^4,26，或者已在年轻大鼠²⁷ 或小鼠²⁸ 中进行了实验。此外，已知在解剖大脑之前冷却组织可以保留大鼠的海马结构²⁹ 和小鼠的新皮层神经元^30,31。然而，关于成熟大鼠从海马背横向轴产生脑切片的细节很少，这是由修饰的冠状切片产生的。

该协议描述了一种方法，通过该方法可以从老年大鼠背侧海马体改良冠状切片中的单个或成对神经元获得全细胞膜片钳记录，然后进行事后形态学鉴定。经心灌注冷冻人工脑脊液 （ACSF） 后获得健康的脑切片，有助于测量 CA1 PC 和局部中间神经元的电生理特性。

所有动物均根据内政部和机构指南（HO# P135148E）生成和维护。所有大鼠维持 12 小时的光照/黑暗循环，并 随意 获取食物和水。

1. 冷 ACSF 经心灌注

1. 在所有实验之前，将 ~200 mL 蔗糖-ACSF（表 1）放入 -20 °C 的冰箱中（直至半冷冻，用于切片），再将 ~100-200 mL 过滤的蔗糖-ACSF 放在冰上（用于灌注），用碳水化合物（95% O₂/5% CO_{2 ）}冒泡。
2. 从家笼中收集一只成年大鼠，并将其放在手术室的笼子中 ~30 分钟，以适应噪音和光线水平。
3. 准备解剖工具（图 1A）、灌注区域和可注射麻醉剂（约 1 mL 200 mg/mL 戊巴比妥钠，终浓度为 100 mg/kg）。
4. 在里面放一小块薄纸或棉绒，准备一个合适的麻醉室。将 1-2 mL 挥发性异氟醚麻醉剂引入腔室内的吸收材料中。
5. 将大鼠置于麻醉室中镇静。监测呼吸，直到呼吸频率下降到每秒 ~1 次浅呼吸。
6. 此时，开始在冰上用碳水化合物鼓泡半冷冻蔗糖-ACSF，以便在切片过程中使用。
7. 称量老鼠并记下它的重量。
8. 通过将制备好的戊巴比妥钠注射到腹膜腔内，对大鼠进行终末麻醉。戊巴比妥钠的剂量应为 100 mg/kg，根据先前服用的药物重量和贮存浓度计算。将大鼠置于保温室中，等待 0.5-5 分钟以达到终末麻醉。
9. 确认反射停止：使用钝探头（即圆形镊子）测试角膜眨眼（触摸瞳孔）和后爪捏（抬腿并捏住后爪）反射。一旦反射停止，使用皮下注射针将大鼠固定在聚苯乙烯或软木手术板上。
10. 打开胸腔，将套管放在心脏左心室的底部。穿刺右心房，立即开始用冰冷的 （0-1 °C） 蔗糖-ACSF 灌注（使用 50 mL/min 的蠕动泵）。
11. 一旦液体完全交换并且身体冷却（<5 分钟），取出套管和针，然后使用断头台斩首。
12. 使用骨剪刀和 Rongeur 骨工具小心快速地去除颅骨（图 1A、1B）。
    1. 首先使用骨剪刀在枕骨大孔上进行 2 次双侧切割，然后用 Rongeurs 将颅骨去除到 lambda 缝合线。用骨剪刀沿着中线缝合线小心地剪到眼睛后面。
    2. 垂直于中线在颅骨上做 2 次双边切割。使用 Rongeurs，沿中线打开头骨。要格外小心地使用细剪刀或钩针去除软脑膜。
13. 用钝铲将大脑从颅骨中挖出，左右按压切断颅神经和视神经。切片前，将大脑放入碳化的半冷冻 （0– 1 °C） 蔗糖-ACSF 中 1-2 分钟。

2. 从背侧海马体制备脑切片

1. 从半冷冻 （0–1 °C） 蔗糖-ACSF 中取出灌注的大脑，并置于衬有滤纸的玻璃培养皿中。将大脑放在其腹面上。
2. 使用手术刀（22 号刀片），从垂直方向 ~10° 处去除大脑的后部，以创建一个平坦的表面，将大脑粘在载物台上（图 1C）。
3. 将少量氰基丙烯酸酯胶涂在振动切片机的舞台上。涂抹胶水，形成比大脑切割表面的横截面积大约 50% 的薄膜。
4. 将大脑从玻璃盘中取出到抹刀上，切面朝下，用画笔引导组织。用一块组织吸干大脑以去除多余的 ACSF，然后将大脑向下滑动，切开表面，到胶水的中心。使用巴斯德移液器，在大脑上加入 1-2 mL 冰冷的蔗糖-ACSF，以去除脑阻滞中的胶水。
5. 将大脑放入切片室中，并用半冷冻蔗糖 ACSF 淹没。使用勺子或抹刀使多余的冰远离脑块，然后碳化（图 1D）。
6. 将振动切片机的刀片移动到位：距大脑背表面 ~1 毫米，垂直于前囟 ~1 毫米。确保刀片完全浸没，并使用画笔去除气泡。
7. 开始切开大脑。要修剪到背侧海马体，请使用 0.1-0.2 mm/s 的速度，水平刀片移动为 1-1.5 mm，倒数振荡率为 ~90 Hz。切片背侧海马体时，将速度降低到 0.05-0.1 mm/s。
8. 每个大脑收集背侧海马切片（名义上是 3-4 个完整切片或 6-8 个半切片）。如果需要腹内侧海马体的纵向切片，请继续切片。一旦背侧海马体被切片，就无需在大约 3^脑 室的位置之外切割额外的组织。停止振动切片机，用弯曲的皮下注射针将切片分开，并收集在切片室的底部。
   注意：切片的厚度为 250-500 μm，具体取决于实验要求。对于来自背侧海马体的记录，通常使用 400 μm 厚的切片来保留尽可能多的本地网络，同时允许合适的显微镜检查条件。
9. 在解剖显微镜下修剪切片以仅包含海马体和覆盖的皮层。将切片转移到预热的 35 °C 腔室中，前表面朝上。
10. 根据要进行的实验确定储存室。为了在浸没式记录室中靠近切片表面获得高质量的全细胞膜片钳或细胞外视野记录，请储存在浸没室中。或者，储存在液/气界面室中，用于记录振荡网络活动或界面细胞外场记录。
11. 对于浸没式储存条件，让切片在 35 ºC 下恢复 30 分钟，从最后一片切片进入储存室开始。这允许代谢过程的重新激活和切割神经突的重新密封。30 分钟后，将储存室转移至室温。

3. 记录背侧海马神经元

1. 用毛细管玻璃制造记录补片移液器。该方案使用 1.5 mm 外径、0.86 mm 内径的硼硅酸盐玻璃和细丝，当填充细胞内溶液时，其尖端电阻为 3-5 MΩ（表 1）。将细胞内溶液在冰上冷却以防止高能成分降解，并在使用前过滤（注射器过滤器，孔径：0.2 μm）。
2. 碳化记录 ACSF 并在水浴 （35-40 ºC） 中预热。在蠕动泵的辅助下，通过灌注管将碳化和预热的 ACSF 输送到记录室。在将切片转移到腔室前几分钟开始灌注。
3. 停止灌注并将脑切片转移到记录室，前表面朝上。用铂环将切片固定到位，铂环上连接着单根丝纤维，形成“竖琴”形状。定位切片，使 CA1 的 金字塔层 垂直于第一个记录移液器的轴线。
4. 以 6-8 mL∙^min-1 的最佳速率重新开始碳化和预热 （35-40 ºC） 记录 ACSF（表 1）的流动。
   注：高流速 （6-8 mL∙^min-1） 是维持切片³² 中网络活性的最佳选择。较低的流速（即 2-3 mL∙^min-1）可用于维持成像实验的切片稳定性，或不需要生物学相关的网络活性。
5. 使用具有 40 倍物镜放大倍率的红外差分推理对比 （IR-DIC） 光学器件（使用 CCD 相机可视化）评估切片质量。如果在光滑和轻微凹陷的表面下方 20-30 μm 的深度可以看到大量卵形、中等对比度的 CA1 PC，则假设切片质量良好（图 2A）。质量差的切片包含大量高度对比、缩小或肿胀的细胞，切片表面不平整。
6. 用细胞内溶液（例如，基于 24 mM 的细胞内 [Cl ^-] ）填充贴片移液器，以便与其他已发表的数据进行比较。
7. 如前所述进行全细胞膜片钳记录²².如果突破时的膜电位 （V_M） 比 -50 mV 更去极化，则从分析中排除细胞，串联电阻为 >30 MΩ;或者在录制过程中串联电阻变化 >20%。在这些记录条件下，串联电阻通常在 8 – 25 MΩ 的范围内，可稳定长达 1 小时。
8. 为了检查来自背侧海马体的 CA1 内在兴奋性，在电流钳配置中使用以下协议通过全细胞记录测试内在生理特性：
   1. 从没有施加偏置电流的静息膜电位，施加小电流 （-10 pA， 500 ms） 电流步骤，重复 30 次。
   2. 从施加偏置电流的 -70 mV 开始，应用 500 ms 持续时间（-100 至 +400 pA，25 pA 步长）的超极化到去极化电流步长，重复 3 次轨迹系列。
   3. 施加 100 pA 峰峰值振幅的正弦波，频率从 0.1 到 20 Hz。重复 3 次。
   4. 施加 5x 2 nA、2 ms 刺激，以 20、40、60、80、100 Hz 的速度驱动动作电位。每个频率扫描 10 次。
   5. 从 -70 mV 电压钳中，施加 5 分钟的自发兴奋性突触后电流 （EPSC） 进行记录。
9. 为了在成功记录后重新密封细胞以进行组织学分析，请通过缓慢缩回贴剂移液管来产生由外而外的斑块。当观察到串联电阻从实验水平增加到 >1 GΩ（通过 -5 mV 测试脉冲测得）时，将保持电位提高到 -40 mV 并完全缩回移液器。
10. 在同一切片中执行其他记录，以满足实验设计所需的统计功效。
11. 从记录室中取出含有记录神经元的脑切片，置于 24 孔板中，用 4% 多聚甲醛（在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中）替换 ACSF 并放置过夜。
12. 第二天，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液替换 PFA 并储存直至组织学处理。如前所述，用荧光偶联的链霉亲和素观察细胞²²。

上述方案允许从成熟大鼠背侧海马体的间隔极制备活切片。该方案中的一个关键因素是在切片制备之前灌注冷冻蔗糖-ACSF，从而在切片表面附近产生健康的 CA1 PC。在 IR-DIC 光学下目视评估产生的切片的质量，被鉴定为具有大的卵形细胞体的健康细胞位于整个锥体层的整个范围内，从致密层到层状（图 2A，黑色箭头）。不健康的切片被鉴定为表面有死细胞，很少在切片深处（图 2A，红色箭头），其识别依据是具有浓缩和高度对比的胞体，或具有浓缩细胞核的大型“气球”胞体。

通过对假定的健康神经元进行全细胞膜片钳记录来确认切片健康状况。全细胞膜片钳记录是通过快速、自发的千兆欧姆密封形成 （15.5 ± 2.9 s; 图 2B），与以前报道的³¹ 相当。当膜破裂时，成熟大鼠的健康神经元具有超极化静息膜电位（平均值：-65.6 ± 1.5 mV，范围：-55.6 至 -73.9 mV;4 只大鼠 15 个）和相对较低的输入电阻（平均值：90.3 ± 5.2 MΩ，范围：54.9 至 134.2 MΩ;4 只大鼠的 19 个 PC）。在10 kHz滤波时，具有高保真自发EPSC（图2C，2D）的高保真自发EPSC（图2 C，2D）确认了一般的切片质量，该噪声具有低电噪声（<10 pA峰峰值）。此外，超极化神经元的稳定细胞记录通常需要 <200 pA 的保持电流，由于在该切片制备的浸没记录条件下没有网络活动，因此该保持电流在长期内是稳定的。

来自背侧 CA1 PC 的全细胞膜片钳记录允许直接测量动作电位放电特性。如果切片质量足够高，则可以在短时间内（~1 小时）从单个切片中记录许多细胞。细胞活力的一个关键决定因素是是否存在完整的树突状树，以及轴突在初始节段之后存活。与垂直方向 10° 的切片角度允许保留这种细胞解剖结构，细胞保留在切片平面内（图 3A）。在胞体测量时，来自成年大鼠的健康 CA1 PC 通常具有 -60 mV 至 -70 mV 的超极化膜电位、100-200 MΩ 的输入电阻和 20-40 ms 的膜时间常数（图 3B）。数据集中包含神经元的一个关键要求是响应去极化刺激的动作电位的存在。成年大鼠的 CA1 PC 对去极化刺激表现出越来越多的动作电位，从流变碱电流到最大测试电流 （400 pA），其中动作电位序列显示尖峰间时间的适应和动作电位幅度的调节（图 3C）。使用变频正弦波（20 秒内 0.1 -20 Hz）可以表征记录的神经元的膜共振（图 3D）。最后，在一定频率范围内时间控制的动作电位放电序列允许比较与产生的超极化相关的 K⁺ 通道的调节和募集（图 3E）。在记录期间使用生物胞素标记的链霉亲和素可视化对完整树突进行 事后 确认后，从连续记录中测量的自发 EPSC 频率（图 2B， 上）允许表征 CA1 PC 集成到本地网络。

总之，优化海马背侧范围的切片质量允许每个切片的多个神经元进行全细胞记录。这种切片制备有助于收集内在兴奋性的大型数据集，建立动物内部变异性测量，以及产生足够质量的切片以执行来自突触耦合神经元的配对记录。

图 1：实验装置和解剖示意图概述。 （A） 切片制备各个方面的实验工具，根据用途进行标记。（B） 描绘用骨头剪切割的方向和刮刀（粉红色箭头）从头骨中取出大脑的运动的卡通。（C） 允许保留背侧 CA1 的切割角度（红色虚线）概览。（D） 切片室的概述，大脑安装，前部朝上。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：从背侧海马体的 CA1 区域鉴定健康神经元。 （A） 来自急性背侧海马切片的 CA1 区的显微照片，由近冠状脑切片产生。膜片移液管以切片中健康神经元的全细胞构型显示（用黑色箭头表示）。指示附近应避免记录的高对比度神经元（红色箭头）。（B） 从健康的 CA1 PC（黑色）的稳定记录中以 -70 mV 电压钳位进行的自发 EPSCs 的代表性连续记录，识别出自发 EPSC（绿色圆圈）和在相同条件下记录的不稳定/不健康的细胞（红色）。图中显示了保持 -70 mV 电压钳所需的保持电流。（C） （B） 中迹线区域的扩展视图，用阴影框表示。请注意顶部稳定的迹线（黑色）和不稳定的噪声迹线（红色）中的 EPSC。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：细胞鉴定和内在电生理学，通过来自背侧海马 CA1 PC 的全细胞膜片钳记录测量。 （A） 使用荧光偶联链霉亲和素标记对生物胞素进行可视化，然后从包含序列记录的多个 （6） CA1 PC 的切片中进行共聚焦成像，确认记录的神经元的细胞身份。（B） 对 -10 pA、500 ms 小超极化步骤的平均响应，以确定被动膜特性。（C） 已识别的 CA1 PC 对超极化到去极化电流阶跃的电压响应（-100 至 +400 pA，500 ms 持续时间）。动作电位放电显示在流变碱电流（灰色扫描）和 400 pA 的最大放电处。（D） 膜对 100 pA 正弦波的响应，频率调制范围为 0.1 - 20 Hz。请注意，在最低循环速率下电压响应较大。（E） 在一定频率范围内（指示）响应 5 个刺激序列（2 nA，2 ms 持续时间）而产生的动作电位序列。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：用于制备和记录脑切片的解决方案列表。 溶液及其组分以 mM 浓度报告。列出了使用前的特定说明。

在这里，描述了一种从海马体 CA1 背侧产生高质量脑切片的协议，允许从该区域内的多个活神经元进行记录。从近冠状切片进行全细胞记录，然后进行神经元可视化的组合方法对于确认细胞活力和身份至关重要。

该协议可靠地产生可行的切片，主要有两个原因。首先，作为对真冠状动脉的偏差，对切割角度的修改可以更好地保留体树突轴，从而更好地保留神经元的生物学相关功能。鉴于 CA1 PC 的体树突轴在海马体最背侧的方向与真正的冠状切片¹ 不在一个平面上，这种修饰允许更大的组织保存。或者，可以完全去除海马体并使用组织切碎机制备脑切片，如前所述，用于急性切片 ^4,33 和切片培养^34,35。这种方法的一个缺点是在提取和切割过程中（在没有经验的手中）可能会对海马体造成损害，这可以通过保持大脑完整来避免。这种方法更类似于早期的研究，这些研究将海马神经元保持在横向平面上，相对于间隔/颞轴^21,22。有助于成熟大鼠活神经元的第二个主要因素是在斩首、解剖和切片制备之前立即使用冰冷的蔗糖-ACSF 灌注。鉴于 3 个月以上的大鼠头骨通常很厚，并且更难用传统的脑切片制备工具（即细剪刀、手术刀和镊子）切割，因此使用 Rongeur 和骨切割器的解剖时间本质上更长，因此大脑的预冷为研究人员提供了更多时间进行解剖和切片。长期以来，人们一直认为大脑冷却和切片的速度有利于切片质量³⁶，尤其是当冰冷的 ACSF 在心血管系统与大脑分离之前灌注时 30,31,37,38。尽管如此，最近有人提出，更多的生理温度也可能对研究某些大脑区域有用³⁹。

冰冷蔗糖-ACSF 灌注和改进的近冠状切割角度相结合产生的切片质量提供了与在同一发育阶段制备的水平切片质量几乎相当的切片质量。事实上，该技术的优化，使用与用于记录的离子组成相似的蔗糖-ACSF 组合物，允许在实验中使用的条件和用于新生大鼠的切片制备方法之间具有高度的一致性。如此处所述，使用浸没式切片存储和记录条件的一个主要缺点是，与体内设置相比，脑切片中神经元网络的活动显着降低。这是通过将切割的切片转移到在 35 °C 下记录 ACSF 的界面室中进行储存来克服的。这种方法显着提高了局部回路的活动，允许测量神经元振荡和功能相关的神经元放电^40,41。从老啮齿动物生产切片的其他方法，例如使用 NMDG 回收同样可以产生非常高质量的切片^30,31，适用于所描述的相同记录。这种方法的具体优点是，由于溶液的离子碱基和切片恢复条件相同，它允许基于前面描述的切片制备^21,22 在年轻啮齿动物中进行的记录之间进行直接比较。将这种方法与基于 NMDG 的恢复相结合也可以产生高质量的切片。

总体而言，此处描述的脑切片制备和记录方案允许以高通量方式直接比较神经元生理学和解剖学，与在其他大脑区域（如新皮层）中进行的其他实验方式在背侧海马体中进行的那样。事实上，有越来越多的研究解决了背侧和腹侧海马体之间的神经生理学差异 27,28,38,42,43。然而，很少有研究在与行为、解剖学或体内电生理学研究相当的年龄进行记录。因此，改进的切片程序和啮齿动物年龄的适当选择相结合，将允许神经元生理学与大脑功能更现实的相关性。上述方案已在 1 岁以下的大鼠上执行，但没有理由相信这不能在给予适当权限的老年大鼠上执行。

总之，这里介绍的方案提供了一种从成年大鼠产生脑切片的可靠方法，从而允许将神经元的电生理特性与 体内 和解剖实验进行比较。

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

作者要感谢 David JA Wyllie 教授、Emma Perkins 博士、Laura Simoes de Oliveira 和 Peter C Kind 教授对手稿和方案优化的有益评论，并感谢 The Simons Initiative for the Developing Brain 提供出版费用。