Name: co-localization of cell lineage markers and the tomato signal
Uploaded: 2016-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal at JoVE.com

This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

כל הפרוטוקולים היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת טקסס A &amp; M אוניברסיטת קולג &#39;של רפואת שיניים. גידול בעלי חיים 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלושה מודלים של בעלי חיים במחקר זה. כדי לחקור את גורלם של chondrocytes עובריים במבנה condyle, השימוש הראשון Col10a1-Cre 15 עכברים ולחצות אותם עם Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) עכברים להשיג Col10a1- עכברים Cre ו Rosa26 tdTomato. לאחר מכן, לחצות עכברים אלה עם עכברים 2.3Col1a1-GFP 16. השתמש Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחקור את גורלם של chondrocytes לאחר הלידה, לפי אותו נוהל כמו בשלב 1.1, אבל להשתמש ERT2 Aggrecan-cre (AGG-Cre ERT2קו 17,18) ולשמור את ERT2 AGG-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (תרשים 1C). להזריק טמוקסיפן על יום הלידה 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלב את השושלת תא התחקות טכניקה עם immunofluorescence, לחצות AGG-Cre העכברים ERT2 ועכברים Rosa26 tdTomato. משתמשים בעכברים שנושאים שני הגנים בניסוי ולהזריק את טמוקסיפן על יום הלידה 3 (איור 1D). </li></ol> 2. הכנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת טמוקסיפן באתנול 10% ו -90% שמן תירס בריכוז של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. המינון להזרקה הוא 75 מ&quot;ג / ק&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת paraformaldehyde (PFA) ב PBS לריכוז של 4%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 4% פתרון PFA כדי לתקן את הרקמה (להלן condyle mandibular ורגל האחוריות משמשות כאן) לאחר הקרבה. בגלל שלהרעילות, להתמודד עם PFA בשכונה עם כפפות facemask. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת EDTA במים מזוקקים לריכוז של 10%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 10% EDTA כדי decalcify condyle mandibular ורגל אחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אבקת סוכרוז PBS בריכוזים של 15% ו -30%. השתמש תמיסת סוכרוז כדי ליבש הרקמה לאחר decalcification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת hyaluronidase ב PBS בריכוז של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 5.0. פתרון זה לאחזור אנטיגן immunofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינור 1.5 מ&quot;ל להכין פתרון חסימת המכיל אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ו -20% סרום עיזים ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינור 1.5 מ&quot;ל להכין פתרון נוגדן ראשוני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. הריכוז של הנוגדן הראשוני הוא 1: 400 עבור Runx2 ו 1: 100 עבור DMP1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינור 1.5 מ&quot;ל להכיןפתרון IgG הארנב כמו השליטה מכתימה immunofluorescent כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. הפתרון מכיל 2% נסיוב עז ב PBS. הריכוז של IgG הארנב לבקרת Runx2 הוא 1: 400; עבור DMP1, 1: 100. בצע את המכתים לניסוי ובקרה בעת ובעונה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינור 1.5 מ&quot;ל להכין פתרון נוגדנים משני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. השתמש נוגדנים משני בדילול של 1: 500. </li></ol> .3 סט הכנה המיקרוסקופית Confocal (Cell Lineage איתור בלבד, ללא שילוב עם Immunofluorescence) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק טמוקסיפן בעכברי AGG-cre ERT2 בנקודת זמן מתאימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר עכבר מהכלוב שלה. לאחר מכן, השתמשו באגודל ובאצבע המורה השמאלית כדי לתפוס את העור בצד האחורי של העכבר והפוך אותו, לחשוף את הבטן. השתמש ביד ימין להחזיק את המזרק. נקודת הכניסה האופטימלית עבור זריקה היא על lEFT או בצד ימין של hypogastrium, הימנעות הכבד וכיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את המזרק במקביל הרגליים האחוריות של העכבר להזריק intraperitoneally. המינון להזרקה הוא 75 מ&quot;ג / ק&quot;ג. המשקלים של עכברים בכל הגילאים 2 שבועות, 3 שבועות, ו -4 שבועות כ 7 - 9 גרם, 11 - 13 גרם, ו 16 - 18 גרם, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם שילוב Xylazine / Ketaset. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין הפתרון עובד, הראשון לדלל את Xylazine ו Ketaset עם מים מזוקקים כדי בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו -5 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה. לאחר מכן, לערבב את Xylazine ו Ketaset ב יחס של 1: 2. המינון להזרקה הוא 30 μl / g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק כמו בשלב 3.1. אשר את ההרדמה על ידי צובט את קרסול העכבר. העכבר הוא לא מודע אם הוא לא מגיב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse העכברים עם 4% PFA לאחר הרדמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר מאבד את הכרתו, לתקן את ארבע רגליו של העכבר על גבי הלוח כדי entirely לחשוף את הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הבטן עם אתנול 70% ולעשות כריתה מהבטן התחתונה לצוואר לאורך הקו האמצעי. לצבוט ובמקביל למשוך את העור לצדדים לרוחב כדי לחשוף את קרום הצפק. השתמש במספריים לנתיחה כדי לבצע כריתה אורכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך ולהסיר את הצלעות הקדמיות כדי לחשוף את הלב. לנקב את הלב מן החדר השמאלי עם מזרק 22 G, להחזיק את המזרק, ובמקביל לחתוך את משבצת את אפרכסת ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את PFA 4%, אשר perfused לאורך מערכת הלב וכלי הדם בעוד גלי הדם מתוך חתך את אפרכסת ימין. היקף PFA עבור זלוף הוא 1 מ&quot;ל / גרם. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלף את העור העכבר ולשים את כל הגוף לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ&quot;ל המכיל 40 מ&quot;ל של 4% PFA לתקן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">השתמש במספריים לנתיחה # 3 ו # 5 מלקחיים כדי להסיר את הלסת התחתונה בזהירות רגל אחורית מהגוף וכדי להסיר את השרירים והגידים על פני השטח. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הלסת התחתונה לתוך שתי חתיכות באזור הדיסטלי של הטוחנת השלישית. באופן דומה, לחתוך את עצם הירך לבין השוקה ב midshaft לחשוף את חלל מח עצם על מנת להאיץ decalcification. מכניסים את החלק הכולל את תהליך condyle ו condylar ויחד עם הרגל האחורית לתוך 40 מ&quot;ל של EDTA 10% עד decalcify ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 4 ימים בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 50 מיליליטר של סוכרוז 15% כדי לייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 30% סוכרוז מייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במישור sagittal, להטביע את המדגם עםאוקטובר על צלחת חיתוך במכונה cryosection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופקי להניח את condyle או הרגל האחורית העובש הגובר. להטביע את הרקמה ב אוקטובר ולהשאיר אותה במכונה cryosection עד ב- OCT קופא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר לחסום אוקטובר על צלחת חיתוך. מתן כ 15 דקות לפני החיתוך, כדי להבטיח כי ב- OCT הוא קפוא לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את condyle ורגל אחורית למקטעים של 10 מיקרומטר. אסוף בסעיפים בשקופיות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמחק את המים סביב כל קטע. השתמשו בעט מחסום הידרופובי להקיף את הסעיפים ושחרר DAPI או שאינם fluorescing פתרון גובר אנטי לדעוך לתוך המעגל. בזהירות להניח את התלוש לכסות. </li></ol> 4. מכתים immunohistochemical עבור Runx2 ו DMP1 הערה: con IgGtrol הכרחי מכתים immunohistochemical להימנע אותות חיוביים שגויים. המכתים עבור הקבוצות מלאות הניסיוניות לבצעו בעת ובעונה אחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עט מחסום הידרופובי להקיף את כל החלקים בשקופית. משלב זה, להוסיף את כל הפתרון המוכן למעגל לכיסוי החלק לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את החלקים עם hyaluronidase בתא לח על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. היקף הפתרון (בצעדים 4.5 - 4.8) תלוי בגודל של הסעיף. השתמש 50 μl של פתרון עבור condyle ו 100 μl של העצם הארוך. לשטוף עם PBST (PBS המכיל 0.1% Tween 20) שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן וליישם את הפתרון החוסם כל מקטע דגירה אותם בתא לח במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקה עם עיקריהפתרון נוגדן (Runx2 אנטי עכבר ארנב, או ארנבת אנטי עכבר DMP1) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף עם שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקה עם פתרון נוגדנים משני (ארנב נגד עז, ​​Alexa פלואוריד 488) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף עם שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את המים סביב סעיף ושחרר DAPI למעגל כדי לכסות את החלק בשקופית. בזהירות להניח את התלוש לכסות. </li></ol> 5. מיקרוסקופי Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות תא ניאון באמצעות מיקרוסקופ confocal באורכי גל הנעים בין 488 מיקרומטר (ירוק) 561 מיקרומטר (אדום). קח תמונות מוערמים מרובים ב 200 הרץ (מידות של 1,024 × 1,024) 19 באמצעות 10X, 20X, ו 63X עדשות. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification.">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte:+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate.">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage.">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-differentiation+of+hypertrophic+chondrocytes+into+cells+capable+of+producing+a+mineralized+bone+matrix.">Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix.</a> Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).</li><li>Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-tracing+methods+and+the+kidney.">Lineage-tracing methods and the kidney.</a> Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).</li><li>Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lineage+tracing+to+study+kidney+injury+and+regeneration.">The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration.</a> Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+fate+of+hypertrophic+chondrocytes.">Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes.</a> Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+Directly+Transform+into+Bone+Cells+in+Mandibular+Condyle+Growth.">Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth.</a> J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).</li><li>Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genet. 10 (12), (2014).</li><li>Purcell, P., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Chondrocyte:+No+Bones+about+It.">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li><li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter.">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts:+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters.">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors.">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li><li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage.">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li><li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes.">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li><li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse?.">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li><li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes:+death+or+lineage+extension?.">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?.</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li><li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice.">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse.">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li><li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes.">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li><li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing.">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li><li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+induces+rapid,+reversible+atrophy,+and+metaplasia+in+mouse+stomach.">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li><li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen.">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER(T)+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

בשל מגבלות טכנולוגיות, זה תמיד קשה כדי לחקור את התנהגותם של תאים in vivo. עם זאת, הטכניקה התחקות תא השושלת היא להוכיח להיות כלי רב עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא 7-9. במחקר זה, אנו עוד יותר לשפר בפרוטוקול זה על ידי שילוב עם immunofluorescence. בדרך זו, גורל תא יכול להיות מוגד?...

במהלך הפיתוח, היווצרות העצם endochondral חשבונות עבור יותר מ -80% מנפח השלד. הוא האמין נרחב כי הוא מתחיל עם אפופטוזיס של כונדרוציטים היפרטרופית. בהמשך לכך, התאים ממח העצם הבסיסי לפלוש וליזום אנגיוגנזה, ואחריו בתצהיר עצם חדש על ידי העצם מארו ותאי הנגזרות periosteum 1,2. גורל התא של כונדרוציטים היפרטרופית (HCS), לעומת זאת, כבר בעיה של הוויכוח במשך עשרות שנים 3. בתחילה, HCS נחשב סוף מסלול הבידול הכונדרוציטים, אפופטוזיס נחשב בדרך כלל להיות מה עלה בגורלה של HCS. עכשיו, כמה חוקרים מציעים כי לפחות חלק HCS יכול לשרוד ולתרום היווצרות העצם endochondral. למרות שהציעו שהצמיחה chondrocytes צלחת הייתה היכולת transdifferentiate לתוך אוסטאובלסטים מבוסס על ultrastructure, מכתים immunohistochemical, ו במבחנה מחקרים 46, אף אחת מהשיטות הללו were מכריע הוכחת תרומה הכונדרוציטים אל שושלת אוסטאובלסטים. שושלת תא טכניקת ההתחקות מספקת דרך קפדנית יותר ללמוד גורל תא. בקצרה מדבר, אנזים recombinase, אשר באה לידי ביטוי רק סוג מסוים של התא, מגרה את הביטוי של הגן הכתב. בדרך זו, זה סוג של תא וצאצאיהם מסומנים 7 לצמיתות. מערכת Cre-loxP היא נפוצה עקיבת שושלת. Cre (אנזים recombinase) יהיה בלו רצף STOP בין שני אתרי loxP ולהפעיל את הכתב בבית (איור 1 א) שורת תאים ספציפית. במקרים מסוימים, החוקר יכול לבחור נקודת זמן מתאימה כדי להפעיל Cre באמצעות תרופה, כגון טמוקסיפן, גרימת Cre איחוי צורה שונה של קולטן אסטרוגן (Cre ERT2) 8. כתבים פלורסנט הפכו לסטנדרט השושלת התחקות ניסויים כי הם להפחית באופן דרמטי את המורכבותולשפר את הדיוק והיעילות של גורל התא התחקות 8,9. tdTomato הופך את הבחירה הטובה ביותר בין כתבי ניאון שכן יש את חלבון פלואורסצנטי מבריקי epifluorescence החזק, מה שהופך אותו בקלות דמיין 7 (איור 1 א). באמצעות השושלת Rosa26 tdTomato התחקות המערכת, הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים הראו כי HCS יכול לשנות הפנוטיפ שלהם לתוך תאי עצם במהלך ההתפתחות 10-14. כדי להשיג זאת, פיתחנו שתי מערכות של התחקות שילובים עם Rosa26 tdTomato (ביטוי בכל מקום בכל התאים) / Cre (ספציפית chondrocytes) עכברים: 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ו immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים מראים כי שתי השיטות דרכים קיימא ללמוד גורל התא in vivo.

<table><tbody><tr><td>Tamoxifen&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>activate the Cre event&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6148</td><td>fix the sample</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10713</td><td>decalcify the hard tissue</td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>dehydrate the tissue</td></tr><tr><td>Hyaluronidase from bovine testes&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>retrieve antigen for immunochemical staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A3059</td><td>blocking solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>primary antibody for Runx2&amp;nbsp;</td><td>Cell Signal</td><td>D1L7F</td><td>primary antibody for immunochemical staining</td></tr><tr><td>primary antibody for DMP1</td><td>provided by Dr. Chunlin Qin</td><td></td><td>primary antibody for immunochemical staining</td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG</td><td>Sigma</td><td>18140</td><td>control for immunochemical staining</td></tr><tr><td>secondary antibody&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>second antibody for immunochemical staining</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>embed the sample for frozen section</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>PBST</td></tr><tr><td>non-fluorescing antifade mountant</td><td>Life technologies</td><td>P36934</td><td>mounting slides</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life technologies</td><td>P36931</td><td>nuclear staining</td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>circle the section on the slide for for immunochemical staining&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td>anesthetization&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketaset&amp;nbsp;</td><td>Zoetis</td><td></td><td>anesthetization&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cryosection machine</td><td>Leica</td><td>CM1860 UV</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Leica</td><td>DM6000 CFS&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

co-localization of cell lineage markers and the tomato signal

מערכת התחקות שושלת התא נעשתה שימוש בעיקר במחקרים בביולוגיה התפתחותית. שימוש recombinase Cre מאפשר ההפעלה של כתב קו תאים ספציפי וכל הצאצאים. הנה, השתמשנו שושלת תא התחקות טכניקה על מנת להוכיח כי chondrocytes ישירות להפוך אוסטאובלסטים ו osteocytes במהלך עצם ארוך ופיתוח condyle mandibular באמצעות שני סוגי Cre, Col10a1-Cre ו Aggrecan-Cre ERT2 (AGG-Cre ERT2), חצה עם Rosa26 tdTomato. שניהם Col10 ו aggrecan הם מוכרים היטב סמנים עבור chondrocytes. על בסיס זה, פתחנו שיטת שושלת תאים חדשה התחקות בשיתוף עם גורל תא אימונוהיסטוכימיה אל פלורסנט להגדיר על ידי ניתוח הביטוי של סמני תאים ספציפיים. Runx2 (סמן תאים osteogenic בשלב מוקדם) ו הדנטין מטריקס protein1 (DMP1; כסמן תאים osteogenic בשלב מאוחר) היומשמש לזיהוי תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים ומצב הבידול שלהם. שילוב זה לא רק מרחיב את תחולת עקיבת שושלת תא, אלא גם מפשט את הדור של עכברים מתחמים. יתרה מכך, מספר, מיקום, וסטטוסי הבידול של צאצאים בתא ההורה מוצגים בו זמנית, מתן מידע רב יותר מאשר שושלת תא התחקות לבד. לסיכום, שיתוף היישום של טכניקות התחקות שושלת תא immunofluorescence הוא כלי רב עצמה על חקירת ביולוגיה של תא in vivo.

Chondrocytes ישירות להפוך תאי עצם (אוסטאובלסטים ו Osteocytes) ב mandibular condyle ולונג עצם. Aggrecan, גן קריטי chondrogenesis, בא לידי ביטוי בעיקר chondrocytes מוקדם ובוגרת 18. כתוצאה מכך, הזרקה של טמוקסיפן 2 שב?...

Watch this Scientific Journal Video about Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal at JoVE.com

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונדרוציטים לתוך תאי עצם.

שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Views.  Texas A&M University College of Dentistry.  פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונ?...

Video: Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Biology

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Neuroscience

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying cellular and molecular mechanisms regulating lineage transitions of neural stem cells (NSCs) and eventual production of neurons and glia in the developing neuroepithelium remains unclear. Methods to trace NSC division patterns and map the lineage of clonally related cells have advanced dramatically. However, many contemporary lineage tracing techniques suffer from the lack of cellular resolution of progeny cell fate, which is essential for deciphering progenitor cell division patterns. Presented is a protocol using mosaic analysis with double markers (MADM) to perform in vivo clonal analysis. MADM concomitantly manipulates individual progenitor cells and visualizes precise division patterns and lineage progression at unprecedented single cell resolution. MADM-based interchromosomal recombination events during the G2-X phase of mitosis, together with temporally inducible CreERT2, provide exact information on the birth dates of clones and their division patterns. Thus, MADM lineage tracing provides unprecedented qualitative and quantitative optical readouts of the proliferation mode of stem cell progenitors at the single cell level. MADM also allows for examination of the mechanisms and functional requirements of candidate genes in NSC lineage progression. This method is unique in that comparative analysis of control and mutant subclones can be performed in the same tissue environment in vivo. Here, the protocol is described in detail, and experimental paradigms to employ MADM for clonal analysis and lineage tracing in the developing cerebral cortex are demonstrated. Importantly, this protocol can be adapted to perform MADM clonal analysis in any murine stem cell niche, as long as the CreERT2 driver is present.

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

A protocol to perform lineage tracing and functional genetic analysis of candidate genes at a single cell level using mosaic analysis with double markers (MADM) is presented. MADM clonal analysis provides a quantitative framework to measure the proliferative behavior, cellular output, and lineage relationship of individual progenitors and their daughter cells.

איתור השושלת וניתוח שבטים בפיתוח קליפת המוח באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...