פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור סטנים מרוממים במודל בעלי חיים קטן של התעצמות laryngotracheal ומאפשר לנו למנף בעלי חיים מהונדסים גנטית בצורה חסכונית. מיקום טרנסורל של סטנט דרכי הנשימה eluting התרופה חוסך את בעלי החיים מחתך פתוח לתוך קנה הנשימה המייצג מודל רלוונטי יותר קלינית של התעצמות laryngotracheal. טכניקה זו מקלה על חקירה פרה-קלינית של אסטרטגיות אספקת תרופות מקומיות לטיפול בהטנוזה בגרינגוטרצ'אל.
טכניקה זו מספקת פלטפורמה אפשרית ויעילה לחקירה תרגום של סטנטים בדרכי הנשימה eluting סמים במודל בעלי חיים קטן שניתן ליישם לחקירה עתידית במודלים גדולים יותר של בעלי חיים, כמו גם יישום קליני. טכניקה במיוחד צנרור transoral, אינדוקציה של פגיעה קנה הנשימה, ואת שלב מיקום סטנט דרכי הנשימה. הדגמה חזותית של ניתוח מאתגר מבחינה טכנית זה היא קריטית כמו רבים של הפרטים הקטנים לא ניתן לתאר באופן מלא במילים.
כדי להפוך 1%rapamycin המכיל פתרון פולימר, להוסיף שישה מיליגרם של rapamycin ל 600 מיליגרם של 70-30 PLLA-PCL בבקבוקון זכוכית. מתחת למכסה המנוע של האדים, הוסיפו שישה מיליליטר של דיכלורומטן לבקבוקון הראפאמיצין בתוספת ושליטה והוסיפו 120 מיקרוליטרים של גליצרול לכל בקבוקון. לאחר מכן מכסים את הבקבוקונים ומאפשרים לפתרון PLLA-PCL להומוגניזציה למשך 6 עד 12 שעות בטמפרטורת החדר.
כדי ליצור סטנט דרכי הנשימה מורין, באמצעות חומרים סטריליים וטכניקה, להחיל מיליליטר אחד של פתרון PCL תוסף rapamycin על הקנטולה הוורידית של 22 מד מפילן פלואורלן מבוסס אנגיוקטטר תוך האטת סיבוב הקטטר. כאשר כל הפתרון יושם, אביזר אנגיוקטטר מעוצב עם קצה אנגיוקטטר פונה כלפי מטה ואת הידית של קטטר על קצה צלחת פטרי זכוכית במכסה המנוע ואקום. לאחר 24 שעות תחת ואקום בטמפרטורת החדר, לסובב בעדינות להחליק את הקטטר ממבנה סטנט מיובש ולבדוק היקף את הסטנט עבור כל פגמים שאולי גרמו במהלך תהליך הליהוק.
כדי לסייע בהדמיה, מומלץ לצייר קו שחור דק לאורך הסטנט. חותכים כל קצה של הסטנטים יצוק עם מספריים ישר דק, כך הקצוות הם סרנים ולהשתמש במספריים לחתוך כל סטנט לשלושה מקטעים סרנים מילימטר. ואז לטעון כל סטנט שלושה מילימטר על קטטר ורדים חדש 22 מד.
עבור אינדוקציה של היטנה laryngotracheal, לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, מניחים את העכבר הראשון על פלטפורמה כירורגית במצב supine לולאה חתיכה קטנה של חוט מודבק על החלק העליון של הפלטפורמה סביב החותכים המרכזיים. אבטח את הגפיים לשולחן עם סרט הדבקה ובצע חתך אנכי בקו האמצע באורך 1.5 ס"מ בצוואר העכבר. מחלקים את התימוס overlying ו משני האונות וכתוצאה מכך כדי לדמיין את קנה הנשימה.
מחלקים את השרירים השטרנוהיאידים והשטרנותירואידים מעליהם בהחזקה הנעלה דו-צדדית ומעבירים 22 אנגיו-קתטר מד רוחבי דרך הגרון לקנה הנשימה. באמצעות ממטרים קטנים, להפעיל לחץ על הגרון הראשון של העכבר כדי לסייע במיקום הנכון של הקטטר. אנגיוקטר ממוקם כראוי יכול להיות חזותי על ידי צבע לבן שלה דרך קנה הנשימה.
כדי לגרום לפציעה, להעביר מברשת תיל מצופה Bleomycin דרך אנגיוקטטר מוכנס לאט למשוך את הקטטר, כך שרק מברשת תיל נשאר בתוך קנה הנשימה. באמצעות ממטרים עדין, להחיל לחץ נגדי על קנה הנשימה כדי לשבש מכנית את לומן קנה הנשימה עם המברשת לפני החזרת קטטר לתוך קנה הנשימה מעל המברשת. הסר את מברשת התיל ולהטמיע מחדש את Bleomycin לפני החדרה והסרה של המברשת ארבע פעמים נוספות כפי שהודגם רק.
לאחר היישום האחרון Bleomycin, להסיר את הקטטר מן קנה הנשימה. למיקום טרנס-אורל של PLLA-PCL, ודא שקו אנכי שחור דק שולבו בכל סטנט וצנרר באופן רוחבי את העכבר עם האנגיוקטר שנטען מראש. הסטנט צריך להיות חזותי בתוך קנה הנשימה דרך החתך הטרנסרבי.
כאשר הסטנט נמצא במקום, השתמש בממטרים עדין כדי לתפוס בחוזקה אך בעדינות את קנה הנשימה דרך החתך כדי להחזיק את הסטנט במקום ולהסיר את הקטטר. זה קריטי למקם את הסטנט בזהירות רבה ככל האפשר. יותר מדי לחץ על קנה הנשימה יגרום לקריסת הסטנט ולגרום לחסימת דרכי הנשימה ומוות לחיה.
סגור את החתך עם דבק רקמות או תפרים כרומיים 4-0 נספגים המשמשים כאן ולאפשר לעכבר להתאושש עם ניטור לפני החזרת החיה לכלוב הבית שלה. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, מניחים את העכבר של עניין בתצב supine על הפלטפורמה הכירורגית ולהשתמש מספריים איריס מעוקל עדין כדי לפתוח מחדש את החתך. חשוף את קנה הנשימה כפי שהוכח ולהשתמש במספריים כדי לחלק את קנה הנשימה הדיסטלי מתחת לרמת הסטנט.
לאחר מכן, מחלקים את קנה הנשימה הפרוקסימלי מתחת לגרון ומעל הסטנט ומפרידים את קנה הנשימה המחולק מהוושט האחורי. לאחר מכן הסירו את הסטנט מקנה הנשימה ותקן את קנה הנשימה ב-10% פורמלין למשך 24 שעות. מבנה סטנט PLLA-PCL טעון מתכלה בשימוש במחקר זה הוא מסוגל לאסוף rapamycin באופן עקבי וצפוי בתנאים פיזיולוגיים.
בתמונה זו, סטנט biocompatible מיניאטורציה ניתן לראות באתרו בתוך קנה הנשימה כפי שצוין על ידי הסמן השחור על הסטנט דמיינו דרך קנה הנשימה של העכבר שקוף. לאחר 21 ימים, סמן הצבע השחור יכול לשמש כדי לאשר את התחזוקה של מיקום סטנט בתוך קנה הנשימה. בדיקות תאימות ביולוגית באמצעות כתמים immunofluorescent עבור סמנים של דלקת חריפה וכרונית מראים כי מבנה סטנט PLLA-PCL אינו immunoreactive כפי שנקבע על ידי המספר המינימלי של תאים חיסוניים נוכח לאחר המיקום בהעדר פציעה.
מניפולציה של דרכי הנשימה בצורה עדינה ואטראומטית היא קריטית להצלחת ההליך. כוח מופרז, צנרורים מרובים והתמוטטות סטנט עלולים להוביל למוות של בעלי חיים. לאחר טיפול בסטנט rapamycin-eluting, הערכת הישרדות, ביטוי גנים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת, immunoassay כולל ציטומטריה זרימה, ELISA, אימונוהיסטוכימיה יכול להתבצע.
כפי שהוא מספק פלטפורמה מוצלחת עבור elution סמים במודל העכבר, טכניקה זו סוללת את הדרך לחקירות עתידיות של טיפולים מקומיים מיושמים בהטמנת הגרון. דיכלורומתאן הוא נוזל מאכל. הקפד תמיד להשתמש ברדס אדים, ציוד מגן אישי, וחומרים שאינם קורוזיביים
