פיתחנו הליך לבידוד של תאי מברשת קנה-קנה, תאי אפיתל כימוסנסוריים מיוחדים נדירים מעכברי כתב פלואורסצנטי כולין אצטילטרנספראז. שיטה זו מבוססת על הפרדה ראשונית של אפיתל קנה דרך מתת-מוזה המאפשרת דגירה קצרה יותר של גיליון האפיתל עם פפאין. זה מאפשר התאוששות חזקה של תאי מברשת קנה דרך שימש בהצלחה לבידוד וניתוח שעתוק של תאי מברשת על ידי רצף RNA.
דגירה ארוכה עם אנזימי עיכול יכולה להפחית את הכדאיות של התאים ולשנות את הפרופיל התמלולי של תאים המבודדים מרקמות. כאן אנו מפרידים את האפיתל קנה דרך עם dispase ולאחר מכן דגירה אותו עם פפאין למשך זמן קצר לייצר תשואות גבוהות של תאי מברשת קיימא. השיטה שלנו יכולה לתרום מחקרים של אפיתל בדרכי הנשימה העליונות.
אותו פרוטוקול ניתן להחיל על בידוד תאי מברשת מאתרי ריר אחרים כגון רקמת האף. הדגמה של הטכניקה המשוחזרת ביותר שלנו תאפשר למדענים עמיתים לבודד ולחקור עוד יותר תאי מברשת קנה הנשימה. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף dispase ו DNase I ל PBS בריכוזים הסופיים המוצגים כאן כדי להכין את פתרון העיכול dispase.
ודא כי אבקת dispase מומס במלואו לפני חימום הפתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף FBS עם 5%הפעלה בחום ל- DMEM כדי להכין פתרון עצירה. כדי להכין את חיץ טירוד אני, להוסיף פפאין ו L-ציסטאין למאגר של HEPES טירוד ללא סידן.
כדי להכין את חיץ Tyrode II, להוסיף leupeptin למאגר של HEPES Tyrode ללא סידן בריכוז של שני microliters למיליליטר. כדי להכין את חיץ FACS, השתמש בתווית המלח המאוזנת של האנק ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום בתוספת שני EDTA מילימול ו 2%FBS. לאחר המתת חום העכבר, השתמש 21 מחטי מד כדי לתקן את זה על לוח כירורגי בתמקם supine עם גפיים עליונות ותחתונות מורחבות.
לרסס את הפרווה עם 70% אתנול כדי לחטא את האזור. באמצעות מדפים ישרים, להרים את העור ואת הפרווה של הבטן ולהשתמש מספריים לנתח לעשות חתך במרכז. באמצעות המספריים, להפריד את העור מן הרקמה התת עורית מהבטן אל mandibula.
תוך החזקת הרקמה התת עורית עם המדפים, לעשות חתך קטן עם המספריים במרכז דופן הבטן. לאחר מכן פתח את ההצבה עם חתך בצורת V. באמצעות המדפים, בעדינות להעביר את המעי הדק לצד.
אתר את האב העורקים הבטן ו vena קאווה ולעשות חתך עם מספריים לנתח כדי לאפשר exsanguination מהירה. אתר את הסרעפת. באמצעות מחט מד 18, לעשות פתח בסרעפת ממש מתחת לעצם החזה כדי לנפח את הריאות.
באמצעות חד מחודד ישר לנתח מספריים, לחתוך לאורך הבסיס של הצלעות כדי להפריד בזהירות את הסרעפת מבית החזה. השתמש במקלות כדי להרים את הקצה החשוף של עצם החזה וחותכים את עצם החזה באורך מבסיס בית החזה לצוואר. השתמש מספריים ישר קצר לעשות חתך מרכזי בצוואר הרחם ולהפריד את שתי האונות של הבלוטות submandibular.
לאחר מכן, השתמש בזוג מדפים מדויקים עדין כדי להסיר בזהירות את רקמת החיבור שמסביב ואת התימוס overlying את קרינה. לנתח את קנה הנשימה חינם על ידי תחילה הפרדת הקצה הפרוקסימלי ברמה של epiglottis ולאחר מכן לנתח את הקצה הדיסטלי ברמה של bifurcation של קנה הנשימה. אתר את האפיגלוטיס וחתוך את קנה הנשימה לאורך מהאפיגלוטיס לקרינה.
כדי להתחיל, מניחים את קנה הנשימה לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 750 microliters של פתרון העיכול dispase מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להפחית את החשיפה לאור ישיר ודרגירה על שייקר ב 200 סל"ד ו בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטרים של DMEM עם 5%FBS כדי לעצור את התגובה ולהמקם את הצינור על קרח.
מעבירים את קנה הנשימה לצלחת פטרי. לכוון את קנה הנשימה עם הצד האפיתל פונה כלפי מעלה. קנה הנשימה המנותח באורך יש צורה גלילית למחצה המתוחזקת על ידי הטבעות העגלתיות.
האפיתל נמצא על המשטח הקסום. באמצעות מדחפים ישרים, לקשור את אזור epiglottis של קנה הנשימה לצלחת פטרי ולהשתמש בגודל 22 סילוק אזמל כדי לגרד את האפיתל את קנה הנשימה. שכבת האפיתל תיפרד כדף שקוף.
השתמש באזמל כדי לטחון את האפיתל ולהעביר את שכבת האפיתל לצינור שני מיליליטר. לשטוף את צלחת פטרי עם 750 microliters של חיץ Tyrode אני ולהעביר את זה לצינור המכיל את שכבת האפיתל. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להפחית את החשיפה לאור ישיר ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 200 סל"ד במשך 30 דקות.
לאחר מכן להוסיף 750 microliters של חיץ טירודה II קר. מערבולת הרקמה המתעכלת במרץ במשך 20 עד 30 שניות. באמצעות מזרק מחובר מחט מד 18, triturate הומוגנית 10 פעמים.
לאחר מכן, לעבור מחט מד 21 ו triturate 10 עד 20 פעמים נוספות. לסנן את התאים דרך מסננת 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף מאגר FACS קר ביחס נפחי של 30 לאחד.
צנטריפוגה ב 350 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור במאגר FACS קר. העבר השעיה זו לצינור פוליסטירן 12 על ידי 75 מילימטר.
צנטריפוגה שוב ב 350 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדן חסימת CD1632 נגד עכבר כדי לחסום כריכה לא ספציפית דגירה על קרח במשך 15 דקות.
לאחר מכן הוסיפו נוגדנים בפקדי האיזוטיפ המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה על קרח במשך 45 דקות תוך הגנה מפני אור ישיר. לאחר מכן, להוסיף 4.5 מיליליטר של מאגר FACS קר לערבב.
צנטריפוגה ב 350 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי ומזג מחדש את גלולת הכדור ב-300 מיקרוליטרים של מאגר FACS קר. יש להוסיף פרופידיום יודיד מיד לפני המיון הציטומטרי של הזרימה.
במחקר זה, תאי מברשת קנה דם מ עכברי כתב אצטילכולין אצטילכולין ChAT eGFP מבודדים בהצלחה עבור רצף RNA. תאים מזוהים מפסולת על ידי זווית פיזור קדימה וצד. כפילות אינן נכללות באמצעות גובה פיזור קדימה ורוחב ורוחב פיזור צד גובה ורוחב.
הכפילים הם התאים בעלי ערכי רוחב גבוה. בתוך התאים הבודדים, התאים החיים מזוהים כאוכלוסייה שלילית פרופידיום יודיד. בתוך התאים היחידים החיים, CD45 תאים נמוכים עד שליליים מזוהים בהתבסס על פקד האיום.
בתוך CD45 תאים שליליים נמוכים, התאים החיוביים EpCAM כי הם גם חיובי eGFP בערוץ FITC הם האוכלוסייה של תאי מברשת. מספרי תאי המברשת משתנים על ידי חשיפה למטבוליטים מיקרוביאליים ופרוטוזואה ולכן משקפים את השונות של המיקרוביוטה המוסדית. לכן, אנו ממליצים להעריך את מספר תאי המברשת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמוד את המספר הצפוי של תאי מברשת מבודדים על ידי מיון ציטומטרי זרימה.
הקפד להפריד כראוי את שכבת האפיתל של קנה הנשימה כפי שהוא קובע את התשואות של תאי מברשת מבודדים. ניתן להשתמש בתאי מברשת קנה הדרך המבודדים במגוון רחב של בדיקות כגון רצף RNA, תרבות תאים וניתוח פונקציונלי.
