עבודה זו נתמכה על ידי סינגפור משרד החינוך (מו) Tier 1 (RGT3/13 ו- RG42/15-G.C.) ו מו Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 וגם MOE2015-T2-1-028 כדי G.C.).

כבר הגיש בקשה לרישום פטנט (פט/179/14/15/PCT) בהתבסס על העבודה שדווחו פה.

RNA oligomers של הרשות הפלסטינית מחייב דופלקס (למשל, 10-מרס) הם מולקולות בגודל בינוני, ובכך יכול להראות electrophoretic ניידות shift בעת איגוד RNAs בגודל דומות או מעט גדול יותר (לדוגמה, 50-מר או קטן יותר). אם RNA הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר הרשות הפלסטינית, טיטור של הרשות הפלסטינית לתוך RNA לא יפעלו עקב שינוי הניידות ג'ל מוגבלת. לפיכך, הרנ א גדולים עשויים להיחתך עבור מבחני דף שאינם denaturing. טיטור של RNA גדול אל הרשות הפלסטינית התווית על-ידי fluorophore מאפשר פיקוח על היווצרות טריפלקס על ידי ג'ל agarose ללא denaturing עם הדגימה טעון באמצע ג'ל40.
עבור ניסוי טיטור מאת שאינם denaturing דף עם ריכוז מוחלט קבוע של RNA, אנחנו בדרך כלל להשתמש ללא תווית של RNA ריכוז 1 מיקרומטר עבור פוסט יעיל מכתים של RNA חופשי, להקות טריפלקס על ידי אתידיום ברומיד. ריכוז ה-RNA המתחילים 0.2 µM ייתכן גם יספיק בהתאם הבונה RNA31. ריכוז RNA ללא תווית (0.2 µM) קובע כי הערכיםד Kניתן למדוד באופן מדויק צריך להיות על 0.2 µM או גדול יותר. צבעי מכתימים אחרים עשוי לשמש כדי לשפר את היעילות מוכתמים. לחלופין, נתונים שלא פורסמו שלנו מראים כי Cy3 RNAs שכותרתו צבען יכול לשמש בניסויים דף שאינו denaturing כדי למדוד את האירועים איגוד חזק.
בשל העובדה כי 2-aminopurine הוא רק בינוני פלורסנט, 2-aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור מוגבל גם למדידה של האיגוד עם ערכיםד Kקרוב או מעל 0.2 µM31. את הרנ א או הרשות יכולה להיקרא עם צבע בהיר יחסית אורגנים מחייב יחסית חזק על פתרון באמצעות טיטור פלורסצנטיות, אם הכריכה גורמת לשינויים פלורסצנטיות אותות53,54, 55.
האסטרטגיה של פילוח RNA מבנים על ידי איגוד dsRNA Pna נבדקו עבור מספר מוגבל של RNAs. סביר כי איגוד מאפיינים עשויים להשתנות עבור dsRNAs עם יצירות רצפים וזוג בסיס שונים. אדם יכול תמיד לבחור סטרנד פורין עשיר של דופלקס על עיצוב האתר של TFPNAs. זה קריטי להבין איך ברציפות Q· C-G משולשים עשוי להשפיע על יציבות טריפלקס. מחקרים מקיפים יותר תלוית רצף בבירור הדרושים כדי להבין את מאפייני האיגוד תלוית רצף של TFPNAs.
זיקה מחייבת של TFPNAs יכול להיות משופרת נוספת על ידי הגדלת האורך ו/או שינוי עוד יותר את עמוד השדרה ובאוהלי56,57 של TFPNAs. עם זאת, אזור דופלקס רציף לא לעיתים קרובות מורכבים יותר מ- 10 זוגות בסיס רצופים ללא הפרעה על ידי מבנים שאינם-ווטסון-קריק. אחד אולי נזווג TFPNAs עם מולקולות קטנות להכרה הלא-ווטסון-קריק במבנים סמוכים לאזורים dsRNA. בעקרון, המספר המשלים מולקולת TFPNA-קטן צפוי פופולארים זיקה מחייבת וספציפיות ביחס TFPNA או מולקולה קטנה לבד. עם זאת, מאפייני מקשר עבור ההטיה58,59,60,61,62,63,64 כימיים חייב להיות מותאם.
העובדה כי TFPNAs יכול באופן סלקטיבי לאגד dsRNAs על ssRNAs ועל dsDNAs מרמז שזה אפשרי לפתח TFPNAs וגם מאוד שימושי הגששים כימי פוטנציאלי ליגנדים טיפולית באמצעות ויסות dynamics מבניים RNA ואינטראקציות עם חלבונים, מטבוליטים. ספיגת הסלולר של TFPNAs עשויים להקל דרך הבניין עם חודר לתא moieties כמו מולקולות קטנות, פפטידים, חלקיקים, או complexation עם מבנים סופרא מולקולרית כגון ליפוזומים5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. להמשיך functionalization של TFPNAs עם bioimaging תגיות כגון fluorophores ופילטרציה-מיכשור וציוד עשוי לקדם את הזיהוי, הדמיה, והיעדים של מבנים פונקציונליים RNA היצורים החיים.

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות, עקב התפתחויות אחרונות התגליות של התפקידים של RNAs בוויסות, זרז של תהליכים ביולוגיים שונים-1,-2,-3. באופן מסורתי, קווצות antisense שימשו כדי לאגד ssRNAs עד ווטסון-קריק היווצרות דופלקס3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. לאחרונה, יוצרי טריפלקס חומצות גרעין פפטיד (TFPNAs) עוצבו כדי לאגד dsRNAs ויה Hoogsteen מימן מליטה28,3,(איור 1)29. אזורים dsRNA נמצאים רוב מסורתיים, ממוקדות antisense RNAs, לרבות pre-mRNAs ו- mRNAs, קדם או פרי-miRNAs3רבים אחרים ללא קידוד RNAs1,26,27. מיקוד dsRNAs דרך סליל משולש היווצרות באמצעות TFPNAs עשוי להיות יתרון עקב ירידה לפרטים שלו מבנה והוא של פוטנציאל גדול לשימוש עבור שחזור פונקציות רגיל של RNAs, אשר dysregulated מחלות, למשל.
שפורסם לאחרונה לעבוד על-ידי. Rozners et al., וגם אנחנו3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, דיווח על המאמצים על שיפור הכריכה סלקטיבי של ששונה TFPNAs לכיוון dsRNAs עם זיקה משופרת. פיתחנו שיטות סינתזה עבור הרשות הפלסטינית מעוצב באופן רציונלי מונומרים (איור 2) כולל thio-pseudoisocytosine (L) מונומר30 ו ציטוזין 5-methyl guanidine-לאחרונה (Q) מונומר31. באמצעות שיטות איפיון ביוכימי, biophysical שונות, הראו Pna קצר יחסית (6-10 שאריות) הופכים שאריות L ו- Q הצג לזיהוי טוב יותר של זוגות בסיס ווטסון-קריק G-C ו- C-G, בהתאמה, ב- dsRNAs. יתר על כן, Pna המכילה שאריות L ו- Q בהשוואה ל- Pna שלא שונתה, להראות מחייב יותר סלקטיבי כלפי dsRNA ssRNA ושל dsDNA. פונקציונליות guanidine42 בבסיס Q מאפשר Pna להזין הלה תאים31.
במעבדה שלנו, אנחנו יוצרים Pna מאת מפחיד-הכימיה ידנית (מפחיד או t- מפחיד ופירושה טרט-butyloxycarbony (ראה איור 2) פפטיד מוצק-שלב הסינתזה שיטה4. הסינתזה של מונומר הרשות הפלסטינית עם מפחיד כמו אמין מגן הקבוצה הוא נוח כמו הקבוצה מפחיד sterically פחות מסורבל בהשוואה fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) אמין מגן הקבוצה, אשר עשוי להיות מועיל במהלך מונומר הרשות הפלסטינית צימוד תמיכה מוצקה. הקבוצה מפחיד הוא חומצה-יציב, ניתן להסיר בקלות על התמיכה מוצק על ידי 20-50% חומצה trifluoroacetic (TFA) דיכלורומתאן (DCM) במהלך סינתזה של הרשות הפלסטינית. סינתיסייזר פפטיד אוטומטי יכול להיות מועסק לסנתז oligomers הרשות הפלסטינית; עם זאת, 3-5-קיפול עודף של הרשות הפלסטינית מונומר יש צורך של סינתיסייזר פפטיד אוטומטית. סינתזה ידנית דורשת באופן משמעותי פחות מונומר הרשות הפלסטינית (2-3-לקפל עודפי), עם כל צימוד בפיקוח בקלות המבחן של הקייזר43. יתר על כן, סינתיסייזרים אוטומטיות רבות אינן תואמות הסינתזה אסטרטגיה מפחיד עקב השימוש של מאכל TFA במהלך השלב להסרת מפחיד.
הרשות הפלסטינית oligomers יכולים להיטהר על-ידי הפוכה-פאזי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (RP-HPLC) ואחריו משקל מולקולרי אפיון על-ידי MALDI-TOF (3 דמויות ו- 4)30, 31. אנו מעסיקים שאינם denaturing דף לפקח על היווצרות טריפלקס, בשל העובדה כי דופלקס RNA חופשי בונה ואת הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעתים קרובות להציג הגירה שונים המחירים (איור 5)30,31 . אין תיוג דרושה אם יעיל פוסט-צביעת יכולה להיות מושגת הן של RNA דופלקס, PNA· רנ א2 להקות טריפלקס. כמות קטנה יחסית של מדגם נדרש לניסויים דף שאינם denaturing. עם זאת, המאגרים טעינה (הדגירה) ואת המאגרים פועל (pH 8.3) לא ניתן אותו, וכתוצאה מכך המידות מצטמצם דופלקסים kinetically יציב, כי pH גבוה יחסית של 8.3 עשוי באופן משמעותי ביציבותה של טריפלקס.
2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (עם שיא פליטה-בסביבות 370 ננומטר) רגישות לשינויים מבניים הסביבה המקומית, ולא מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד איגוד (אתר הרשות הפלסטינית איור 6) 31. שלא כמו רבים אחרים צובעים המוצגים פליטת קרינה פלואורסצנטית לטווח הגלוי, 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA ניתן לחשוף לחדר אור ללא צילום הלבנה. בניגוד דף ניסוי שבו מאגר הפעלה של pH 8.3 נדרש לעיתים קרובות, 2-aminopurine המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית טיטור מאפשרת מדידת מחייב פתרון אחד ב- pH שצוין, ובכך עלולה לאפשר את המידה ואת גילוי של חלשה יחסית, כריכת kinetically יציב על שיווי משקל.
UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של דופלקסים (איור 7)31 : triרכיבי plex30,32,44,45. בהתאם להרכב רצף לאורכה, כור ההיתוך של דופלקסים עלול או עשוי שלא להציג מעבר ברור. ניתן לקבל פרמטרים תרמודינמי אם העקומות חימום וקירור של חופפים. פרמטרים תרמודינמי מדויק ניתן להשיג על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC)32; עם זאת, כמויות גדולות יחסית של דגימות נדרשים בדרך כלל עבור המרכז לטניס בישראל.

<table><tbody><tr><td>Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodified PNA monomers</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 endcapped (5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Customized&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות. לפיכך, יש פוטנציאל אדיר בפיתוח הגששים כימי ליגנדים טיפולית על ההכרה של רצף ה-RNA ומבנה. מבחינה כימית שונה פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers פותחו לאחרונה שיכולים לזהות רנ א דופלקסים באופן ספציפי רצף. Pna יציבים מבחינה כימית עם שדרה פפטיד דמוי נייטרלי. Pna יכול להיות מסונתז יחסית בקלות באמצעות השיטה הידנית של סינתזה מוצק-פאזי פפטיד מפחיד-כימיה. Pna וגופם מטוהר באמצעות HPLC הפוכה-פאזי, ואחריו על ידי אפיון משקל מולקולרי לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של טיסה (MALDI-TOF). Non-denaturing לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) טכניקה מקלה על ההדמיה של היווצרות טריפלקס, כי תוכנן בקפידה דופלקס חינם RNA בונה הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעיתים קרובות המחירים שונים ההעברה הצג. Non-denaturing דף עם אתידיום ברומיד פוסט מכתים לעתים קרובות טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל, RNA סיכות או דופלקסים עם בסיס יחיד זוג מוטציות מרובות ניתן לאפיין את הרשות הפלסטינית מחייב מאפיינים, כגון איגוד הזיקות ו specificities. 2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine הוא רגיש לשינויים מבניים הסביבה המקומית, מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד באתר איגוד של הרשות הפלסטינית. 2-Aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור יכול לשמש גם כדי לוודא את מידת הבררנות איגוד של PNAs ששונה לקראת זוגיות גדילי יישוב RNAs (dsRNAs) מעל חד גדילי RNAs (ssRNAs). UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של הרשות הפלסטינית-RNA דופלקסים ו PNA· רנ א2 דופלקסים. כאן, אנו מתארים את הסינתזה, טיהור של הרשות הפלסטינית oligomers שילוב שונה משקעים, והוא מתאר שיטות ביוכימיות biophysical פלואורסנציה ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה.

הפוך-פאזי HPLC מאפשר הטיהור של הרשות הפלסטינית oligomers. אפשר להשיג טהור oligomers הרשות הפלסטינית עם שני סיבובים של HPLC טיהור (איור 3). ניתן לאשר את הזהות של PNAs ניתוח MALDI-תוף (איור 4).
דף denaturing שאינם הוא טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל נשתמש RNA סיכות או דופלקסים מרובים עם מוטציות בסיס יחיד זוג כדי לאפיין את מאפייני האיגוד (איור 5). הלא denaturing דף הנתונים שמוצג באיור 5 בבירור מציע Q ו- L-מהונדס PNA יכול לזהות אזור dsRNA עם זוג C-G (איור 5B, החלונית התחתונה) אך לא אחד ללא זוג C-G (איור 5B, טופ לוח). הכרה זאת ספציפית ומשופרות היא דרך t · A-U, L· G-C, ו- Q· C-G PNA· רנ א2 -צורה משולשת הבסיס (איור 1A, C, D). Pna שונים עם מוטציות בודדות או רבות עשוי לשמש גם כדי להדגים את מאפייני איגוד משופרת הרשות הפלסטינית המתוקנת. הראינו כי הוספת 2 מ מ Mg2 + במאגר הדגירה אינה משפיעה על הכריכה באופן משמעותי31.
הראו על ידי טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine המאגד הרשות הפלסטינית Q ו- L-מהונדס אזור dsRNA יישוב (איור 6א, 6 C, 6 D) אולם לא ssRNA (איור 6B 6E, 6F). הרשות הפלסטינית P3 המאגד 2 aminopurine-שכותרתו dsRNA עם ערךד Kשל 0.8 ± 0.1 מיקרומטר. עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר עבור ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' נשאר קבוע יחסית עם ריכוז P3 מגוונת, המציין היעדר קשירה של הרשות הפלסטינית P3 ssRNA.
Pna המכיל Q משקעים (P2, P3) הצג לא תרמית התכה מעברים (איור 7), רומז לא מחייב ssRNA. זאת בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג Q-G. בהשוואה ל- P1 הרשות הפלסטינית שלא שונתה, P4 Pna ומכילה P5 ששינה שאריות L אך ללא שאריות Q, הצג ירדה טמפרטורות ההיתוך דופלקסים RNA-הרשות המתאימה בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג L-G. UV-ספיגת-זוהה תרמי ההיתוך הנתונים עקביים עם הנתונים טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine, אשר גם מראים כי הרשות הפלסטינית המכילה שאריות Q ו- L אפשרות לאגד ssRNA ניכרת (איור 6B 6E, 6F). בסיס Q הוא חמוד יותר מאשר בסיס L, כמו בסיס Q יש התנגשות הסטריים משמעותית יותר על היווצרות זוג ווטסון-קריק-כמו ש- G (איור 1F) לעומת זוג דמויי קריק ווטסון L G (איור 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
איור 1 : מבנה כימי של מבנים יציבים בסיס משולש ולא יציב זוג בסיסים. (י-ם) מייג'ור-groove PNA· רנ א2 משולשים הבסיס של t · A-U (), C+· G-C (B), L· G-C (ג) ו- Q· C-G (D). (E, F) לא יציב ווטסון-קריק כמו הרשות הפלסטינית-RNA בסיסי זוגות של L-G (E) ו- Q-G (F). האות R מייצגת את עמוד השדרה של סוכר-פוספט של RNA. קשרי מימן מסומנים באמצעות קווים מקווקווים שחור. הדמות המופקת מן ההפניה31. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
איור 2 : מבנה כימי של הרשות הפלסטינית מונומרים. מוצגים ארבעה מונומרים הרשות הפלסטינית (T, C, L ו- Q). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
איור 3 : המבנה הכימי של הרשות הפלסטינית אוליגומר וכן טיהור על ידי RP-HPLC- (א) המבנה הכימי של הרצף הרשות הפלסטינית P3. (ב, ג) RP-HPLC נתונים של P3 הרשות הפלסטינית גולמי (B) מחדש לטהר P3 הרשות הפלסטינית (C). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
איור 4 : MALDI-TOF הספקטרום של P3 הרשות הפלסטינית מטוהרים. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
איור 5 : סיכת ראש ה-RNA, רצפים של הרשות הפלסטינית ואפיון מחייב מאת דף שאינם denaturing. סיכות (A) RNA (rHP1 ו- rHP2), הרשות הפלסטינית P3, PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין הרשות הפלסטינית P3 rHP2. דף Non-denaturing (B) (12%) תוצאות עבור rHP1 ו- rHP2 מחייב את הרשות הפלסטינית P3. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. סיכות RNA טעון (rHP1 ו- rHP2) הינם 1 מיקרומטר ב 20 µL. הריכוזים הרשות הפלסטינית הנמצאים בסמטאות משמאל לימין הם 0 0.2 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ו- 50 מיקרומטר. הרשות הפלסטינית P3 אפשרות לאגד rHP1 (לוח העליון) אבל נקשר rHP2 (פאנל התחתונה). (ג) Kנחישותd עבור איגוד P3 כדי rHP2. השבר של היווצרות טריפלקס (Y) הייתה להתוות נגד הריכוז הרשות הפלסטינית. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
איור 6 : קרינה פלואורסצנטית טיטור מחקר של איגוד הרשות הפלסטינית P3כדי הנקרא-2-aminopurine RNAs. השאריות 2-aminopurine מיועדת כמו '2' ברצף ה-RNA. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. (א) PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין P3 של dsRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (dsRNA2-2AP). דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA היפותטי (B) A נוצר בין P3 ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (ssRNA2-2AP). (C, E) קרינה פלואורסצנטית ספקטרום הפליטה עבור 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA דופלקס (1 מיקרומטר) ו ssRNA (1 מיקרומטר), בהתאמה, עם מגוון P3 ריכוז ב- pH 7.5. הפסגה-בסביבות 475 nm נובע פליטת קרינה פלואורסצנטית חלש הבסיס L הרשות הפלסטינית. (D, F) K נחישות d בהתבסס על העלילות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (ב- 370 ננומטר) של RNA דופלקס, ssRNA, בהתאמה, לעומת הרשות הפלסטינית P3 ריכוז. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
איור 7 : תרמית התכה תוצאות ה-RNA-PNA דופלקסים. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ NaH2PO4, pH 7.5. כל הדגימות להכיל 5 מיקרומטר RNA חד-גדילי (ssRNA1), ואת הרשות הפלסטינית ב- 130 µL. (א) RNA חד-גדילי (ssRNA1), Pna (P1, P2, P3, P4 ו P5) היפותטי דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA שנוצר בין הרשות הפלסטינית P3 ssRNA1 בכיוון מקביל. הקלאש הסטריים הוא הצביע עבור ווטסון-מהנחל כמו ש- G ו- L-G זוגות. התכה (B) ' עקומות ' עבור Pna שונים מחייב את ssRNA1. טמפרטורות ההיתוך מוצגים על העיקולים עם התכה מעברים. הדמות היא ממאמרו של הפניה31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Views.  Nanyang Technological University. אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

Video: Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biochemistry

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Chemistry

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Immunology and Infection

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, and free radicals, are ubiquitous. As a result, RNA undergoes various reactions that include its cleavage, degradation, or modification, leading to biologically relevant species with distinct functions and implications. One example is the oxidation of guanine to 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which may occur in the presence of reactive oxygen species (ROS). Overall, procedures that characterize such products and transformations are largely valuable to the scientific community. To this end, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a widely used method. The present protocol describes how to characterize RNA fragments formed after enzymatic treatment. The chosen model uses a reaction between RNA and the exoribonuclease Xrn-1, where enzymatic digestion is halted at oxidized sites. Two 20-nucleotide long RNA sequences [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] and [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] were obtained via solid-phase synthesis, quantified by UV-vis spectroscopy, and characterized via MALDI-TOF. The obtained strands were then (1) 5&#39;-phosphorylated and characterized via MALDI-TOF; (2) treated with Xrn-1; (3) filtered and desalted; (4) analyzed via MALDI-TOF. This experimental setup led to the unequivocal identification of the fragments associated with the stalling of Xrn-1: [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], and [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. The described experiments were carried out with 200 picomols of RNA (20 pmol used for MALDI analyses); however, lower amounts may result in detectable peaks with spectrometers using laser sources with more power than the one used in this work. Importantly, the described methodology can be generalized and potentially extended to product identification for other processes involving RNA and DNA, and may aid in the characterization/elucidation of other biochemical pathways.

MALDI-TOF was used to characterize fragments obtained from the reactivity between oxidized RNA and the exoribonuclease Xrn-1. The present protocol describes a methodology that can be applied to other processes involving RNA and/or DNA.

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

<meta charset="utf8"></head><body>ננו-מכונות DNAzyme מדויקות לניתוח RNA ו-DNA מפלים

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: התקדמות בננו-חיישנים של DNA – התמודדות עם אתגרי רגישות וסלקטיביות בזיהוי מולקולרי

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין