על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.

1. חומר צמחי
<ol><li>הבחירה של מיני צמחים</li>
	<li>השתמש המין צמח ילידי החלבון של עניין, דהיינו, אחד אשר מקודד חלבון זה חלבונים אנדוגני, או המייצג המארחת הטבעי של המחלה חלבונים נגיפיים. בנוסף, המין הצמח הנבחר חייב להיות נוטה? בשיטה של שינוי גנטי ארעית. הערה: המחקרים באופן שגרתי להעסיק טבק benthamiana, אשר מייצג מארח טוב עבור TMV, עובר טרנספורמציה ביעילות על ידי טכניקת בתיווך Agrobacterium שינוי גנטי, קרי, agroinfiltration (ראה שלב 3). צמחים benthamiana (ש ע) גם הם מגדלים בקלות, יש עלים גדולים, מחוסן בקלות על-ידי Agrobacterium ומותאמים בקלות נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.</li>
	<li>
צימוח
	<ol>
<li>צמח benthamiana (ש ע) זרעים באדמה רטובה-צפיפות גבוהה. לשמור אותם בתוך תא בסביבה מבוקרת הלעפה תרוטרפמט 20-25 מתחת לגיל 16 h של אור ~ 75 µmol פוטונים ז-2 s-1 ו- 8 שעות החושך. לאחר הקוטר של euphyll מגיע ל- 0.5 ס מ, בזהירות להעביר את השתילים סירים גדולים והמשך הצמיחה בבית הבליעה אותה תחת באותם התנאים.</li>
		<li>לשמור על הצמחים עד שהם גדלים לשלב 4-8-עלה תוך 4 שבועות כאשר העלים הגדולים הם 4-6 ס מ קוטר; בשלב זה, הם יכולים לשמש עבור agroinfiltration (ראה שלב 3). הערה: חשוב, אף פעם לא השתמש הצמחים אם הם החלו פרח, כי בשלב התפתחותי זה, הארכיטקטורה עלה משתנה לעיתים קרובות24,25, שמוביל לפעמים תוצאות לא עקביות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הביטוי וקטור בנייה
<ol><li>
בחירה של מערכת ביטוי
	<ol>
<li>לבחור את הביטוי מערכת, קרי, וקטורים ו וקטור משלוח השיטה, המיטביות עבור ביטוי של החלבון עניין במין הצמח למד. הערה: לעיתים, כזה שילובים מסוימים של מיני נבדק חלבון/צמחים עשויים לדרוש וקטורים ספציפיים, וקטור שיטת מסירה עבור הביטוי מיטביים ותפקוד של החלבון עניין. לצמחים dicotyledonous ביותר, עם זאת, בחר פלסמידים בינאריים כמו הביטוי וקטורים ו agroinfiltration כמערכת משלוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תיוג פלורסנט חלבון
	<ol>
<li>Fluorescently לתייג כל חלבון ביטוי לניתוח של הפצה subcellular22, לרבות משטרת לוקליזציה. הערה: מעסיקים חלבונים autofluorescent, כגון CFP ו- DsRed2, כמו תגיות. תג החלבון שנבדקו עם CFP, coexpress זה עם DsRed2 חינם. פונקציות CFP כתג והן בתור מולקולה לא קשור וירוס מטענים. DsRed2 פונקציות כדי לכייל את היעילות הכוללת של הביטוי ארעי, ובגלל זה תא-אוטונומי, כדי לזהות את התא טרנספורמציה בתחילה; פונקציה זו האחרון חשוב בעת הערכת תנועה לתא של חלבונים שנבדקו שעשויות להיות הלא-תא-אוטונומי. עבור coexpression עם הסמן משטרת PDCB1, אשר גם הוא התא-אוטונומי, לתייג את החלבון שנבדקו עם CFP, PDCB1 עם DsRed2.</li>
		<li>כלל אצבע, הפתיל תג autofluorescent carboxyl-הסופית של החלבון ביטוי. עם זאת, אם המוצגים מתויג באורך מלא חלבונים נבדק נחשף Pd מיקוד, העברת התג אמינו-הסופית של החלבון.</li>
		<li>לשכפל את רצפי קידוד של החלבונים להיבדק לתוך וקטור הביטוי צמח מתאים. הערה: ישנם רבים וקטורים הביטוי צמח שונות המאפשרות תיוג פלורסנט. אנו משתמשים סדרה של קדם-פסיכומטרי פלסמידים26 או חלק שלהם נגזרים27,28, אשר מתאימים עבור שכפול של הרצף של עניין ישירות מסגרת עם התגים autofluorescent המוצע (ראה שלב 2.2.1) בשני אמינו- ו carboxyl-מסוף כיוונים.</li>
		<li>להעביר קלטת ביטוי לכל וקטור Agrobacterium בינארי. הערה: למרות בונה מבוסס-קדם-פסיכומטרי מתאימים למשלוח biolistic ישירה לרקמות הצמח, agroinfiltration, אשר היא השיטה השינוי המומלץ כאן (ראה שלב 3), מחייב הקלטת ביטוי כדי להיות ממוקם בין T-DNA גבולותיה של קובץ בינארי וקטור29. הערה: כל כיווני קדם-פסיכומטרי נועדו לאפשר העברת כזו26,30 וקטור בינארי ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים pPZP-RCS2 על-ידי צעד אחר צעד שיבוט באמצעות חיתוך נדיר nucleases AscI-PpoI, -SceI,. CeuI, פאי-PspI ו- PI-TliI 26. חוקרים שמעדיפים לנצל שיבוט recombinatorial, למשל, באמצעות אתרי heterologous לקס 31, יכול להעסיק קדם-פסיכומטרי וקטור משתנים26,27.</li>
		<li>עבור coexpression, העברת קלטות ביטוי הן, למשל, נבדק חלבון-CFP, DsRed2 או חלבון שנבדקו-CFP, PDCB1-DsRed2 (ראה צעד 2.1), כדי הווקטור בינארי זהה pPZP-RCS2. הערה: לחלופין, תרבויות Agrobacterium מחסה מבנים בינאריים בודדים ניתן לערבב ביחד חדירה לתוך benthamiana ש (ראה צעד 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
להוסיף 1 µg של פלסמיד pPZP-RCS2 מבוססי מתרבות 2.2.5 ל- 100 µL שלב של תאים המוסמכים של זן Agrobacterium tumefaciens EHA105 או GV3101 מוכנים כמו שמתואר32, דגירה על קרח למשך 30 דקות, הקפאה של חנקן נוזלי עבור 1 דקות, ואני דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
	<ol>
<li>לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מדיום ליברות (טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L ו- 10 גרם/L NaCl) לתערובת תא המוסמכת, דגירה ב 28 ° C עבור 2 ה ספין למטה התאים ב g × 3,000 עבור 1 דקות, מחדש להשעות אותם ב- 0.2 מ ל LB , לוח אותם על אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאים (למשל, spectinomycin 100 מ ג/ליטר ו- 50 מ"ג/ליטר ריפאמפיצין ל26,pPZP-RSC2 מבוססי וקטורים30). לגדול-28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עד מושבות בודדות גלויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף ואת לוחית רישוי מספר מושבות בודדות על צלחת אגר טריים ליברות (ראה צעד 3.1), לגדול ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ולא לקחת כמות קטנה של חיידקים לניתוח על ידי המושבה PCR33 לאשר הנוכחות של המבנה בינארי ספציפי.</li>
	<li>
לגדול כל המושבה Agrobacterium עם הבונה עניין בן לילה ב 28 ° C ב- 5 מ ל LB בינוני בתוספת אנטיביוטיקה המתאימים (ראה שלב 3.1.1). Centrifuge התאים ב 3,000 × g, וכן מחדש להשעות אותם כדי OD600= 0.5 במאגר agroinfiltration (10 מ"מ MgCl2, 10 מ מ MES (pH 5.6), 150 acetosyringone מיקרומטר). תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר.
	<ol>
<li>אם משתמש תערובת של פלסמידים בינאריים ולא של פלסמיד ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים יחיד עבור חלבון coexpression, מערבבים את תרביות תאים המתאימים ביחס 1:1 v/v לפני חדירה. ואז דגירה התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טען את inoculum לתוך מזרק פלסטיק 1 מ"ל ואת העיתונות שהצינור של המזרק (ללא מחט) נגד האפידרמיס (abaxial) נמוך של בוגרים לגמרי benthamiana ש עלים. חכה העלה עם אצבע בכפפה34,פניה adaxial35.
	<ol>
<li>מציגים את Agrobacterium חדירה בינוני על ידי הזרקה איטית. מובהקות סטטיסטית, לחדור מספר עלים על כל צמח. הערה: שימו לב כי העלים העתיקים משמשים לא כפי שהם לא תשואה רמות הביטוי עקבית.</li>
		<li>לחסן כל העלים בתוך באתרו. לשמור על המפעל הסתנן עד תצפית כפי שמתואר בשלב 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>השימוש להב לחתוך כל עלה לחלקים בין הורידים 24-48 שעות לאחר החדירה, (תלוי היעילות של הביטוי ארעית של החלבון נבדק ספציפי); הגודל של כל פרוסה רקמות צריך להיות כזה כי הפרוסה מכוסה לגמרי על ידי הזכוכית המכסה (22 מ"מ x 40 מ"מ) המשמש מיקרוסקופ.</li>
	<li>המקום הפרוסות עלה על האובייקט שקופית עם פני העלים abaxial פונה כלפי מעלה, הניחו טיפת מים על הפרוסה עלה, לכסות את זה עם כיסוי זכוכית. לשתק את הזכוכית המכסה עם חתיכות קטנות של נייר דבק בכל צד.</li>
	<li>
להתבונן הרקמות agroinfiltrated תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ולהקליט את התמונות המתקבלות.
	<ol>
<li>תחילה, השתמש בעדשה המטרה X 10 כדי לזהות תאים עם האות, ולאחר מכן להשתמש 63 x עדשה המטרה עבור תצפיות מפורט יותר.</li>
		<li>שימוש 458 גל nm מ יון ללייזר לגרות CFP, 543 nm כדי לעורר DsRed2. שומרים על כל הגדרות עבור ייבוא תמונות, קרי, לייזר בעוצמה והגדרות האופטיקה צינור (PMT), בין ניסויים. בממוצע, בדוק 100-120 תאים עבור כל תנאי הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זיהוי של PLS
<ol><li>לאבחן הלוקליזציה של החלבון נבדק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (סעיף 4). בדוק אם החלבון שנבדקו יש את תבנית punctate היקפי אופיינית25,36,37,38,39,40,41 colocalizes עם הסמן משטרת PDCB123. אפשרות זו מציינת כי החלבון שנבדקו מכילים קרוב לוודאי רצפי PLS.</li>
	<li>לאחר אישור לפעילות PLS נבדק חלבון, בהדרגה לסעף את מסגרת קריאה פתוחה (ORF) (מספר גישה genbank BAF93925.1) שברים קטנים יותר, autofluorescently, (למשל, CFP,) לתייג כל אחד מהם, ולנתח שלהם לוקליזציה subcellular כפי שמתואר בשלב 4. בתחילה, בגודל של 100 שאריות חומצה אמינית עבור כל שבר המתפרשות מומלץ.</li>
	<li>בהמשך לסעף השברים קטום אשר הפעילות PLS לבדוק לוקליזציה subcellular שלהם כפי שמתואר בשלב 4 עד השבר הקטן ביותר זה עדיין רגישה לתחנת משטרה, כלומר מספיקה להעביר את המטען תג autofluorescent לתחנת משטרה, מזוהה. קטע זה יש להניח לייצג את רצף PLS.</li>
	<li>מחיקת ביסקוויטים בשם החלבון שנבדקו באורך מלא, קרי נתיך את החלק הנותר של החלבון מבחן ללא PLS בשם autofluorescent תג, לקבוע לוקליזציה subcellular של החלבון המוטנטי וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 4. אם זו מוטציה בחלבון חסר ביסקוויטים בשם נכשל להתאים לשפה לתחנת משטרה, יציין כי מזוהה PLS אינה רק מספיק (ראה צעד 5.3), אבל גם הכרחי עבור הובלה Pd של החלבון שנבדקו.</li>
	<li>Agroinfiltrate העלים עם תערובת של תרבויות Agrobacterium מסתירים את הביטוי לבנות עבור PLS מתויג CFP ו DsRed2 חינם (ראה צעד 3.3). להתבונן הסתנן רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה המטרה של 10 x באמצעות אותן הגדרות כמו שלב 4.3.</li>
	<li>ציון התאים מכילים אותות CFP והן DsRed2 כתאי הסתנן בתחילה, ולא את נספח תנועה ניקוד התאים הסמוכים שהכיל רק האות CFP כמו אלה. הערה: שלב זה בוחן ביסקוויטים מזוהה בשל יכולתו-לתא התנועה פוטנציאליים; זה בגלל חלבונים רבים המטרה Pd (כולל רוב לשתול MPs ויראלי) גם לעבור Pd לתאים שכנים. הריכוז של Agrobacterium המשמש עבור הסתננות תלוי היעילות ביטוי של מבנים שונים בהתאמה. עבור agroinfiltration, הקפד להשתמש דילול תרבות תא מבטיח (i) טרנספורמציה של תאים בודדים, עוזב את התאים הסמוכים untransformed, (ii) משיגה יעילות דומה לביטוי. לדוגמה, הניסויים שלנו לנצל OD600 של 0.01 ו 0.005 עבור ביטוי מתויג CFP PLS חופשי DsRed2, בהתאמה.</li>
</ol>6. זיהוי של מפתח PLS שאריות באמצעות סריקה אלנין42
<ol><li>השתמש פרוטוקולים סטנדרטיים PCR כדי להגביר ביסקוויטים קידוד רצף העסקת זוג תחל עוצבו כך שיכילו את המוטציה הרצוי, קרי, החלפה של השאריות חומצת אמינו היעד עם אלנין, סביב האזור המרכזי של כל פריימר כמתואר 21. לבצע פריימר עיצוב, ערכת מוטגנזה לשימוש מוטגנזה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לטהר את המוצרים PCR הנוצרת באמצעות כל ערכת טיהור DNA סטנדרטי, ולעכל אותם ב 37 ° C עם DpnI לחסל את ההורים (כלומר, ללא-מוטציה) מפוגל ו hemimethylated ה-DNA. יירגעו זה 5 דקות בטמפרטורת החדר (לא על הקרח). ואז להפוך את התערובת ישירות לתוך תאים המוסמכת e. coli 43וזהה מושבות עם מוטציה המבנה הרצוי כפי שמתואר בשלב 3.2.</li>
	<li>להציג את בונה מוטציה לתוך הווקטור בינארי כפי שמתואר בשלב 2.2.4 לבצע agroinfiltration כפי שמתואר בשלב 3, להעריך Pd מיקוד כפי שמתואר ב 4 שלבים ו- 5.1.</li>
</ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ארעית של החלבונים פיוז'ן שנבדקו. שימו לב כי הביטוי ארעי בתיווך Agrobacterium יוצר נתונים בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן, קרי, מספר ימים, לעומת הנדרש לייצור של הצמחים הטרנסגניים משמש לעתים קרובות מחקרים דומים15חודשים.
Coexpression של החלבון עניין עם סמנים לוקליזציה subcellular, למשל, PDCB1 או DsRed2 חינם, בדרך כלל מבוצעת בין וקטור ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים. אולם, אם העברת קלטות ביטוי מספר לתוך וקטור יחידה הוא בעייתי מבחינה טכנית, coexpression יכול גם להתבצע על ידי העברת כל קלטת לתוך מבנה בינארי נפרד ושילוב כרכים המקבילה של תרבויות נוזלי זני Agrobacterium שנוצר עבור agroinfiltration. כי פרוטוקול זה מנצל ביטוי ארעי, הווקטור בינארי צריך נושא הבחירה סמני לטרנספורמציה יציב, למרות נוכחותם אינה פוגעת היעילות הביטוי.
פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור ביטוי חלבון המטרה ב- benthamiana (ש ע); עם זאת, זה יכול לשמש מינים אחרים של הצמח, כולל תודרנית45,46, לבצע שינוי גנטי על ידי Agrobacterium. עבור מינים אחרים של הצמח, או אחרת, אם פרוטוקול זה ניתן להתאים לנצל את משלוח biolistic41 לביטוי ארעי ישירות מוקטורים מבוסס-קדם-פסיכומטרי, ולהימנע מהצורך להעביר הקלטות ביטוי וקטורים בינארי.
איזה נקודה קריטית של פרוטוקול זה הוא מצב פיזיולוגי והפיתוחים עקבית של חומר צמחי. באופן ספציפי, כל הצמחים להיות בריאים לאורך הניסוי כולו, ועל, עבור agroinfiltration, הצמחים benthamiana (ש ע) חייב להיות פחות מ- 4-שבועות וישן בשלב 4-8-עלה עם העלה הגדול להיות 4-6 ס מ קוטר. אם הצמחים הם צעירים מדי, ההשפעות של agroinfiltration יהיה חמור מדי, מתנגש עם ביטוי ולוקליזציה של החלבונים מתויגות. מצד שני, הצמחים בוגרים לעיתים קרובות התערוכה ארכיטקטורה משתנה של משטרת24,25, גם להשפיע על מרקם של דפוסי פילוח Pd.
עדיין, עקב שינוי בתנאים פיזיולוגיים של הצמח בכללותו, ואת התאים טרנספורמציה בפרט, היעילות של משטרת מיקוד ניסוי עשוי במידת מה להשתנות. לכן חשוב לנתח מספר גדול יחסית של תאים (> 100) לכל ניסוי, ולבצע לפחות שלושה משכפל הביולוגי של כל ניסוי. בדרך כלל, אנו רואים קטע שנבדקו יכיל Pd מיקוד פעילות, אם זה מוצגים Pd לוקליזציה לפחות 70% של תאים טרנספורמציה. הבדלי פילוח היעילות של כל קטע, למשל, אחוז תאי טרנספורמציה מציג, התבנית הצטברות punctate ספציפיים Pd Pd צריך להיות מנותח על ידי הסטודנט מבחן t, p-ערכים < 0.05-0.01, המייצגים הסתברות סטטיסטית של יותר מ 95-99%.
נושא חשוב נוסף הוא המיקום של המטען/התגית פלורסנט בתוך המולקולה פיוז'ן. כמה חלבונים, ממוקדות Pd גם לשייך תוך-פלזמית (ER), עמותה זו עשוי לדרוש את רצף אמינו-מסוף בלא הפרעה. במקרים אלה, אמינו-מסוף fusions, שבו הוא carboxyl-הסופית של השבר חלבון עניין דבוקה אמינו-הסופית של התג פלורסנט, למשל, CFP או DsRed2, אמור לשמש. ניתן לשנות את מיקום ברירת המחדל של התג במקרים הבאים. (i) אם fusions אמינו-מסוף אינם שמישים – כלומר, הם אינם מפגינים דפוסי לוקליזציה subcellular משמעותית, באים לידי ביטוי לקוי או אינם מפיקים מספיק עבור זיהוי אמין – ניאון האות ואם החלבון עניין אינה מכיל רצפים אמינו-מסוף האות או carboxyl-מסוף fusions שבו אמינו-הסופית של השבר שנבדקו היא דבוקה carboxyl-הסופית של התג, הם שכדאי לנסות. (ii) fusions carboxyl-מסוף צריך לשמש גם אם החלבון עניין מכילים רצפי אות ב carboxyl-לתחנתו הסופית. (iii) אם החלבון של עניין יש שני אותות אמינו - ו carboxyl-מסוף, כגון אלה שנמצאו המעוגנת GPI חלבונים, או אם הוא מכיל של פפטיד אמינו-מסוף האות עדיין מיזוגה אמינו-מסוף אינו שמיש, התג יוצבו באופן פנימי ( או במורד הזרם של האות אמינו-מסוף במעלה הזרם של האות carboxyl-terminal). כמה הליכים שימושי עבור תיוג פלורסנט פנימי של חלבונים מתוארים שלנו47,מוקדמת יותר פרסומים48.
בזמן הנוכחי, יש אין רצף קונצנזוס ידוע עבור PLS. בתור שכזה (בשלב 5.2) אנו ממליצים, בתחילה סוגייה משפטית החלבון לתוך רציף ~שברי שאריות באורך 100-200. אלה מכן שניתן יהיה בהדרגה קצר יותר בהתבסס על הפעילות פילוח Pd שנצפו או החוסר בו. אחד צריך להיות מודע אחרים פוטנציאל מיקוד אותות נוכח החלבון (למשל, NLS, אות פפטידים, וכו '). עם זאת, כמו החפיפה פוטנציאלי של רצפים כאלה עם רצפי PLS אינו ידוע, אזורי חלבונים אלה ייכללו בניתוח mutational.
עד כה, פרוטוקול זה שימש לזיהוי PLS יחיד מולקולה חלבון21. עם זאת, באופן פוטנציאלי, חלבון יכול להכיל רצף אות אחד או יותר; אכן מרובים NLSs תוארו בחלבונים גרעיני רבים, לרבות גורמי שעתוק גאטה49. לפיכך, בעת ניתוח שברים שונים של החלבון שנבדקו עבור משטרת מיקוד, זה אפשרי כי אחד או יותר קטע כזה יזוהו, המעידים על המצאות של מספר PLSs אשר עשויים לפעול באופן עצמאי או בסינרגיה.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא כי בעקבות agroinfiltration, ויזואליזציה של לוקליזציה subcellular של transiently חלבונים ביטוי של עניין היא מושגת בצורה הטובה ביותר תאים באפידרמיס, בשלב הצמיחה צר יחסית. בעת הצורך, מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי ייצור הטרנסגניים צמחים המבטאים כל אחד החלבונים נבדק ברוב הרקמות שלהם ואת סוגי תאים stably. בנוסף, פרוטוקול זה לא יהיה שימושי עבור מחקרים של MPs ויראלי או חלבונים אחרים ממוקדות Pd לתפקד רק במינים צמחים לא נתונות לשינוי גנטי ארעית.
בעוד אנחנו פיתחנו שיטה זו זיהוי PLS של TMV MP, זה יכול לשמש עבור גילוי PLSs בכל מקום לשתול MPs ויראלי או בחלבונים אנדוגני צמח זה בתרגום כדי Pd, transiently או לצמיתות. יתר על כן, אם בשילוב עם סמנים המתאים לוקליזציה subcellular47, פרוטוקול זה מתאים זיהוי של אחרים לאותות מיקוד בתוך חלבונים עניין בצמחים.

הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).
מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.
כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.
ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.

<table><tbody><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td></tr><tr><td>Zen software for confocal microscope imaging</td><td>Zeiss</td><td>2009 version</td><td>The software should be compatible with the CLSM used</td></tr><tr><td>Quickchange II site-directed mutagenesis kit&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Syringes without needles</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.

הנתונים נציג, בנאמנות להמחיש את התוצאות צפוי מן הפרוטוקולים שתואר ולזהות את TMV MP PLS, המותאמים מ יואן. et al. 21. איור 1A מסכם ראשון המבנים העיקריים לבטא את באורך מלא TMV MP (1-268), TMV MP PLS (הכוללת את שאריות חומצה אמינית קודם 50 של החלבון, 1-50), ו שלה אלנין סריקה V4A נגזרים דבוקה CFP (נוצר כמו שמתואר 2.2 השלבים, 5.2 ו- 6) ואילו איור 1B והשוואה מכמתת לוקליזציה subcellular של חלבונים אלה מתויגות. איור 1C מתארת אופייני היקפיים punctate Pd לוקליזציה הדפוסים שנצפו עבור TMV MP-CFP, עבור TMV MP PLS-CFP גם באשר דה מרקר משטרת coexpressed, PDCB1-DsRed2 (ראה צעד 5.1). איור 2A מדגים Pd פילוח של TMV MP-CFP ועבור TMV MP PLS-CFP והפצה nucleocytoplasmic של coexpressed DeRed2 חינם (ראה צעד 5.1). לבסוף, איור 2B מדגים האובדן של משטרת מיקוד על ידי TMV MP והן TMV MP PLS עם החלפה יחיד אלנין V4A, המציין כי שאריות זה חשוב עבור מבנה PLS או פונקציה; אותו דבר תאים דה מרקר משטרת coexpressed PDCB1. עדיין רגישה לתחנת משטרה (ראה שלב 6).
נתונים אלה מראים כי הליך מושגית, טכנית פשוטה של ייצור שיטתית של שברי חלבון שלהם פיוז'ן לחלבון סמן-מטען autofluorescent, בדיקות על היכולת להתאים לשפה לתחנת משטרה יכול לזהות רצף מינימלי חלבון חיוני ומספיק עבור משטרת מיקוד, קרי, PLS. על פרשנות נכונה של נתונים אלה לוקליזציה, חיוני לבצע ניסויים colocalization עם חלבון Pd ידוע, למשל, PDLP או PDCB בני המשפחה16,23 או אחד של הצמח MPs ויראלי דברים לתחנה44 . ללא ספק, colocalization לא קיימת למען השלמות, לא כל החלבונים P-לוקליזציה עשויות להיות ממוקדות כדי המשטרה אותו, אך מידה סטטיסטית של colocalization לפחות אחד החלבונים סמן Pd הכרחית להגדרת הפעילות PLS.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig1.jpg"> איור 1: זיהוי של TMV MP מסילות בשימוש, קניינים (א) סיכום של בונה CFP-fusion העיקרי המשמש לזיהוי תיבות רצפים, ירוק TMV MP מסילות בשימוש, קניינים TMV MP; CFP, הקופסאות הכחולות; P, יזם; T, שליחות קטלנית. המספרים בצד השמאל מציינים את שאריות חומצה אמינית כלולים כל שבר TMV MP. (B) סיכום של לוקליזציה subcellular של חלבונים פיוז'ן המוצגים ב (א). משטרת לוקליזציה או nucleocytoplasmic לוקליזציה נקבע בהתבסס על הלוקליזציה של הסמנים subcellular המתאימים, PDCB1-DsRed2 ו- DsRed2 חינם, בהתאמה. אחוז תאים מפגין לכל דפוס לוקליזציה מוצג בהתאם הבקיע 100 תאי לביטוי הבונה בשנת 3 ניסויים עצמאית. הנתונים הם לשגיאות תקן זאת אומרת ± (SE). (ג) Pd פילוח של TMV MP-CFP TMV MP PLS-CFP, דה מרקר משטרת PDCB1-DsRed2. CFP שהאותות בכחול; DsRed2 שהאותות בסגול; פלסטידה autofluorescence היה מסונן. התמונות הן מקטעים קונאפוקלית יחיד. גודל ברים = 10 מיקרומטר. DIC, התערבות דיפרנציאלית חדות micrograph. נתון זה ממאמרו של יואן. et al. 21. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55301/55301fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig2.jpg"> איור 2: Pd פילוח של TMV MP, TMV MP PLS שלהם מוטציות לסריקת אלנין- (א) Subcellular לוקליזציה של TMV MP-CFP TMV MP PLS-CFP, דה מרקר nucleocytoplasmic DsRed2. (B) אובדן של משטרת מיקוד היכולת של המוטציות לסריקת אלנין V4A TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP.... משטרת היו דמיינו ידי coexpression של דה מרקר משטרת PDCB1-DsRed2. CFP שהאותות בכחול; DsRed2 שהאותות בסגול; פלסטידה autofluorescence היה מסונן. התמונות הן מקטעים קונאפוקלית יחיד. גודל ברים = 10 מיקרומטר. DIC, התערבות דיפרנציאלית חדות micrograph. נתון זה ממאמרו של יואן. et al. 21. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55301/55301fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Views.  State University of New York. צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd...

Video: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Biology

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The establishment of an auxin gradient is a key event leading to phototropism and gravitropism. Previously, polar auxin transport (PAT) was shown to establish an auxin gradient in different cellular domains of plants. However, Han et al. recently demonstrated that for proper auxin gradient formation, plasmodesmal callose-mediated symplasmic connectivity between the adjacent cells is also a critical factor. In this manuscript, the strategy to elucidate the role of particular genes, which can affect phototropism and gravitropism by altering the symplasmic connectivity through modulating plasmodesmal callose synthesis, is discussed. The first step is to screen aberrant tropic responses from 3-day-old etiolated seedlings of mutants or over-expression lines of a gene along with the wild type. This preliminary screening can lead to the identification of a range of genes functioning in PAT or controlling symplasmic connectivity. The second screening involves the sorting of candidates that show altered tropic responses by affecting symplasmic connectivity. To address such candidates, the movement of a symplasmic tracer and the deposition of plasmodesmal callose were examined. This strategy would be useful to explore new candidate genes that can regulate symplasmic connectivity directly or indirectly during tropic responses and other developmental processes.

This article describes the methods for screening the genes controlling plasmodesmal permeability and hence auxin gradient during tropic response. This includes the measurement of the degree of tropic response in hypocotyl of Arabidopsis thaliana and checking plasmodesmal permeability by 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) loading and finally callose level assessment.

אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

גישה משולבת לזיהוי מיקרופרוטאינים וניתוח רצף

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have proven successful in identifying protein-protein interactions (PPIs). APEX, BioID, and TurboID, a revised version of BioID have some restrictions in addition to being valuable technologies. The recently developed AirID, a novel version of BioID for proximity identification in protein-protein interactions, overcame these restrictions. Previously, AirID has been used in animal models, while the current study demonstrates the use of AirID in plants, and the results confirmed that AirID performs better in plant systems as compared to other PL enzymes such as BioID and TurboID for protein labeling that are proximal to the target proteins. Here is a step-by-step protocol for identifying protein interaction partners using AT4G18020 (APRR2) protein as a model. The methods describe the construction of vector, the transformation of construct through agroinfiltration, biotin transformation, extraction of proteins, and enrichment of biotin-labeled proteins through affinity purification technique. The results conclude that AirID is a novel and ideal enzyme for analyzing PPIs in plants. The method can be applied to study other proteins in plants.

Here, we present a step-by-step protocol for performing the proximity labeling (PL) experiment in cucumber (Cucumis sativus L.) using AT4G18020 (APRR2)-AirID protein as a model. The method describes the construction of a vector, the transformation of a construct through agroinfiltration, biotin infiltration, protein extraction, and purification of biotin-labeled proteins through affinity purification technique.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium and lipids) between the juxtaposed organelles without involving membrane fusion. MCSs are essential for cellular homeostasis, and their functions are ensured by the resident components, which often exist as multimeric protein complexes. MCSs often involve the endoplasmic reticulum (ER), a major site of lipid synthesis and cellular calcium storage, and are particularly important for organelles, such as the mitochondria, which are excluded from the classical vesicular transport pathways. In the last years, MCSs between the ER and mitochondria have been extensively studied, as their functions strongly impact cellular metabolism/bioenergetics. Several proteins have started to be identified at these contact sites, including membrane tethers, calcium channels, and lipid transfer proteins, thus raising the need for new methodologies and technical approaches to study these MCS components. Here, we describe a protocol consisting of combined technical approaches, that include proximity ligation assay (PLA), mitochondria staining, and 3D imaging segmentation, that allows the detection of proteins that are physically close (&gt;40 nm) to each other and that reside on the same membrane at ER-mitochondria MCSs. For instance, we used two ER-anchored lipid transfer proteins, ORP5 and ORP8, which have previously been shown to interact and localize at ER-mitochondria and ER-plasma membrane MCSs. By associating the ORP5-ORP8 PLA with cell imaging software analysis, it was possible to estimate the distance of the ORP5-ORP8 complex from the mitochondrial surface and determine that about 50% of ORP5-ORP8 PLA interaction occurs at ER subdomains in close proximity to mitochondria.

The need for new approaches to study membrane contact sites (MCSs) has grown due to increasing interest in studying these cellular structures and their components. Here, we present a protocol that integrates previously available microscopy technologies to identify and quantify intra-organelle and inter-organelle protein complexes that reside at MCSs.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...