We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט כפי שתואר לעיל 1,6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להשתמש DNA פולימרז באיכות גבוהה עם פריימרים מתאימים כדי להגביר את רצפי הקידוד של בזל, Yda ו MPK6 ותת-לשכפל אותם וקטורי כניסה. מצא את הפרוטוקול המפורט ב -7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את גרסאות שלילי דומיננטי של MPK6 ו Yda (DNmpk6 8 ו DNyda 4, בהתאמה), השתמש פלסמידים כניסת MPK6 ו Yda כתבנית ולהציג את מוטציות נקודתיות לפי שיטה מכוונת mutagenesis באתר 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות את המבנים עבור מבחני חולף טבק, לנהל תקן LR (רקומבינציה attL x ATTR) תגובות (נוהל מפורט ב 7) לשלב בזל לתוך pH35CG 10, DNyda ו DNmpk6 לתוך pXNGW ו pXCGW וקטורים 11, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את פלסמידים כתוצאה ידי עיכול וסדר אנזים. ברגע זהuccessful, להפוך את המבנים בינארי לתוך Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 12 ולגדל אותם על צלחות הבחירה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. </li></ol></li></ol> 2. הכנת פתרון Agrobacterium הסתננות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות Agrobacterium כמה שינו טרי לתוך 10 מ&quot;ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני עם טיפול אנטיביוטי מתאים (gentamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Rifamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, spectinomycin 100 מיקרוגרם / ml עבור pH35CG, pXNGW ו pXCGW בונה; הריכוזים אותו של gentamycin ו Rifamycin עם מיליליטר / מיקרוגרם 50 Kanamycin עבור P19 (לבטא חלבונים נגד השתקה מהונדסת) 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות Agrobacterium שייקר C 28 ° במהירות של 200 סל&quot;ד במשך כ -16 שעות ולאחר מכן למדוד את OD 600 (מוערך ל -1.5 - 1.8) (איור 2 א-ב). ספין למטה התרבויות ב 2500 XG במשך 10 דקות. Re- להשעות ו ווהsh את כדורי תא עם 10 מ&quot;מ של 2 MgCl (הפתרון הסתננות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התרבויות שוב מחדש להשעות את הכדורים עם כמות מתאימה של הפתרון החדיר להגיע OD הסופי 600 = 0.5 (איור 2 ג-ד). לפני שחדר צמחים, לעזוב את תערובות תא בטמפרטורת החדר למשך 1 - 3 שעות. פעולה זו מסייעת לשמור על הומאוסטזיס תא. </li></ol> 3. צמח טבק ליף הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמחי טבק (ניקוטיאנה benthamiana), גדלו 4 - 5 שבועות בן בתא גידול צמחים סטנדרטי (23 ° C עם מחזורים של 16 שעות אור / 8 hr-כהה) 14 להזרקה עלה. הערה: בשלב זה, צמחי טבק בדרך כלל יש 6 עלים (2 גדולים, 2 בינוני, ו -2 קטנים). שני העלים והבינוניים הם האופטימליים ביותר להזרקת עלה (שני הגדולים הם זקנים מדי, בעוד שני הקטנים הם לעתים קרובות מדי צעירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני יום הסתננות, להשקות את tobacצמחי שיתוף כדי להרוות את האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום חדירה, טרום דגירה הצמחים בחושך במשך 1 - שעות 3. שלב זה מאפשר הפיוניות באפידרמיס לפתוח נרחב, אשר מאוד מקל על Agrobacterium כאשר חודר לתוך התאים באפידרמיס עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטות צבע שכותרתו עם תאריכים, דגל העלים כדי להיות שחדר. סמן את האזורים המיועדים הסתננו עם לנוכל עבה שחור (אופציונלי; האזורים הסתננו גלויים לאחר להידבק.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שוות של מחדש ההשעיה Agrobacterium ומערבבים אותם בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ידי מתערבל עדין (איור 2E). הערה: במקרה שלנו, ערבבנו 1 מ&quot;ל של P19 עם 1 מ&quot;ל של CFP-בזל, 1 מ&quot;ל של DNyda-nYFP ו 1 מ&quot;ל של DNmpk-cYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתהליך של חדירה, למלא מזרק מחטים 3 מ&quot;ל עם תערובת חדירת (1 - 2 מ&quot;ל) ולדחוף לתוך הצד התחתון (abaxial) של העלה טבק (איור 2F). בעוד חדירה, זה מועילאחד להשתמש ביד לדחוף מצד שני לתמוך בצד העליון בעדינות (adaxial, מפני הכוח לדחוף). הערה: לאחר התערובת החדירה מוזרקת בהצלחה, האזורים הנגועים יהפכו קל לזיהוי באפידרמיס. עם זאת, החדירה עלולה להיכשל בשל הזרקה קשה (ניזק לרקמות) או לדחוף מספיק (אין חדירה נוזלית). עבור כל בדיקה, אנו מציעים לפחות שתי זריקות בשני עלים עצמאיים (מצמחים שונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצמחים הנגועים בחזרה לתוך תא צמיחה. באופן כללי, ביטויי חלבון ניתנים לזיהוי לאחר החדירה הבאה 48 שעות. </li></ol> 4. הדמיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 חדירת שעות שלאחר, להשתמש מחורר שיחתוך דיסק עלה מאזור מוזרק (בדרך כלל 3 - 4 דיסקים / שטח יכול להיות מיוצר) (איור 2G). להשתמש בפינצטה כדי להעביר את הדיסקים עלה בעדינות לשקופית (הצד abaxial כלפי מעלה) ואת הר אותם עם טיפות מים. הימנע לחיצה מדי הרד על להחליק את המכסה כי סחט / תאים פגומים לא להראות טוב תחת מיקרוסקופ confocal (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמית confocal, לסרוק את הדגימות הרכובות על מיקרוסקופ מתחם עלית ניאון כדי לבדוק את רמות הביטוי. הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, התאים המציגים רמות ביטוי ביניים מיוצגים הטוב ביותר תחת מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם עדשת 40X (NA 1.3) על מיקרוסקופ confocal. התאם את השקופית למיקום הרצוי כך תאי מבטאי רמות בינוניות של חלבון פלורסנט להישאר במרכז. ספקטרום עירור / פליטה עבור CFP ו YFP הם 458 ננומטר / 480 - 500 ננומטר ו 514 ננומטר / 520 - 540 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;החי&quot; כדי לצפות בתצוגה מקדימה של תמונות ולאחר מכן להתאים עוצמת ליזר ורווח חכם עבור היחס עוצם / רעש קרינה המאוזן ביותר. כדי לשפר את איכות הדמיה, להגדיל פיקסלים סריקה ו / או מסגרת / קו ממוצע. לבסוף, להתאים את כפתור המיקוד כדי Reach המטוס החציוני מוקדים ולחץ על &quot;לכיד&quot; לקחת את התמונה. הערה: CFP ותמונות YFP ניתן ללכוד ברצף או בו זמנית על ידי סימון או ביטול האפשרות של מצב סריקה &quot;עוקב&quot;, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הקרנת Z היא רצויה עבור התצוגה המעמיקה של התאים, בחר במצב הדמיה &quot;xyz&quot;, להגדיר את עומק טווח הסריקה (10 - 15 מיקרומטר) ולאסוף את התמונות מהחלק העליון לחלק התחתון של תא המטרה . לקמפל את התמונות המתקבלות עם התוכנה ליקה על ידי לחיצה ימנית על קובץ התמונה כדי לבחור &quot;שינוי שם&quot; ותמונות יצוא כקבצי .tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 30 - 40 תאים לניתוח כימות. </li></ol> עיבוד תמונה 5. וניתוח כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת פיג&#39;י (http://fiji.sc/Fiji) כדי לעבד תמונות ולערוך כימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרפים עוצמת הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש טוב יותר אם ביטוי CFP / YFP הואמפוזרים באופן אחיד, להשתמש פיג&#39;י להפגין את עוצמת האות של CFP ו YFP לאורך הפריפריה התא. כדי להשיג זאת, הראשונה להשיק פיג&#39;י ולאחר מכן בחר &quot;קובץ&quot; ו &quot;פתח&quot; כדי להתחיל את התמונה. לחץ על &quot;קו&quot; בתפריט הכלי ובחר &quot;קו מקוטע&quot; על ידי לחיצה ימנית. החלט האזור של עניין ולשרטט קו לאורך בפריפריה התא להתחקות אחר CFP או האות YFP (איור 3A-C). הערה: פיג&#39;י מודד את ערך עוצמת קרינה המוחלט לאורך הקווים המפולחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התפריט הנפתח &quot;נתח&quot; &quot;פרופיל מגרש&quot; כדי ליצור גרף עם ערכי מיקום ועצמה המייצגים את הרמות של CFP / YFP לאורך הקו המפולח. אם תרצה, לשכפל את ערכי העצמה (על ידי בחירה בתפריט &quot;העתק&quot;) לתוך Excel או תוכנה גרפית אחרת כדי ליצור גרפים עוצמים דומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תואר קוטביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כ 20 represenתאי tative מן 3 ניסויים לשכפל להעריך את מידת הקוטביות של CFP ו YFP בתאי טבק. חשב את מידת הקוטביות מבוססת על היחס בין עוצמת קרינה הגבוהה (מוגדר H) על עוצמת הקרינה הנמוכה (מוגדר L). הערה: שיטת כימות מוסברת באיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את ערכי H ו- L, למתוח קו מקוטע לאורך האזור המעוניין בשולי התא (כמתואר לעיל), לחץ על &quot;נתח&quot; מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר &quot;מדוד&quot;. כאשר &quot;תוצאות&quot; חלון צץ, להשתמש &quot;Mean&quot; ערכים לבצע כימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן התאים המציגים ביטוי אחיד יחסית של CFP ו YFP, למשל, CFP-בזל (איור 3 א) או YFP השלים מתוך שיתוף-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ב) יש לקבל את ערכי H ו- L על ידי מדידת שני אקראי שנבחרו מגזרים היקפיים עם אורך שווה. </li> &lt;li&gt; מן התאים המציגים הצטברות הקוטב ברור של חלבוני ניאון, במקרה זה, את שיתוף ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ג), לאסוף את ערכי H מאזורי הפריפריה עם אותות הקרינה מועשר ואת Ls מהאזורים עם נמוכה / לא הצטברות קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת היחסים כתוצאה של H / L מ -20 תאים יחד ולבדוק עבור התפלגות נורמלית. חשב את ערכי p על ידי מבחן t של סטודנט (עבור התפלגות נורמלית) או מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (KS) (לחלוקה הלא-נורמלי). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li><li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations.">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li><li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division.">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li><li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway(R)+TOPO+vector+system.">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4 (2008).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther,+inflorescence,+and+embryo+development.">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo.">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li><li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis.">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li><li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport.">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li><li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers.">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways.">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כללי גלישה ו שינויים אפשריים של מערכת הביטוי החולפת טבק התמר אות: התבטאות יתר של חלבון פלואורסצנטי (FP) -tagged חלבונים באפידרמיס הטבק שמש בהצלחה לבדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון subcellular בתאי צמח. עם זאת, לומד הפצת איתות דינמית של מורכבות חלבון planta הוא נושא מאתגר בשל הקשרי subcellular מסובכים, אינטראקציה בין חלבונים חולפים ואירועים הולכים אותות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו נצלנו את מערכת BiFC לבחון אירועי איתות MAPK. על ידי שיתוף להביע Yda-nYFP ו MPK6-cYFP, אות YFP התאושש ציינה כי הפעלת ממסר איתות MAPK עלולה להתרחש בכל קרום הפלזמה. זה יהיה אידיאלי לשתף-Express fluorescently מתויג Yda ו MPK6 ארבידופסיס ולבחון את האיתות MAPK דינמי in vivo. עם זאת, GEnerating צמחי מהונדס הוא גוזל זמן, במיוחד כאשר אחד או יותר בונה היא רצויה. ביטוי חולף חלבון בתאי טבק יכול להיות מבחן ראשוני ומהיר על מנת לתת הביטוי vivo ב ארבידופסיס או צמחים אחרים. היתרון השני שמערכת הביטוי החולפת הטבק מציעה, אבל לא יכולה בקלות להיות מושגת על ידי יצירת צמחים מהונדסים, הוא כי עד חלבוני היתוך 4 או 5 יכולים להיות שותף הביעו בו זמניים נבדקו על ידי מיקרוסקופיה confocal כאשר השילוב הוא בר השגה. שימוש בתאי האפידרמיס טבק לחקור איתות MAPK בתאי צמח ניתן ליישם בהמשך מסלולי איתות אחרים ובתנאים סביבתיים שונים. לדוגמה, היה האינטראקציה של Yda-MAPK לשנות עוצמת או מיקומו כאשר התא להביע מטופל עם H 2 O המקומית 2 יישום (גירוי איתות MAPK)? יכולים להיות מתוכננים במהירות ובצעו מבחנים אלו לשם דיון המפרטשאלות ific. חברי מרובים קיימים בכל רובד של קלטות MAPK (3 - 4 שורות בכלל), אבל איך הספציפיות איתות מושגת בצמחים או מערכות אחרות אינו ידוע ברובם. על ידי ביצוע שילובים שונים של MAPKKKs עם MAPKKs, או MAPKKs עם MAPKs, מערכת ביטוי הטבק החולפת מאפשרת ניתוח יחסית בקנה מידה הגדולה של אינטראקציה בין חלבונים רק לא, אלא גם את הארגון המרחבי של זרימת האיתות בתאי צמח. Co-ביטוי אישית BiFC Assay לחקירות קיטוב חלבון: אחת ארוכת שנים השאלה הבסיסית בביולוגיה של התא היא איך מסלולי איתות אוניברסלי, למשל, MAPKs, להשיג הספציפיות שלהם בשלב התפתחותי מסוים או בתנאים סביבתיים מסוימים. Co-המבטאת את החלבון בזל הקוטבי עם רכיבי BiFC של Yda ו MPK6 בתאי טבק אפשרה לנו להפגין שהאינטראקציה ואיתות Yda-MAPK מחדש ד מרחביתistributed על ידי הנוכחות של בזל, לחלבונים קוטביים ספציפיים במהלך הפיוניות ACD. לכן, את הספציפיות איתות Yda-MAPK יכולה להיות מושגת על ידי אינטראקציה עם בזל לקדם הקוטביות בתא וחילוק סימטרית. למרות זאת הוא לא תופעה אוניברסלית, לא מעט חלבונים נמצאו שיחולקו באופן לא אחיד בתאי צמח, למשל, 15 ROPs GTPase הקטן, חלבוני PIN אוקסין effluxer 16 והרגולטורים שלהם 17, מובילי בורון 18 וכמה חלבונים לא-מוכרים (OCTOPUS 19 , POLAR 20, ו -21 BRX). פרוטוקול זה לא נועד לחפש השותפים הגנטיים או פיסיים מסלול קיטוב חלבון מסוים, אבל יהיה שימושי סביר לבדוק האם חלבוני האינטראקציה עם ROPs, סיכות או אחרים עלולים להיוצר מתחם קוטבי בתאי צמח. עם זאת, כאשר מנסים לדמות אירוע קיטוב באמצעות תאי טבק, אחד צריך לזכור כי סיבוכיםעלול להתרחש המבחנים. לדוגמא, במקרה קיטוב ארבידופסיס לא ניתן לחזור בדיוק תאי טבק, בפרט כאשר רכיבים נוספים נדרשים ממה ניתן לאכלס assay. מולקולות לא ידועות כמה נגזר רקע הטבק, לא בהכרח החלבונים בבחינה, עשויות להיות מעורבות בזירוז אירוע קיטוב. לכן, זה הכרחי כדי להגדיר ניסויי שליטה קפדנים בטבק וכדי לאמת את הנתונים ארבידופסיס או צמחים אחרים. גורמי מפתח להצליח ניסויים: ראשית, ירקרקים וצמחי טבק בריאים אמורים לשמש. מאז כימות המנתח צריך למאגר נתונים מתאים שונים, חשוב להשתמש משגשגת צמחי טבק עם תאים בריאים באופן עקבי. שנית, התאים המבטאים רמות החלבון בינוני צריך לשמש הדמיה confocal. רמות ביטוי נמוכות עלולות לא לספק חלבונים מספיק עבור assay ואני ביטוי הרוויevels היה להסוות את אפקט הקיטוב / טרנסלוקציה.

חלבוני אינטראקציה בתוך מתחמי רשת טופס היררכיים מסובכים כי לשחק תפקיד מרכזי כמעט כל תהליכים ביולוגיים המתרחשים בסביבת הסלולר צפויה. עם זאת, מן התפתחות צמח לתגובות צמיחה, חל חוסר כלים נוחים שיכול לא רק במהירות אלא גם ביעילות לזהות ולנטר איתות אירועים אלה דינמיים ברמת subcellular. מערכת ביטוי חלבון החולפת באפידרמיס עלה טבק מושכת יתרונות המאפשר הדמית חלבוני ניאון בתאים חיים. מערכת זו מספקת למחצה בתנאי vivo המאפשרים שלאחר translational שינוי חלבון ובדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון. על ידי בחינת אות YFP השלימה את השלמת פלורסנט bimolecular (BiFC) assay מודיע האפשרות של אינטראקציה בין חלבונים בתאי צמח. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל, שמרים ושתיים היברידיים (Y2H) ושיתוף-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC גם מספק אמצעי רב עוצמה של ביטוי חזותי תאים שבו אינטראקציות בין חלבונים עלולה להתרחש ברמה subcellular. בגלל חלוקת התא סימטרית (ACD) שומרת גזע אוכלוסיית תאים תוך יצירת סוגי תאים חדשים לייצור רקמות / איברים, זה מנגנון הכרחי לקידום רב-תאיות איקריוטיים. פיתוח הפיוניות ארבידופסיס נוצל בעבר כמערכת מודל לחקר ACD בצמחים. התא המבשר, התא האם meristemoid, מהחלק סימטרי לייצר שני לתאי בת אחרים, meristemoid (עובר גזע חטיבות דמויי תאים לפני הסיום לתוך זוג התאים שומרים) ו תא קרקע השושלת הפיוניות (SLGC) (עשוי להתחלק להתמיין תא מדרכה), בהתאמה (איור 1). בשנת הפיוניות ACD, שבירת חלבון הרומן של אסימטריה בשושלת הפיוניות (בזל) מקוטבת premitotically לנהוג סימטריות חלוקות, אשר incאסימטריה גופנית lude ואסימטריה תא גורל 1. אשד MAPK המורכב של תודה MAPKKK ואת MAPKs, MPK3 ו -6 הנו מכשיר מרכזי דפוסי חלוקת הפיוניות ואימוץ גורל 2,3, 4,5. לאחרונה, ג&#39;אנג et al. קשר בין בזל חלבון קוטביות אל מסלול איתות Yda-MAPK ארבידופסיס הפיוניות 6 ACD. מסלול יודה-MAPK הקנונית, דרך MPK3 / 6, phosphorylates בזל ומפעיל הקיטוב שלו. פונקציות בזל פוספורילציה כמו פיגום ומגייסת יודה (Yda) ו MPK3 / 6 להקים קומפלקס חלבון ולרכז את איתות לעבר התא בקליפת 6. קיטוב של רכיבים MAPK ואת לולאת המשוב החיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK מייצג מנגנון חדשני עבור קיטוב חלבון בתאי הצמח. מקומית איתות MAPK מועשרת שאמורות להיות קשורים קשר הדוק בידול גורל תא ב הפיוניות ACD 6 (איור 1). אחד kנתוני הניסוי EY שתמכו מודל זה בא מן מבחני טבק המצביעים על חלוקה מחדש של המרחב MAPKs המושרה על ידי ביטוי של בזל 6. באופן כללי, זה לא קל לעקוב אחר המקום שבו איתות MAPK מתרחשת משום מולקולות MAPK ולרוב מצאו מקום בתוך התא. במחקר זה, השתמשנו במערכת מפוצלת YFP לדמיין את האינטראקציה בין קינאז במעלה או במורד הזרם אלה להציע שבו ממסר איתות מתרחשת. בנוסף, אנו הרחבנו את השימוש במערכת BiFC ידי להביע שיתוף חלבון שלישי (CFP-tagged) עם זוג פיצול YFP (המרמז על אינטראקציה בין חלבונים) כדי לחזות האם וכיצד YFP השלים יכול להיות מווסת מרחבית על ידי השיתוף הביע חלבון CFP. בעשותם כך, הראינו כי שיתוף ביטוי של CFP-בזל המושרה מחדש המרחבי של אינטראקציות בין Yda ו MPK6, מן חלוקה שווה דפוסים מקוטב על קליפת התא של טבק epidermתאי al. מערכת זו ולכן יש פוטנציאל להתפתח לניטור אירועים איתות דינמי בתאי הצמח בתנאים כאשר תאים מאותגרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים (כגון שיתוף ביטוי של חלבונים אחרים, יישום כימי, התקפה הפתוגן או שינויים סביבתיים, וכו &#39;. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slide</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Cover glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite software</td></tr><tr><td>40X objective lens</td><td>Leica</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO&amp;nbsp;</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Canemco &amp;amp; Marivac</td><td>205EQA-Spec</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

ויזואליזציה של אירועי איתות דינמיים בתאים חיים כבר אתגר. הרחבנו מערכת ביטוי חולף הוקמה, השלמה פלורסנט biomolecular (BiFC) assay בתאים אפידרמיס טבק, מאינטראקציה בין חלבונים בדיקות ניטור הפריסה המרחבית של הולכת אותות בתאי הצמח. בפרוטוקול זה, השתמשנו assay BiFC להראות כי האינטראקציה ואת האיתות בין יודה ארבידופסיס MAPKKK ו MAPK6 להתרחש קרום הפלזמה. כאשר בזל חלבון פיגום היה שיתוף הביע, האינטראקציה יודה-MAPK מחדש ושיתוף מקוטב מרחבית עם CFP-בזל. מערכת ביטוי טבק מהונדס זה מאפשרת בדיקה מהירה של איתות שינויי לוקליזציה ודינמית (פחות מ -4 ימים) והוא יכול להכיל מספר רב של צבעי חלבון פלואורסצנטי (לפחות שלוש). גם הצגנו שיטות מפורטות לכמת הפצת חלבון (לוקליזציה מרחבית סימטרית, או &quot;קיטוב&quot;;) בתאי טבק. יש מערכת ביטוי טבק מתקדמת זו יש פוטנציאל להיות בשימוש נרחב לבדיקה מהירה של אירועי איתות דינמיים בתאי צמח חיים.

כדי למנוע מוות של תאים המושרה על ידי איתות MAPK היפראקטיבי, הגרסאות פעיל קינאז של Yda (DNyda) ו MPK6 (DNmpk6) ששימשו assay שיתוף ביטוי בתאים טבק. לא האינטראקציה בין DNyda ו DNmpk6 נחשף על ידי BiFC ולא CFP-בזל עצמו שנוצר דפוס הפצה אחידה (איור 3A-B). עם זאת, כאשר CFP-בזל הוכנס זוג אינטראקציה DNyda-DNmpk6, הן CFP אותות YFP היו מחדש כדי באופן מקוטב מאוד (איור 3 ג). חלוקה מחדש הדבר מצביע על כך בזל אינטראקציה עם Yda ו MPK6 כדי מרחבית לארגן מחדש את מסלול איתות MAPK בתאי הצמח. מעמדו זירחון של בזל יש שפעות הפרש על מידת הקוטביות של איתות MAPK: גרסת מחקי phospho של בזל שנוצרה קוטבי מאוד חזק, בעוד גרסת phospho המחסר הראתה פעילות חלשה 6. נתונים אלו תמכו מודל העבודה שלנו של<html> תקנה משוב חיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK ביצירת תאים קוטביים 6. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53790/53790fig1.jpg" /> תרשים איור 1. של קומפלקס הקוטביות בזל-Yda-MPK6 במהלך חלוקת התא אסימטרית הפיוניות (ACD) ארבידופסיס. באפידרמיס עלה, linage הפיוניות יוזם מתאי protodermal, המרחיבים להפוך לתאי מבשר ACD, התאים Meristemoid אמא (MMCs). MMC עובר ACD ליצור Meristemoid אחד ואחד SLGC (תא קרקע השושלת הפיוניות), אשר עשוי לחלק ולבסוף להתמיין לתאי שומר הפיוניות ותאי מדרכה, בהתאמה. בשעת קליפת התא של תאי מבשר ACD (MMCs), בזל מגייס שני מרכיבי מסלול MAPK, את Yda MAPKKK ואת MAPK MPK6, להקים קומפלקס קוטבי ולהסדיר הפיוניות ACD.om / קבצים / ftp_upload / 53,790 / 53790fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53790/53790fig2.jpg" /> תרשים איור 2. לפקודת הפרוצדורה הזרקת בטבק ליף אפידרמיס. (א) להפוך את פלסמידים מחסה CFP-בזל, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP ו P19 לתוך Agrobacterium tumefaciens GV3101 לגדל אותם על צלחות מבחר בהתאמה (מלמעלה למטה ב א). (ב) ירים מושבות מ- (A) לחסן תרבות נוזלית לצמיחת הלילה. (C) קציר תאים על ידי ספינינג למזוג supernatant. לאחר pipetting בקצרה ושטיפת הכדורים, לסובב את התאים שוב. (ד) מחדש להשעות לדלל את כדורי תא עם הפתרון הסתננות (ראה פרוטוקול) כדי להשיג את OD הסופי 600 = 0.5. (E) בעדינות מערבבת הדואר מחדש מושעה תאים בצלחת פטרי. (F) השתמש מזרק מחטים לדחוף את התערובת חדירה בצד abaxial של עלי טבק. (G) כ -48 שעות לאחר חדירה, העלים מוכנים הדמיה confocal. דיסקים עלו בלו מכילים נגועים תאים עם אגרופן חור רחבי האזור החדיר. עיגולים מקווקווים מציינים ניכרים דיסקי חופשה. (H) השתמש במים לעלות על דיסקים עלה לשקופית תקן הדמיה confocal. תרשימי התיבה באזור המוצלל לתאר את החלבונים המוזרקים עליי טבק עבור assay קיטוב. בגדלי חלבון אינם בקנה מידה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53790/53790fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53790/53790fig3.jpg" /> איור 3. תצוגה וכימות של גיבוש קוטביות. </strאונג&gt; (AC) תמונות Confocal להראות CFP ו בתפרחת YFP בתאי אפידרמיס טבק. ציאן מציין את הביטוי של CFP. צהוב מציין את הביטוי של YFP. (א) התבטאות יתר של CFP-בזל לבד. (ב) Co-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP. הביטוי YFP הוא השלים כאשר שני חלבונים אינטראקציה. (C) Co-ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP. חלוקה לא שווה (קוטביות) ניכרת הן CFP ו YFP. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (AC). (DF) מבחינה גרפית זוממים את עוצמת הקרינה CFP / YFP לאורך קווים מקווקווים (מגנטה) ב (AC). משולש מגנט לסמן את נקודת ההתחלה וסיום של האזורים המשמשים והתוויית אינטנסיבית. Quantifications של מידת הקוטביות בתאי טבק מוצג מתחת. הערכים של עוצמת בתפרחת (H עבור גבוהה L עבור נמוכה) נמדדים שנאספו על ידי פיג&#39;י מאזורי לייחס עם דה אדוםלשפוך שורות (AC). עבור כל דגימה, הערכים מ -20 תאים בממוצע עבור מבחן מובהק. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53790/53790fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells. 

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetics

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found overexpressed in many diseases, including cancer. TGF-&#946; is strongly implicated in metastasis during late stage cancer progression, activating a subset of migratory and invasive tumor cells. Current methods for signaling pathway analysis focus on endpoint models, which often attempt to measure signaling post-hoc of the biological event and do not reflect the progressive nature of the disease. Here, we demonstrate a novel adenovirus reporter system specific for the TGF-&#946;/Smad3 signaling pathway that can detect transcriptional activation in live cells. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. The use of a fluorescent reporter allows for imaging of live single cells in real-time with direct identification of transcriptionally active cells. Stimulation of infected cells with TGF-&#946; displays only a subset of cells that are transcriptionally active and involved in specific biological functions. This approach allows for high specificity and sensitivity at a single cell level to enhance understanding of biological functions related to TGF-&#946; signaling in vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 transcriptional activity of cells implanted in vivo can be analyzed through conventional IVIS imaging and monitored live during tumor progression, providing unique insight into the dynamics of the TGF-&#946; signaling pathway. Our protocol describes an advantageous reporter delivery system allowing for quick high-throughput imaging of live cell signaling pathways both in vitro and in vivo. This method can be expanded to a range of image based assays and presents as a sensitive and reproducible approach for both basic biology and therapeutic development.

Here, we present a protocol for live cell imaging of TGF-&#946;/Smad3 signaling activity using an adenovirus reporter system. This system tracks transcriptional activity in real-time and can be applied to both single cells in vitro and in live animalmodels.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Cancer Research

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochemistry

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Developmental Biology

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chemistry

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Neuroscience

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...