Vorbereitung von akuten Hirnschnitten aus dem dorsalen Pol des Hippocampus von erwachsenen Nagetieren

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von Schnitten des dorsalen Hippocampus für die elektrophysiologische Untersuchung zu beschreiben. Bei diesem Verfahren wird eine Perfusion mit gekühltem ACSF vor der Schnittvorbereitung mit einem nahezu koronalen Schnittwinkel verwendet, der die Erhaltung gesunder Hauptneuronen ermöglicht.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von akuten Hirnschnitten von Nagetieren sind eine tragende Säule der modernen neurophysiologischen Forschung und ermöglichen eine präzise Messung zellulärer und synaptischer Eigenschaften. Nichtsdestotrotz besteht ein immer größerer Bedarf, neben der Schichtelektrophysiologie auch korrelierte Analysen zwischen verschiedenen experimentellen Modi durchzuführen, z. B. Immunhistochemie, Molekularbiologie, In-vivo-Bildgebung oder elektrophysiologische Aufzeichnung; um immer komplexere Fragen der Gehirnfunktion zu beantworten. Es ist jedoch nicht einfach, aus diesen verschiedenen experimentellen Ansätzen aussagekräftige Schlussfolgerungen zu ziehen, da selbst innerhalb relativ gut beschriebener Gehirnstrukturen ein hohes Maß an subregionaler Variation der zellulären Funktion besteht. Nirgends wird dies besser veranschaulicht als im CA1 des Hippocampus, das gut definierte dorso-ventrale Eigenschaften aufweist, die auf zellulären und molekularen Eigenschaften basieren. Nichtsdestotrotz untersuchen viele veröffentlichte Studien Proteinexpressionsmuster oder verhaltenskorrelierte in vivo-Aktivität im dorsalen Bereich des Hippocampus; und Befunde mechanistisch mit zellulärer Elektrophysiologie aus der ventro-medialen Region zu erklären. Dies wird noch durch die Tatsache verwirrt, dass viele elektrophysiologische Experimente mit akuten Schnitten an juvenilen Tieren durchgeführt werden, während andere experimentelle Methoden an reiferen Tieren durchgeführt werden. Um diese Probleme zu lösen, beinhaltet diese Methode die transkardiale Perfusion von reifen (>60 Tage alten Nagetieren) mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit, gefolgt von der Präparation modifizierter koronaler Schnitte einschließlich des Septumpols des dorsalen Hippocampus zur Aufzeichnung von CA1-Pyramidenzellen. Dieser Prozess führt zur Erzeugung gesunder akuter Scheiben des dorsalen Hippocampus, was eine schnittbasierte zelluläre elektrophysiologische Abfrage ermöglicht, die mit anderen Messungen abgestimmt ist.

Der Hippocampus ist aufgrund seiner relativ großen Größe und seiner ausgeprägten laminaren Struktur wohl die am besten untersuchte Struktur im Gehirn von Säugetieren. Der Hippocampus ist an einer Reihe von Verhaltensprozessen beteiligt: räumliche Navigation, kontextuelles Gedächtnis und Episodenbildung. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass der dorsale Teil des Hippocampus bei Nagetieren für die In-vivo-Analyse relativ leicht zugänglich ist. Tatsächlich sind die Hauptausgangszellen in der Regel weniger als 2 mm von der Pial-Oberfläche entfernt.

Bei Nagetieren ist der Hippocampus eine relativ große Struktur, die aus einer Einstülpung des Telencephalons besteht, die sich vom dorsalen Septum bis zum ventralen Neokortex erstreckt. Er setzt sich aus 2 Hauptregionen zusammen: dem Gyrus dentatus und dem Cornu ammonis (CA); Letzteres ist in 3 gut beschriebene Unterregionen (CA1-3) unterteilt, die sich aufgrund von Konnektivität, zellulärer Anatomie und genetischen Eigenschaften in den Gyrus hilus dentatus (früher als CA4 bekannt) erstrecken¹. Diese Struktur wird entlang der dorso-ventralen Ausdehnung des Hippocampus beibehalten, wenn auch mit großen Unterschieden in den synaptischen Eigenschaften ^2,3,4, der Anatomie⁵, der genetischen Diversität ^6,7,8 und der Verhaltensfunktion ^9,10. Von den CA-Regionen besteht das CA1-Teilgebiet hauptsächlich aus glutamatergen CA1-Pyramidenzellen (CA1-PCs), für die 3 Subtypen definiert wurden¹¹, und inhibitorischen Interneuronen, die ~10% der Neuronen ausmachen, aber mit über 30 definierten Subtypen sehr vielfältig sind 12,13,14. Zusätzlich zu den regionalen spezifischen Unterschieden hat sich gezeigt, dass das normale Altern dramatische Auswirkungen auf die synaptische Übertragung 15,16,17, die Anatomie¹⁸ und das genetische Profil ¹⁹ hat. Die derzeitige Goldstandardmethode zur kontrollierten Beurteilung der Feinheiten zellulärer und synaptischer Eigenschaften ist die Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen aus akuten Hirnschnitten²⁰.

Das Verständnis der Funktion des Hippocampus basiert weitgehend auf der dorsalen Manipulation, da sie chirurgisch oder anatomisch für Verhaltensaufgaben, die Implantation von Elektroden oder Bildgebungsfenstern oder die Expression viraler Plasmide leicht zugänglich ist. In vielen Studien werden diese Verfahren zusätzlich mit spätjuvenilen oder adulten Nagetieren durchgeführt, um eine Variabilität der Gehirnstruktur während der Entwicklung zu verhindern. Nichtsdestotrotz werden viele Ansätze zur Untersuchung der zellulären und subzellulären Elektrophysiologie bei Nagetieren im frühen bis mittleren Juvenilstadium durchgeführt, hauptsächlich aus dem ventro-medialen Teil des Hippocampus in seiner Transversalebene 21,22,23,24,25. Wurde die gesamte dorso-ventrale Ausdehnung bestimmt, so wird ein Gewebehacker verwendet, um die transversale Ausdehnung ^4,26 zu erhalten, oder der Versuch wurde an jungen Ratten²⁷ oder Mäusen²⁸ durchgeführt. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Kühlung des Gewebes vor der Dissektion des Gehirns die Hippocampusstruktur bei Ratten²⁹ und neokortikale Neuronen bei Mäusen^{bewahrt 30,31}. Nichtsdestotrotz gibt es einen Mangel an Details bezüglich der Produktion von Hirnschnitten aus der dorsalen Querachse des Hippocampus, wie sie durch modifizierte koronale Schnitte bei reifen Ratten erzeugt werden.

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, bei dem Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einzelnen oder paarweise Neuronen in modifizierten koronalen Schnitten des dorsalen Hippocampus von gealterten Ratten erhalten werden können, gefolgt von einer post-hoc-morphologischen Identifizierung. Gesunde Hirnschnitte werden nach transkardialer Perfusion von gekühlter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) gewonnen, was die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von CA1-PCs und lokalen Interneuronen erleichtert.

Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien des Innenministeriums und der Institutionen (HO# P135148E) gezüchtet und gepflegt. Alle Ratten wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und erhielten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser.

1. Transkardiale Perfusion von gekühltem ACSF

1. Vor allen Experimenten ~200 mL Saccharose-ACSF (Tabelle 1) bei -20 °C in den Gefrierschrank legen (bis es halbgefroren ist, zum Schneiden) und weitere ~100-200 mL gefilterte Saccharose-ACSF auf Eis (für die Perfusion) geben und mit Carbogen (95 % O₂/5 % CO₂) sprudeln.
2. Holen Sie eine erwachsene Ratte aus ihrem Käfig und setzen Sie sie für ~30 Minuten in einen Käfig im Operationsraum, um sich an Lärm und Lichtverhältnisse zu gewöhnen.
3. Bereiten Sie die Dissektionswerkzeuge (Abbildung 1A), den Perfusionsbereich und das injizierbare Anästhetikum vor (ca. 1 ml 200 mg/ml Natriumpentobarbital für eine Endkonzentration von 100 mg/kg).
4. Bereiten Sie eine geeignete Anästhesiekammer vor, indem Sie einen kleinen Tupfer Seidenpapier oder Watte hineinlegen. Geben Sie 1-2 ml flüchtiges Isofluran-Anästhetikum in das absorbierende Material in der Kammer.
5. Lege die Ratte in eine Anästhesiekammer, um sie zu sedieren. Überwachen Sie die Atmung, bis die Atemfrequenz auf ~1 flachen Atemzug pro Sekunde sinkt.
6. Beginnen Sie an dieser Stelle, halbgefrorene Saccharose-ACSF mit Carbogen auf Eis zu sprudeln, um sie beim Schneiden zu verwenden.
7. Wiegen Sie die Ratte und notieren Sie ihr Gewicht.
8. Betäuben Sie die Ratte endgültig, indem Sie das vorbereitete Natrium-Pentobarbital in die intraperitoneale Höhle injizieren. Die Dosis von Natrium-Pentobarbital sollte 100 mg/kg betragen, berechnet aus dem zuvor eingenommenen Gewicht und der Stammkonzentration des Arzneimittels. Setzen Sie die Ratte in eine Haltekammer und warten Sie 0,5-5 Minuten bis zum Beginn der terminalen Anästhesie.
9. Bestätigen Sie das Aufhören der Reflexe: Testen Sie sowohl die Reflexe des Hornhautblinzelns (Berühren der Pupille) als auch des Kneifens der Hinterpfote (Heben Sie das Bein und kneifen Sie die Hinterpfote) mit einer stumpfen Sonde (d. h. einer abgerundeten Pinzette). Sobald die Reflexe aufgehört haben, befestigen Sie die Ratte mit Injektionsnadeln an der Operationsplatte aus Polystyrol oder Kork.
10. Öffnen Sie die Brusthöhle und platzieren Sie die Kanüle an der Basis des linken Ventrikels des Herzens. Punktion des rechten Vorhofs und Beginn der Perfusion mit dem eiskalten (0-1 °C) Saccharose-ACSF (mit einer Peristaltikpumpe bei 50 mL/Minute).
11. Sobald der vollständige Flüssigkeitsaustausch und die Abkühlung des Körpers (<5 Minuten) stattgefunden haben, entfernen Sie die Kanüle und die Stifte und enthaupten Sie sie mit einer Guillotine.
12. Entfernen Sie den Schädel vorsichtig und schnell mit einer Knochenschere und Rongeur-Knochenwerkzeugen (Abbildung 1A, 1B).
    1. Beginnen Sie mit 2x beidseitigen Schnitten durch das Foramen magnum mit der Knochenschere und entfernen Sie den Schädel bis zur Lambda-Naht mit den Rongeurs. Schneiden Sie vorsichtig mit der Knochenschere entlang der Mittelliniennaht bis knapp hinter die Augen.
    2. Machen Sie 2x bilaterale Schnitte durch den Schädel, senkrecht zur Mittellinie. Öffne den Schädel mit den Rongeurs entlang der Mittellinie. Achten Sie besonders darauf, Pia mater mit einer feinen Schere oder einer Hakennadel zu entfernen.
13. Schöpfen Sie das Gehirn mit einem stumpfen Spatel aus dem Schädel und durchtrennen Sie den Hirn- und Sehnerv mit einer Kompression von Seite zu Seite. Legen Sie das Gehirn vor dem Schneiden 1-2 Minuten lang in karbogenierte, halbgefrorene (0–1 °C) Saccharose-ACSF.

2. Präparation von Hirnschnitten aus dem dorsalen Hippocampus

1. Nehmen Sie das perfundierte Gehirn aus dem halbgefrorenen (0–1 °C) Saccharose-ACSF und legen Sie es in eine mit Filterpapier ausgelegte Petrischale aus Glas. Platzieren Sie das Gehirn auf seiner ventralen Oberfläche.
2. Entfernen Sie mit einem Skalpell (Klinge Nr. 22) den hinteren Teil des Gehirns in einem Winkel von ~10° aus der Vertikalen, um eine ebene Oberfläche zu schaffen, auf der das Gehirn mit dem Tisch verklebt wird (Abbildung 1C).
3. Tragen Sie eine kleine Menge Cyanacrylatkleber auf das Stadium des Vibratoms auf. Verteilen Sie den Kleber, um einen dünnen Film zu erzeugen, der etwa 50 % größer ist als die Querschnittsfläche der Schnittfläche des Gehirns.
4. Hebe das Gehirn mit der Schnittseite nach unten aus der Glasschale auf einen Spatel und führe das Gewebe mit einem Pinsel. Tupfen Sie das Gehirn mit einem Stück Gewebe ab, um überschüssiges ACSF zu entfernen, und schieben Sie das Gehirn mit der Schnittfläche nach unten auf die Mitte des Klebers. Geben Sie mit einer Pasteur-Pipette 1-2 ml eiskalte Saccharose-ACSF über das Gehirn, um den Kleber vom Hirnblock zu entfernen.
5. Legen Sie das Gehirn in die Schneidekammer und fluten Sie es mit halbgefrorener Saccharose ACSF. Verwenden Sie einen Löffel oder Spatel, um überschüssiges Eis von der Hirnblockade fernzuhalten, und karbogenieren Sie dann (Abbildung 1D).
6. Bewegen Sie die Klinge des Vibratoms in Position: ~1 mm von der dorsalen Oberfläche des Gehirns und vertikal ~1 mm vor dem Bregma. Stellen Sie sicher, dass die Klinge vollständig untergetaucht ist, und entfernen Sie Blasen mit einem Pinsel.
7. Fange an, das Gehirn aufzuschneiden. Um auf den dorsalen Hippocampus zu trimmen, verwenden Sie eine Geschwindigkeit von 0,1-0,2 mm/s, mit einer horizontalen Klingenbewegung von 1-1,5 mm und einer reziproken Schwingungsrate von ~90 Hz. Beim Schneiden des dorsalen Hippocampus die Geschwindigkeit auf 0,05-0,1 mm/s reduzieren.
8. Sammeln Sie Scheiben des dorsalen Hippocampus (nominell 3-4 volle Scheiben oder 6-8 halbierte Scheiben) pro Gehirn. Wenn Längsschnitte des ventro-medialen Hippocampus erforderlich sind, fahren Sie mit dem Schneiden fort. Sobald der dorsale Hippocampus durchtrennt wurde, ist es nicht mehr erforderlich, zusätzliches Gewebe über die Position des 3^. Ventrikels hinaus zu schneiden. Stoppen Sie das Vibratom, trennen Sie die Scheibe mit einer gebogenen Injektionsnadel und sammeln Sie sie am Boden der Schneidekammer.
   HINWEIS: Die Scheiben können je nach experimenteller Anforderung 250-500 μm dick sein. Für Aufnahmen aus dem dorsalen Hippocampus werden in der Regel 400 μm dicke Scheiben verwendet, um so viel wie möglich vom lokalen Netzwerk zu erhalten und gleichzeitig die geeigneten Mikroskopiebedingungen zu ermöglichen.
9. Schneiden Sie die Schnitte so ab, dass sie nur den Hippocampus und den darüber liegenden Kortex unter einem Präpariermikroskop enthalten. Die Scheiben mit der vorderen Oberfläche nach oben in die vorgewärmte 35 °C-Kammer geben.
10. Bestimmen Sie die Lagerkammer auf der Grundlage des durchzuführenden Experiments. Um qualitativ hochwertige Ganzzell-Patch-Clamp- oder extrazelluläre Feldaufzeichnungen nahe der Schichtoberfläche in untergetauchten Aufnahmekammern zu erhalten, lagern Sie sie in untergetauchten Kammern. Alternativ kann es in einer Flüssig-Gas-Grenzflächenkammer für Aufzeichnungen der oszillatorischen Netzwerkaktivität oder für extrazelluläre Feldaufzeichnungen an der Schnittstelle aufbewahrt werden.
11. Bei untergetauchter Lagerung lassen Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 35 ºC zurückgehen, nachdem die letzte Scheibe in die Lagerkammer gelangt ist. Dies ermöglicht die Reaktivierung von Stoffwechselprozessen und die Wiederversiegelung von geschnittenen Neuriten. Nach 30 Minuten die Lagerkammer auf Raumtemperatur bringen.

3. Aufzeichnung der dorsalen Hippocampus-Neuronen

1. Stellen Sie Aufzeichnungspipetten aus Kapillarglas her. Dieses Protokoll verwendet Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,86 mm mit Filament, das bei Befüllung mit intrazellulärer Lösung einen Spitzenwiderstand von 3-5 MΩ ergibt (Tabelle 1). Intrazelluläre Lösungen auf Eis gekühlt aufbewahren, um eine Degradation der energetischen Komponenten zu verhindern, und vor der Verwendung filtrieren (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 μm).
2. Carbogenat-Aufzeichnung von ACSF und Vorwärmen in einem Wasserbad (35-40 ºC). Geben Sie den karbogenierten und vorgewärmten ACSF über einen Perfusionsschlauch in die Aufnahmekammer, der von einer Peristaltikpumpe unterstützt wird. Beginnen Sie einige Minuten vor dem Transfer einer Scheibe in die Kammer mit der Perfusion.
3. Stoppen Sie die Perfusion und übertragen Sie ein Hirnschnitt mit der vorderen Oberfläche nach oben in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit einem Platinring fest, an dem einzelne Seidenfasern befestigt sind, um eine "Harfen"-Form zu bilden. Positionieren Sie die Schichten so, dass das Stratum pyramidale von CA1 senkrecht zur Achse der ersten Aufzeichnungspipette verläuft.
4. Starten Sie den Fluss des karbogenierten und vorgewärmten (35-40 ºC) ACSF (Tabelle 1) mit einer optimalen Rate von 6-8 ml∙^min-1 neu.
   HINWEIS: Hohe Flussraten (6-8 ml∙^min-1) sind optimal, um die Netzwerkaktivität in den Schichten³² aufrechtzuerhalten. Niedrigere Flussraten (d. h. 2-3 ml∙^min-1) können verwendet werden, um die Schichtstabilität für bildgebende Experimente aufrechtzuerhalten oder wenn keine biologisch relevante Netzwerkaktivität erforderlich ist.
5. Beurteilen Sie die Schichtqualität mit einer IR-DIC-Optik (Infrared Differential Inference Contrast) mit 40-facher Objektivvergrößerung (visualisiert mit einer CCD-Kamera). Von einer guten Schichtqualität ist auszugehen, wenn eine große Anzahl von eiförmigen, mäßig kontrastierenden CA1-PCs in str. pyramidale in Tiefen von 20-30 μm unterhalb einer glatten und leicht genoppten Oberfläche zu sehen ist (Abbildung 2A). Scheiben von schlechter Qualität enthalten eine große Anzahl stark kontrastreicher, geschrumpfter oder geschwollener Zellen mit einer unebenen Scheibenoberfläche.
6. Füllen Sie ^{Patch-Pipetten} mit einer intrazellulären Lösung (z. B. basierend auf einem intrazellulären [Cl-] von 24 mM), um einen Vergleich mit anderen veröffentlichten Daten zu ermöglichen.
7. Führen Sie Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen durch, wie zuvor beschrieben²². Zellen von der Analyse ausschließen, wenn das Membranpotential (V_M) beim Durchbruch stärker depolarisiert als -50 mV ist, der Serienwiderstand >30 MΩ beträgt; oder der Serienwiderstand ändert sich im Laufe der Aufnahme um >20%. Unter diesen Aufzeichnungsbedingungen liegt der Serienwiderstand typischerweise im Bereich von 8 – 25 MΩ und ist bis zu 1 Stunde stabil.
8. Um die intrinsische Erregbarkeit von CA1 aus dem dorsalen Hippocampus zu untersuchen, testen Sie die intrinsischen physiologischen Eigenschaften mit Ganzzellaufzeichnungen mit den folgenden Protokollen in Stromklemmenkonfiguration:
   1. Wenden Sie vom Ruhemembranpotential ohne angelegten Bias-Strom kleine Stromschritte (-10 pA, 500 ms) an, die 30 Mal wiederholt werden.
   2. Wenden Sie ab -70 mV bei angelegtem Bias-Strom hyper- bis depolarisierende Stromschritte mit einer Dauer von 500 ms (-100 bis +400 pA, 25 pA-Schritte) mit 3 Wiederholungen einer Familie von Leiterbahnen an.
   3. Wenden Sie eine sinusförmige Welle mit einer Peak-to-Peak-Amplitude von 100 pA mit einer variablen Frequenz von 0,1 bis 20 Hz an. 3 Mal wiederholen.
   4. Wenden Sie einen 5x 2 nA, 2 ms Stimulus an, um Aktionspotentiale bei 20, 40, 60, 80, 100 Hz zu steuern. 10 Sweeps pro Frequenz.
   5. Legen Sie von einer -70 mV-Spannungszange 5 Minuten spontane exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSC) für die Aufzeichnung an.
9. Um die Zellen nach erfolgreicher Aufzeichnung für die histologische Analyse wieder zu verschließen, stellen Sie Outside-Out-Patches her, indem Sie die Patch-Pipette langsam zurückziehen. Wenn ein Anstieg des Serienwiderstands von experimentellen Werten auf >1 GΩ beobachtet wird, gemessen durch einen Prüfimpuls von -5 mV, erhöhen Sie das Haltepotenzial auf -40 mV und ziehen Sie die Pipette vollständig zurück.
10. Führen Sie zusätzliche Aufzeichnungen im selben Slice durch, um die erforderliche statistische Aussagekraft des Versuchsdesigns zu erfüllen.
11. Nehmen Sie Hirnschnitte mit aufgezeichneten Neuronen aus der Aufnahmekammer, legen Sie sie in eine 24-Well-Platte, ersetzen Sie die ACSF durch 4 % Paraformaldehyd (in 0,1 M Phosphatpuffer) und lassen Sie sie über Nacht stehen.
12. Am nächsten Tag das PFA durch 0,1 M Phosphatpuffer ersetzen und bis zur histologischen Verarbeitung lagern. Visualisieren Sie Zellen mit fluoreszierend konjugiertem Streptavidin wie zuvor beschrieben²².

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Herstellung lebensfähiger Schnitte aus dem Septumpol des dorsalen Hippocampus bei reifen Ratten. Ein Schlüsselfaktor in diesem Protokoll ist die Perfusion von gekühlter Saccharose-ACSF vor der Schnittvorbereitung, was zu gesunden CA1-PCs proximal zur Schnittoberfläche führt. Die Qualität der erzeugten Scheibe wird visuell unter IR-DIC-Optik bewertet, und gesunde Zellen, die als große, eiförmige Zellkörper identifiziert wurden, befinden sich über die gesamte Ausdehnung des Stratum pyramidale, von der kompakten Schicht bis zum Stratum oriens (Abbildung 2A, schwarzer Pfeil). Ungesunde Schnitte werden als abgestorbene Zellen auf der Oberfläche und selten in den Tiefen der Schnitte identifiziert (Abbildung 2A, roter Pfeil), die entweder auf der Grundlage von kondensierten und stark kontrastierten Somata oder großen "ballonierten" Somata mit kondensierten Kernen identifiziert werden.

Die Bestätigung der Gesundheit der Scheibe wird durch die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von mutmaßlich gesunden Neuronen erreicht. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen werden mit einer schnellen, spontanen Gigaohm-Siegelbildung (15,5 ± 2,9 s; Abbildung 2B), vergleichbar mit den zuvor berichteten³¹. Wenn die Membran gerissen ist, besitzen gesunde Neuronen bei reifen Ratten hyperpolarisierte Ruhemembranpotentiale (Mittelwert: -65,6 ± 1,5 mV, Bereich: -55,6 bis -73,9 mV; 15 Stück von 4 Ratten) und relativ niedrige Eingangswiderstände (Mittelwert: 90,3 ± 5,2 MΩ, Bereich: 54,9 bis 134,2 MΩ; 19 Stück von 4 Ratten). Die allgemeine Schichtqualität wird durch spontane EPSCs mit hoher Wiedergabetreue bestätigt (Abbildung 2C,2D) bei geringem elektrischem Rauschen (<10 pA Spitze-Spitze), wenn sie bei 10 kHz gefiltert werden. Darüber hinaus erfordern stabile Zellaufzeichnungen von hyperpolarisierten Neuronen typischerweise einen Haltestrom von <200 pA, der über lange Zeiträume stabil ist, da in den untergetauchten Aufnahmebedingungen dieser Schichtpräparation keine Netzwerkaktivität vorhanden ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von dorsalen CA1-PCs ermöglichen die direkte Messung der Entladungseigenschaften des Aktionspotentials. Unter der Voraussetzung, dass die Schichtqualität ausreichend hoch ist, können innerhalb eines kurzen Zeitrahmens (~1 Stunde) viele Zellen aus einer einzigen Schicht aufgezeichnet werden. Eine Schlüsseldeterminante für die Lebensfähigkeit der Zellen ist das Vorhandensein eines intakten dendritischen Baumes und des Axons, das über das Anfangssegment hinaus überlebt. Der Schnittwinkel von 10° zur Vertikalen ermöglicht die Beibehaltung dieser zellulären Anatomie, wobei die Zellen in der Schnittebene erhalten bleiben (Abbildung 3A). Gesunde CA1-PCs von erwachsenen Ratten haben typischerweise ein hyperpolarisiertes Membranpotential von -60 mV bis -70 mV, Eingangswiderstände von 100-200 MΩ und Membranzeitkonstanten von 20-40 ms, wenn sie am Soma gemessen werden (Abbildung 3B). Eine wichtige Voraussetzung für die Aufnahme von Neuronen in Datensätze ist das Vorhandensein von Aktionspotentialen als Reaktion auf depolarisierende Reize. CA1-PCs bei erwachsenen Ratten weisen eine zunehmende Anzahl von Aktionspotentialen für depolarisierende Stimuli auf, vom Rheobasenstrom bis zu den maximal getesteten Strömen (400 pA), bei denen die Aktionspotentialfolgen sowohl eine Anpassung der Inter-Spike-Zeiten als auch eine Akkommodation der Aktionspotentialamplitude aufweisen (Abbildung 3C). Die Verwendung einer sinusförmigen Welle mit variabler Frequenz (0,1 -20 Hz über 20 s) ermöglicht die Charakterisierung der Membranresonanz der aufgenommenen Neuronen (Abbildung 3D). Schließlich ermöglichen zeitlich kontrollierte Züge der Aktionspotentialentladung über einen Frequenzbereich einen Vergleich der Akkommodation und Rekrutierung von K⁺ -Kanälen, die mit der resultierenden Hyperpolarisation verbunden sind (Abbildung 3E). Nach der post-hoc-Bestätigung intakter Dendriten mittels Streptavidin Visualisierung der Biocytin-Markierung während der Aufzeichnungen ermöglicht die spontane EPSC-Frequenz, die aus der kontinuierlichen Aufzeichnung gemessen wurde (Abbildung 2B, oben), die Charakterisierung der CA1-PC-Integration in das lokale Netzwerk.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Optimierung der Schnittqualität der dorsalen Ausdehnung des Hippocampus Ganzzellaufnahmen von mehreren Neuronen pro Scheibe ermöglicht. Diese Schnittvorbereitung erleichtert die Sammlung großer Datensätze der intrinsischen Erregbarkeit, die Etablierung von Intra-Tier-Variabilitätsmaßen und die Herstellung von Schnitten von ausreichender Qualität, um gepaarte Aufzeichnungen von synaptisch gekoppelten Neuronen durchzuführen.

Abbildung 1: Überblick über den Versuchsaufbau und das Sezierschema. (A) Versuchswerkzeuge für alle Aspekte der Scheibenzubereitung, die je nach Verwendung gekennzeichnet sind. (B) Karikatur, die die Richtungen von Schnitten mit Knochenscheren und die Bewegung des Spatels (rosa Pfeile) darstellt, um das Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. (C) Übersicht über den Schnittwinkel (gestrichelte rote Linie), um den Erhalt des dorsalen CA1 zu ermöglichen. (D) Überblick über die Schnittkammer mit dem Gehirn auf dem Gehirn, vorderer Aspekt nach oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Identifizierung gesunder Neuronen aus der CA1-Region des dorsalen Hippocampus.(A) Mikroskopische Aufnahme des Bereichs CA1 aus einem akuten dorsalen Hippocampus-Schnitt, hergestellt aus einem nahen koronalen Hirnschnitt. Die Patch-Pipette ist in einer Ganzzellkonfiguration von einem gesunden Neuron in der Schicht dargestellt (gekennzeichnet durch schwarzen Pfeil). Ein nahegelegenes stark kontrastreiches Neuron, das für die Aufzeichnung vermieden werden sollte, ist angedeutet (roter Pfeil). (B) Repräsentative kontinuierliche Aufzeichnungen von spontanen EPSCs, die bei einer Spannungsklemme von -70 mV durchgeführt wurden, ausgehend von einer stabilen Aufzeichnung eines gesunden CA1-PCs (schwarz), wobei spontane EPSCs identifiziert wurden (grüne Kreise) und eine instabile/ungesunde Zelle, die unter denselben Bedingungen aufgezeichnet wurde (rot). Der Haltestrom, der erforderlich ist, um die Spannungsklemme von -70 mV aufrechtzuerhalten, wird angezeigt. (C) Erweiterte Ansicht aus dem Bereich der Kurve in (B), der mit einem schattierten Rahmen gekennzeichnet ist. Beachten Sie die EPSC in der oberen, stabilen Leiterbahn (schwarz) und die instabile, verrauschte Leiterbahn (rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zellidentifikation und intrinsische Elektrophysiologie, gemessen durch Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von dorsalen hippokampalen CA1-PCs. (A) Visualisierung von Biocytin mit fluoreszierend-konjugierter Streptavidin-Markierung, gefolgt von konfokaler Bildgebung, aus einer Schicht, die mehrere (6) nacheinander aufgezeichnete CA1-PCs enthält, die die zelluläre Identität der aufgezeichneten Neuronen bestätigen. (B) Durchschnittliche Reaktion auf einen kleinen Hyperpolarisationsschritt von -10 pA und 500 ms zur Bestimmung der passiven Membraneigenschaften. (C) Spannungsverhalten eines identifizierten CA1 PCs auf hyper- bis depolarisierende Stromschritte (-100 bis +400 pA, 500 ms Dauer). Die Entladung des Aktionspotentials wird sowohl beim Rheobasenstrom (Grey Sweep) als auch bei der maximalen Entladung bei 400 pA angezeigt. (D) Reaktion der Membran auf eine sinusförmige Welle von 100 pA, frequenzmoduliert von 0,1 - 20 Hz. Beachten Sie den größeren Spannungsgang bei den niedrigsten Zyklusraten. (E) Züge von Aktionspotentialen, die als Reaktion auf Züge von 5 Stimuli (2 nA, 2 ms Dauer) über einen Frequenzbereich (angezeigt) erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Liste der Lösungen, die bei der Vorbereitung und Aufzeichnung von Hirnschnitten verwendet werden. Lösungen werden aufgelistet, wobei ihre Bestandteile als mM-Konzentration angegeben werden. Spezifische Hinweise vor der Verwendung sind aufgeführt.

Hier wird ein Protokoll beschrieben, um qualitativ hochwertige Hirnschnitte aus der dorsalen Ausdehnung des CA1 des Hippocampus zu erzeugen, was Aufzeichnungen von mehreren lebensfähigen Neuronen innerhalb dieser Region ermöglicht. Der kombinatorische Ansatz der Ganzzellaufzeichnung aus nahezu koronalen Schnitten, gefolgt von der Visualisierung von Neuronen, ist entscheidend für die Bestätigung der Lebensfähigkeit und Identität der Zellen.

Dieses Protokoll erzeugt aus 2 Hauptgründen zuverlässig brauchbare Scheiben. Erstens ermöglicht die Modifikation des Schnittwinkels als Abweichung vom echten koronalen Winkel eine bessere Erhaltung der somatodendritischen Achse und damit der biologisch relevanten Funktion der Neuronen. Angesichts der Tatsache, dass die Orientierung der somatodendritischen Achse von CA1 PCs in der dorsalen Ausdehnung des Hippocampus nicht in einer Ebene mit einem echten koronalen Schnitt¹ liegt, ermöglicht diese Modifikation eine bessere Gewebeerhaltung. Alternativ ist es möglich, den Hippocampus vollständig zu entfernen und mit einem Gewebehacker Hirnschnitte zu präparieren, wie zuvor für akute Schnitte ^4,33 und für Schnittkulturen^34,35 beschrieben. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit einer Schädigung des Hippocampus während seiner Extraktion und des Zerkleinerns (in unerfahrenen Händen), die vermieden wird, indem das Gehirn intakt bleibt. Dieser Ansatz ähnelt eher dem früherer Studien, die die Hippocampus-Neuronen in der Transversalebene halten, in Bezug auf die septale/temporale Achse^21,22. Der zweite wichtige Faktor, der zu lebensfähigen Neuronen bei reifen Ratten beiträgt, ist die Verwendung von eiskalter Saccharose-ACSF-Perfusion unmittelbar vor der Enthauptung, Dissektion und Schnittvorbereitung. Angesichts der Tatsache, dass der Rattenschädel im Alter von mehr als 3 Monaten in der Regel dick ist und mit herkömmlichen Werkzeugen zur Vorbereitung von Hirnschnitten (d. h. feinen Scheren, Skalpellen und Pinzetten) viel schwieriger zu schneiden ist, ist die Dauer der Dissektion mit Rongeur- und Knochenschneidern von Natur aus länger, so dass die Vorkühlung des Gehirns dem Forscher mehr Zeit zum Sezieren und Schneiden gibt. Die Geschwindigkeit, mit der das Gehirn gekühlt und geschnitten werden kann, ist seit langem als vorteilhaft für die Schnittqualität³⁶ bekannt, insbesondere wenn das eiskalte ACSF perfundiert wird, bevor das Herz-Kreislauf-System vom Gehirn isoliert wurde 30,31,37,38. Nichtsdestotrotz wurde in letzter Zeit vorgeschlagen, dass physiologischere Temperaturen auch für die Untersuchung einiger Gehirnregionen nützlich sein könnten³⁹.

Die Scheibenqualität, die durch die Kombination von eiskalter Saccharose-ACSF-Perfusion und dem modifizierten nahezu koronalen Schnittwinkel erzeugt wird, bietet eine Scheibenqualität, die nahezu mit der von horizontalen Scheiben vergleichbar ist, die im gleichen Entwicklungsstadium hergestellt wurden. In der Tat ermöglicht die Optimierung dieser Technik, bei der eine Saccharose-ACSF-Zusammensetzung mit einer ähnlichen ionischen Zusammensetzung wie bei der Aufzeichnung verwendet wird, eine große Konsistenz zwischen den im Experiment verwendeten Bedingungen und den für neugeborene Ratten verwendeten Schnittvorbereitungsansätzen. Ein großer Nachteil der Verwendung von Lager- und Aufzeichnungsbedingungen unter getauchten Schichten, wie hier beschrieben, besteht darin, dass die Aktivität neuronaler Netzwerke in Hirnschnitten im Vergleich zur In-vivo-Umgebung signifikant reduziert ist. Dies wird überwunden, indem die geschnittenen Scheiben alternativ zur Lagerung in eine Grenzflächenkammer mit ACSF-Aufzeichnung bei 35 °C überführt werden. Dieser Ansatz verbessert die Aktivität des lokalen Schaltkreises signifikant und ermöglicht die Messung neuronaler Oszillationen und funktionell relevantes neuronales Feuern^40,41. Andere Verfahren zur Herstellung von Schnitten aus älteren Nagetieren, wie z. B. die Verwendung der NMDG-Rückgewinnung, können in ähnlicher Weise sehr hochwertige Scheiben^{30, 31} erzeugen, die für die gleichen beschriebenen Aufzeichnungen geeignet sind. Der spezifische Vorteil dieses Ansatzes besteht hier darin, dass er einen direkten Vergleich zwischen Aufzeichnungen ermöglicht, die bei jüngeren Nagetieren durchgeführt wurden, basierend auf zuvor beschriebenen Schnittpräparaten^21,22 aufgrund der identischen ionischen Basis der Lösungen und der Bedingungen für die Rückgewinnung von Schnitten. Eine Kombination dieses Ansatzes mit einer NMDG-basierten Rückgewinnung könnte ebenfalls zu qualitativ hochwertigen Schnitten führen.

Insgesamt ermöglicht das hier beschriebene Protokoll zur Vorbereitung und Aufzeichnung von Hirnschnitten einen direkten Vergleich der neuronalen Physiologie und Anatomie in einer Hochdurchsatz-Weise mit anderen experimentellen Modalitäten, die im dorsalen Hippocampus durchgeführt werden, wie sie in anderen Gehirnbereichen, wie z. B. dem Neokortex, durchgeführt werden. In der Tat gibt es eine zunehmende Anzahl von Studien, die sich mit den neurophysiologischen Unterschieden zwischen dem dorsalen und dem ventralen Hippocampus befassen 27,28,38,42,43. Nur wenige Studien führen jedoch Aufzeichnungen in einem Alter durch, das mit dem für verhaltensbezogene, anatomische oder elektrophysiologische In-vivo-Studien vergleichbar ist. Die Kombination aus verbesserten Schneideverfahren und einer angemessenen Wahl des Alters der Nagetiere ermöglicht eine realistischere Korrelation der neuronalen Physiologie mit der Gehirnfunktion. Die oben genannten Protokolle wurden an Ratten bis zu einem Alter von 1 Jahr durchgeführt, aber es gibt keinen Grund zu der Annahme, dass dies nicht auch bei älteren Ratten mit den entsprechenden Genehmigungen durchgeführt werden könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll eine zuverlässige Methode zur Herstellung von Hirnschnitten von adulten Ratten darstellt und somit einen Vergleich der elektrophysiologischen Eigenschaften von Neuronen mit in vivo und anatomischen Experimenten ermöglicht.

Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Der Autor dankt Prof. David JA Wyllie, Dr. Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira und Prof. Peter C. Kind für hilfreiche Kommentare zur Optimierung des Manuskripts und des Protokolls sowie der Simons Initiative for the Developing Brain für die Bereitstellung der Publikationskosten.