我々は、コリンアセチルトランスバシラーゼ蛍光レポーターマウスからの稀な特殊化学感覚上皮細胞、気管ブラシ細胞の単離のための手順を開発した。この方法は、粘膜下膜からの気管上皮の初期分離に基づいており、その後のパパインによる上皮シートの短いインキュベーションを可能にする。これは気管ブラシ細胞の強い回復を可能にし、RNAシーケンシングによるブラシ細胞の分離および転写分析に成功して使用された。
消化酵素による長いインキュベーションは、細胞の生存率を低下させ、組織から分離された細胞の転写プロファイルを変化させる可能性があります。ここでは、気管上皮をディスパスで分離し、その後、実行可能なブラシ細胞の高収率を生成する短時間パパインとそれをインキュベートします。我々の方法は、上気道上皮の研究に貢献することができます。
同じプロトコルは、鼻組織などの他の粘膜部位からブラシ細胞を単離するために適用することができる。私たちの非常に再現性の高い技術のデモンストレーションは、ピアサイエンティストが気管ブラシ細胞を分離し、さらに調査することを可能にします。この手順を開始するには、ディスパーゼとDNase IをPBSに加え、ここで示す最終濃度で、ディスパーゼ消化溶液を調製します。
37°Cの水浴で溶液を温める前に、ディスパーゼパウダーが完全に溶解していることを確認してください。次に、DMEMに5%熱不活化FBSを加えて、停止溶液を準備します。タイローデIバッファを準備するには、カルシウムなしでHEPESタイロードのバッファにパパインとLシステインを追加します。
タイローデIIバッファーを調製するには、1ミリリットル当たり2マイクロリットルの濃度でカルシウムなしでHEPESタイローデのバッファーにロイペプチンを追加します。FACSバッファーを調製するには、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを2ミリモルEDTAと2%FBSで補うことなく、ハンクのバランス塩溶液を使用してください。マウスを安楽死させた後、21ゲージの針を使用して、上肢と下肢を拡張したスーピン位置の外科用ボードに固定します。
毛皮に70%エタノールを吹き付けて、その地域を消毒します。ストレート鉗子を使用して、腹部の皮膚と毛皮を持ち上げ、中央に切開を行うためにはさみを解剖を使用します。はさみを使用して、皮膚を皮下組織から腹部からマンディブラに分離する。
皮下組織を鉗子で持ち上げながら、腹壁の中央にはさみで小さな切開をする。その後、V字型の切開で腹膜を開きます。鉗子を使用して、小腸をそっと横に動かします。
腹部大動脈と大静脈を見つけ、急速な興奮を可能にするために解剖ハサミで切開を行います。ダイヤフラムを見つけます。18ゲージ針を使用して、胸骨のすぐ下の横隔膜に開口部を作り、肺を収縮させる。
鋭利な尖ったまっすぐな解剖ハサミを使用して、肋骨のベースに沿って切り取り、ダイヤフラムを胸部から慎重に分離します。鉗子を使用して胸骨の露出端を持ち上げ、胸骨を胸部の基部から首まで縦方向に切断します。短いストレートハサミを使用して、中央の子宮頸部切開を行い、顎下腺の2つのローブを分離します。
この後、細かい点の高精度鉗子のペアを使用して、周囲の結合組織とカリナの上に位置する胸腺を慎重に取り除きます。最初に喉頭蓋のレベルで近位端を分離し、気管の分岐のレベルで遠位端を解剖することによって気管を自由に解剖する。喉頭蓋を見つけ、喉頭蓋からカリーナまで縦方向に気管を切ります。
まず、気管を摂氏37度に予め温めた750マイクロリットルのディスパーゼ消化液を含む1.5ミリリットルのチューブに入れる。チューブをアルミホイルで覆い、直接光への露出を減らし、200 RPMのシェーカーと室温で40分間インキュベートします。その後、反応を停止し、氷の上にチューブを置くために5%FBSでDMEMの750マイクロリットルを追加します。
気管をペトリ皿に移します。上皮側を上を向いて気管を向け。縦方向に解剖された気管は、軟骨環によって維持される半円筒形を有する。
上皮は凹面にある。ストレート鉗子を使用して、気管の喉頭蓋領域をペトリ皿にテザーし、サイズ22の処分メスを使用して気管から上皮を削り取ります。上皮層は半透明のシートとして分離する。
メスを使用して上皮をミンチし、上皮層を2ミリリットルチューブに移します。750マイクロリットルのタイロードIバッファーでペトリ皿をすすいで、上皮層を含むチューブに移します。チューブをアルミホイルで覆い、直接光への露出を減らし、200 RPMのシェーカーで37°Cで30分間インキュベートします。
その後、750マイクロリットルの冷たいタイローデIIバッファーを加えます。消化した組織を20〜30秒間激しく渦化させる。18ゲージ針に取り付けられた注射器を使用して、ホモジネートを10回トリチュレートする。
この後、21ゲージの針に切り替え、さらに10〜20回トリチュレートします。100マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に細胞をフィルターします。冷たい FACS バッファを 30 対 1 の体積比で追加します。
350倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、冷たいFACSバッファー内のペレットを再中断します。この懸濁液を12~75ミリのポリスチレンチューブに移します。
350倍gで再び遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、100マイクロリットルのFACSバッファーにペレットを再懸濁します。次に、非特異的結合をブロックし、氷上で15分間インキュベートするために、抗マウスCD1632ブロッキング抗体を1マイクロリットル加えます。
次に、テキストプロトコルで概説されているように、それぞれのアイソタイプコントロールに抗体を追加します。直接光から保護しながら、氷の上で45分間インキュベートします。この後、4.5 ミリリットルのコールド FACS バッファーを追加し、ミックスします。
350倍gと摂氏4度で遠心分離機。上清を捨て、冷たいFACSバッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。フローサイトメトリックソートの直前にヨウ化プロピジウムを添加します。
本研究では、ChAT eGFPアセチルコリン蛍光レポーターマウスの気管ブラシ細胞がRNAシーケンシングのために正常に単離されている。細胞は前方および側面の散乱角度によって破片から識別される。ダブルは前方散乱の高さ、幅、横のスキャッタの高さと幅を使用して除外されます。
倍精度浮動小数点数は、幅の値が高いセルです。単一細胞内では、生細胞はヨウ化プロピジウム陰性の集団として同定される。生きた単一細胞内では、低から負の細胞のCD45は、アイソタイプコントロールに基づいて同定される。
CD45低負細胞内では、FITCチャネルでeGFP陽性でもあるEpCAM陽性細胞がブラシ細胞の集団である。ブラシ細胞数は、微生物代謝物および原生動物への暴露によって変化し、したがって、機関微生物叢の変動を反映する。そこで、蛍光顕微鏡によるブラシ細胞数を推定し、フローサイトメトリックソートによって予想される単離されたブラシ細胞の数を測定することを提案する。
気管の上皮層が分離したブラシ細胞の収量を決定する場合は、適切に分離してください。単離された気管ブラシ細胞は、RNAシーケンシング、細胞培養および機能解析などの幅広いアッセイに使用できます。
