אנו מכירים את עזרתו של מייק Muntifering ומאט Kofron עם הדמיה confocal וגייל Macke לנהלים היסטולוגית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות-NHLBI (K01HL115447 כדי DS).

בעלי חיים שוכנו בתנאים הפתוגן חינם. עכברים שטופלו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים CCHMC ועדת שימוש (סינסינטי, אוהיו ארה&quot;ב). עכברים מנוצלים ברחבי המחקרים הללו נשמרו רקע מעורב. 1. הר שלם X-galactosidase מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים הנשי בהריון E11.5 כדי E14.5, משאיפת CO 2. מניחים חיות בתא 2 CO, לחייב את החדר עם CO 2. לשמור על חיות בתא עבור מינימום של 5 דק &#39;. ישם שיטה משנית של המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור הבטן נקי עם אתנול (EtOH) 70% ולבצע laparotomy עם חתך קו האמצע בטן אחת. לנצל מספריים כירורגיות דפוס סטנדרטי (ישר מסורית) מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד קרני הרחם באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר ומכניסים מיד רקמות בצלחת פטרי המכילות מקורר פתרון PBS. לשמור על רקמות על הקרח עד הליךלבידוד של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד עובר מן קרן רחם. לנתח רקמת ריאה קנה נשימה עוברית באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לנצל מלקחי טיפ נאים ומספריים להחזיק לנקב את רקמת רחם concepti משחרר את העוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר הנותרים ממברנות עובריים. עם להבי סיוע של מחט לחתוך ראש עובר וחלק גוף תחתון מתחת לסרעפת. אתר כבד כציון דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של אזור החזה של העובר, להמשיך להסיר צדדים לרוחב קיר גוף, עמוד השדרה ולהבי מחט באמצעות לב. תשמור על עצמך תוך הסרת הלב כדי למנוע פציעת רקמות קנו נשימה. לבסוף, בזהירות, להפריד בין הוושט מקנה הנשימה על ידי משיכת הוושט עם סיוע של להבי מחט. לשמור על רקמה בתמיסת PBS על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום רקמת 4 מיליליטר בורג בקבוקוני כובע באמצעות טפטפות זכוכית או העברה. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS למשך 30 דקות. לאחר קיבוע,לשטוף רקמה עם PBS. בעוד שטיפה, להכין פתרון מכתים X-gal (להוסיף 5 מ&quot;מ K 3 Fe (CN) 6, (100 μl 0.5 M לני&quot;ע) 5 מ&quot;מ K 4 Fe (CN) 6 (100 μl 0.5 M המניות) 2 מ&quot;מ MgCl 2, ( 20 μl 1 M לני&quot;ע) 0.01% NaDOC (50 המניות μl 2%), 0.02% NP 4 O (100 μl 2% מניות), 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל X-gal (500 μl של 20 מ&quot;ג / ml המלאי) ו 9.13 מ&quot;ל של מים מזוקקים להביא לנפח סופי של 10 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל PBS הנותרים ומוסיפים 2 מ&quot;ל של תמיסת מכתים X-gal בקבוקון זכוכית. מניחים צלוחיות במגש על שייקר. כתם רקמות 1 עד 2 שעות בתמיסה מכתימה X-gal. דגירת הרקמה בתמיסת X-gal במשך 4 שעות לעיבוד והטבעה נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי רקמות כביסה ב-PBS sulfoxide דימתיל 3%. יש לשטוף ב- PBS, 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד לשטוף ולאחסן באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחות פטרי עם פתרון 1% agarose / PBS. אפשר agarose כדי לחזק. באמצעות טפטפות העברת זכוכית, למקם את הרקמה על שיתוף agaroseצלחות ated מלאים פתרון PBS. לצלם mounts כל באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בחר מסנן מתאים brightfield. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבחין טוב יותר את האתרים של דגימות תהליך מכתים X-gal להטבעת פרפין חתך. דגימות מקום קלטות מסך בסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבד דגימות להטבעת פרפין ושימוש במעבד אוטומטי להגדיר מחזור קצר כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול: שינוי ראשון 5 דקות ו -3 דקות לכל שינוי נותר. שלושה שינויים של קסילן: 5 שינוי הראשון דקות ו -3 דקות הבאים שני שינויים. השלבים הקודמים מבוצעים על 30 מעלות צלזיוס. לבסוף, לבצע שלושה שינויים של פרפין ב 62 ° C: 25 דקות, 8 דקות ו -5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות אוריינט להטבעה עם הרקמה שוכבת על הקרקעית של הטבעת סירה. בזהירות להוסיף פרפין למלא את סירת ההטבעה. מגניב מיד על צלחת קרה של הטבעת תחנה עד מתמצק פרפין. סור בלוק מן הטבעת סירה. באמצעות microtome, ליצור 6 מיקרומטר sections. סעיפי הר בשקופיות-pretreated ומגלשות יבשות על סט חם שקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים מחליקים לילה בתנור ב 56 ºC. מניח שקופיות מתלות. Deparaffinize מחליק עם שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות כל אחד. השתמש מכתים מנות מלאות 200 מ&quot;ל של קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגים (100%, 70%, 50% ו -30%, 1 דקות לכל שלב) כדי PBS לפני counterstaining עם אדום מהיר גרעיני במשך 10 עד 30 שניות. יש לשטוף שקופיות עם ברז מים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם כדי להסיר עודפים של Red הגרעיני המהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשי שקופיות בסדרת EtOH מדורגת (50%, 70% ו -100% EtOH) לפני הכביסה בשלושה שינויים של קסילן (20 מטבלים כל שינוי) ומכסים מחליקים עם תקשורת הרכבה מבוססת קסילן. </li></ol> 2. לקטינים מכתימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח רקמת הריאה E13.5 ו E14.5 קנה הנשימה כמתואר בשלבים 1.1 כדי 1.4. באמצעות טפטפות העברת זכוכית רקמות מקום בקבוקונים מתברג. תקן רקמת הריאה קנה הנשימה עם 2 מ&quot;ל של2% פתרון PFA לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין חיץ חסימה, בדרך כלל נפח סופי של 10 מיליליטר של תמיסה. להוסיף 0.1 גרם של BSA (1%) ל -8 מ&quot;ל של PBS. אפשר BSA לפזר. להוסיף 0.2 מ&quot;ל של סרום עיזים (2%) 0.03ml של טריטון X-100 (0.3%). תביאו נפח סופי 10 מ&quot;ל עם PBS. דגימות בלוק עבור שעה 1 ב 0.5 מ&quot;ל של חיץ חסימת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ חסימה בעזרת פיפטה העביר ולהחליף עם פתרון לקטינים המורכב של 50 מיקרוגרם / μl של לקטינים, 10% בסרום עיזים PBS. השתמש 250 μl של פתרון לקטינים לדגימה. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לכסות את בקבוקון זכוכית המכיל רקמות ברדיד אלומיניום. לאחר הדגרה עם פתרון לקטינים, לשטוף דגימות PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> explants מקום בצלחות פטרי מצופה agarose המכילים מספיק PBS לכסות דגימות. לצלם mounts כולו באמצעות מיקרוסקופ לנתח קרינה. בחר את appropמסנן riate לזהות קרינה. לקטינים PNA בדרך כלל מצמידים GFP. </li></ol> 3. הר שלם Immunofluorescence מכתים מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד רקמת ריאה קנה נשימה, להעביר 4 ​​מיליליטר בקבוקוני כובע זכוכית בורג ולתקן לילה PFA 4%. רקמת E11.5 יכולה להיות קבועה 2% PFA. חנות מתנול 100%. דוגמאות ניתן לאחסן עד מספר חודשים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתנול באמצעות פיפטה העברת permeabilize דגימות באמצעות האקונומיקה של דנט (4 חלקים מתנול, 1 חלק DMSO ו 1 חלק 30% H 2 O 2) עבור 2 שעות. רקמת סודה בסדרה של מתנול מדורגים מדולל PBS כדלקמן: 100 מתנול%, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול, 100% PBS. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר במהלך כל שלב של הידרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת הבלוק מגיב חסימת 0.5% בדילול מלא PBS (ראה חומרים לפרטים נוספים) למשך שעות בטמפרטורת חדר עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן עיקרי חסימהפתרון (Sox9 1: 100, 1 Nkx2.1: 200, 1 αSMA: 250) דגירה דגימות לילה בשעה 4 ° C.. לשטוף דגימות עם PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. בצע כל שטיפה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדנים משני ביחס של 1: דילול 500 בתמיסת חסימת 0.5%. בחר בקפידה נוגדנים משני למנוע מחייב בין נוגדנים משני. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר חשוך. לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מייבשי דגימות בסדרה של מתנול מדורגת מדולל PBS כדלקמן: מתנול 25%, 50% מתנול 75% מתנול, מתנול 100%, 10 דקות כל אחד צעד. הערה: ודא כי דגימות להישאר מכוסה בנייר אלומיניום ולצמצם את החשיפה לאור. רקמות כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות עד להצטלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות העברה מחוייט צלחות הבמה, להסיר מתנול וברור עם כ 200 μl של פתרון ברור של מוריי 19,20 (2 חלקים בנזיל בנזואט, 1 חלק בנזיל אלכוהול) מיד BEFהדמית עפרות. לצלם באמצעות מיקרוסקופ confocal. לעבד ולנתח תמונה באמצעות תוכנת הדמיה. </li></ol> התפשטות תאים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק עכברי E11.5 בהריון תוך peritoneally עם תמיסה של BrdU בריכוז של 100 מיקרוגרם BrdU / גרם של משקל גוף. הקורבן נקבה כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול ולבודד העוברים E12.5 או E13.5. שימוש להבי סכין, ראשי בלו החלק התחתון של הגוף מתחת חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רקמות החזה ב 4 מ&quot;ל בורג בקבוקונים כובע ולתקן ב 1 מ&quot;ל של 4% PFA לילה. לשטוף דגימות עם PBS פעמים במשך 5 דקות ו מייבשות דגימות באמצעות סדרת אתנול מדוללת מים מזוקקים אתנול 70% כדלקמן: 30%, 50% ו -70% אתנול, במשך 5 דקות כל אחד צעד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות קלטות מסך בגודל בינוני. תהליך רקמה והטבעה פרפין באמצעות מעבד אוטומטי. הגדרת מחזור כדלקמן: שישה שינויים של אלכוהול במשך 8 דקות כל אחד, שלושה שינויים של קסילן במשך 6 דקות כל אחד, שלושה גhanges של פרפין, במשך 25 דקות, 9 דקות ו -8 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע פרפין המכוונת את הרקמה המיקום הרצוי כדי ליצור 6 רוחבי מיקרומטר או סעיפים האורך כמפורט בסעיפים מקום בסעיף 1. בשקופיות ולאפשר רקמות לדבוק להחליק על הסט חם השקופית על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות אופות, על צדם, הלילה בתנור ב 56 ° C. מניח שקופיות מתלות פלסטיק. שקופיות דה-paraffinize ידי טבילה שלושה שינויים של 100% קסילן, 10 דקות לכל שינוי. השתמש 200 מ&quot;ל של קסילן להטביע שקופיות לחלוטין. רעננותם שקופיות באמצעות סדרת EtOH מדורגת (100%, 70%, 50% ו -30%, 5 דקות לכל שלב עם תסיסה) כדי PBS (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אחזור אנטיגן באמצעות 10 מ&quot;מ חיץ ציטראט, pH 6. כדי להכין 100 מ&quot;ל של תערובת חיץ ציטראט 18 מ&quot;ל של 0.1 מ חומצת לימון monohydrated ו -82 מ&quot;ל של 0.1 מ &#39;נתרן ציטרט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות בצנצנות coplin פלסטיק מלא פתרון יחזור אנטיגן ומיקרוגל עבור 6.5 דקות בהספק גבוה. להוסיף דיסtilled מים בצנצנת coplin כדי לפצות על חיץ לחמם ציטראט-התאדה בהספק 40% במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צנצנת coplin לראש עם מים, לחמם שוב בהספק 40% במשך 6 דקות. פעמי מיקרוגל עשויים להשתנות בהתאם מיקרוגל בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שקופיות כביסה במים מזוקקים במשך 1 דקות, ואחריו PBS במשך 5 דקות. לאחר PBS לשטוף, מגלשות בלוק עבור שעה 2 בתמיסה המכילה חוסם TBS (2.425 גרם של בסיס טריס ו 8.765 גרם של NaCl מדולל 1 ליטר של מים מזוקקים) 10% בסרום חמור 1% BSA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים עיקריים מדוללי חסימת הפתרון (TBS המכיל סרום 10% חמורים 1% BSA). BrdU (סמן מיטוזה), Nkx2.1 (אפיתל דרכי הנשימה), Sox9 (תאים יהיה להצמיח סחוס) ו αSMA (תאי שריר חלק). דגירת שקופיות הלילה, ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בשיטת כיסוי כדי לשמר נוגדנים. החל 180 μl של נוגדני אטם ולאחר מכן לצרף שקופית כאילו כיסוי להחליקפינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק אטם ידי טבילת שקופיות לתוך מים מזוקקים. לאחר הסרת האטם, לשטוף נוגדן ראשוני מאוגד על ידי ביצוע שש 5 שטיפות דקות עם כפות המכילות 0.1% Tween-20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם נוגדנים משני מדולל חסימת פתרון בדילול של 1: 200, 1 שעות בטמפרטורת החדר. בחר נוגדנים משני בזהירות כדי למנוע רצויים מחייב ביניהם. סור נוגדנים משני מאוגד על ידי ביצוע שלושה חמישה שוטף דקות עם כפות המכילות Tween 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 0.1 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן 0.05 בסיס M טריס פעמים במשך 5 דקות. שקופיות ניתן להשאיר 0.05 מ &#39;טריס בסיס תוך coversliping באמצעות התקשורת הרכבה עם או בלי DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). שקופיות חנות בתיקיית שקופיות ב 4 ° C ולהגן מפני אור על ידי כיסוי תיקייה עם רדיד אלומיניום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין מכתים ולצלם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. רוזן שכותרתו תאי תאים הכוללים לכל שדה מצולם20X ו 40X לקבוע יחסים של מתרבי תאים לתאים כוללים. </li></ol>

<ol>
	<li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis.">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li><li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+for+the+first+breath:+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development.">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li><li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+the+foregut+tube:+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus.">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li><li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt2/2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut.">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li><li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut.">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li><li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development.">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li><li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Endodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation&amp;#34;.">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&amp;#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung.">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li><li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea.">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development.">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li><li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis.">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li><li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development.">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li><li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc,+BMP4,+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung.">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li><li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+(OP)+poisoning.">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li><li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin/Mrtf-B+and+Fgf10+expression.">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li><li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal/distal+cell+fate+during+lung+morphogenesis.">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li><li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium.">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li><li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis.">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li><li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+in+large+insect+brains:+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts.">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+(Shh)+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage.">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li><li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage.">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li><li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs.">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+(hdf)+embryos.">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li><li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C/PDGFR+pathway.">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li><li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis.">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li></ol>

&quot;החוקרים אין לי מה לחשוף.&quot;

אירועים שבבסיס morphogenesis של דרכי הנשימה אינם מובנים לחלוטין, במיוחד את ההליכים הנדרשים דפוסים של דרכי הנשימה ניצוח. מחקרים קודמים השתמשו בטכניקות vivo לשעבר שבו explants בפיתוח מתורבת על שלבי נוזלי אוויר או מוטבע matrigel 21,22. מחקרים אלה הראו כיצד גורמי גדילה להשפיע ע?...

פיתוח דרך נשימה הוא שיזם עוברי היום 9 (E9) עם הופעתו של תאים חיוביים Nkx2.1 ב endodermal גחון 1,2 במעי קדמי. הפרדת צינור ושט-קנה נשימה תפתור ידי E11.5 כשהצינורות ניתן להבחין כישויות נפרדות, כל אחת מוקף mesenchymal רקמות 3. איתות Wnt ממלא תפקיד מרכזי במפרט של דרכי הנשימה כמו מחיקת Wnt2 ו Wnt2b, שהביעו mesenchyme ומחיקה של β-קטנין splanchnic מן האפיתל הנשימה endodermal תגרום agenesis ריאות 4,5. המחקרים הקודמים שלנו נקבע כי מחיקה של WLS, הפרשה בתיווך רצפטור המטען של כל הליגנדים Wnt, מתוצאות בדרכי הנשימה endodermal ב hypoplasia ריאות, פגמים בהתפתחות כלי דם ריאתי דפוסים mis של mesenchyme קנה הנשימה 6,7. נתונים אלה תומכים בחשיבות של הקרו אפיתל mesenchymalss לדבר התמיינות תאים מפרט, כפי שהוא גם הוכח במחקרים אחרים 8,9. המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הריאות מסתמך על גנטיים, במבחנה טכניקות vivo לשעבר כי אפשרו לנו להבין מנגנונים טובים יותר נהיגה זהות הנשימה 10-16. תרבויות ריאות explant כולו על שלבי נוזלי אוויר כבר נוצלו נרחב כדי לחקור את ההשפעות של גורמי גדילה בשלבים המוקדמים של ריאתי הסתעפות morphogenesis 10,17,18. אמנם שיטה זו משמשת ההודעה של שינויים מורפולוגיים, כגון המורפוגנזה הסתעפות, אפנון ביטוי גנים, היא מוגבלת ללימוד בשלבים המוקדמים של תהליך התפתחותי, כמו התרבות עצמה אינה תומכת בפיתוח כלי הדם 17. פיתוח של סחוס קנה נשימה דורש פעמי דגירה כבר שעשויה להיות לא תואמים עם טכניקת תרבות זו. כדי analyzדואר התפקיד של איתות Wnt במהלך היווצרות בדרכי נשימה, מתאמנים בטכניקות מקובלות כדי לענות על הצרכים של המחקרים העובריים שלנו. יש לנו שונה כרכים, פעמים מכתימות, רכיבת עיבוד להטבעת פרפין ועיתוי לסליקה של רקמות קנו נשימה וריאות. המטרה העיקרית של אופטימיזציה של הטכניקות המתוארות במחקר הנוכחי הייתה לנתח את השלבים המוקדמים של פיתוח קנה הנשימה אצל עכברים המתרחשים מ E11 ל E14.5. שימוש Axin2LacZ קו העכברים כתב לנו האתרים לקביעה מדויקת של פעילות Wnt / β-קטנין ב mesenchyme קנה הנשימה מתפתח. גם אנחנו צריכים להתאים לקטינים ההליך מכתים עבור רקמות קנה הנשימה הר שלם. לפיכך, הצלחנו לחזות condensations mesenchymal ולחזות אתרים שבהם chondrogenesis יתקיים. הכתמה של הר שלם וחתכים של רקמה עוברית שהתקבלה בעכברי WlsShhCre, בשילוב עם שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות, אפשרה לנו לחשוף את התפקיד של הליגנדים Wnt המיוצרים על ידי traהאפיתל Cheal ב דפוסים קנה הנשימה.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , rabbit</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, rabbit</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mouse</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, guinea pig</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, mouse</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, sheep</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Molecular probes</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Component of TSA kit #2&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy cassettes</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Available in different colors</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&amp;nbsp; Kernechtrot 0.1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro knives</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ceramic coated</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wide field microscope</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescence Dissecting microscope</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Automated fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Leica Application suite</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica imaging software</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon imaging software</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaging processing software</td></tr></tbody></table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Wnt / פעילות β-קטנין מכתים ההר שלם Lac-Z זוהה רקמות קנו נשימה וריאות של עוברים מבודדים כתב Axin2 Lac -Z עכברי 11. אתרים של מכתים לציין פעילות Wnt / β-catenin. ניתוח סעיפים של מכתים הר שלם נק...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways at JoVE.com

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה.

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K Views.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.  שימוש עכברי כתב מצמידים את ההר שלם וסעיף מכתים, מיקרוסקופיה מבחני vivo מקל על הניתוח של המנגנונים העומדים בבסיס הדפוסים הנורמלים של דרך הנשימה. כאן אנו מתארים כיצד טכניקות אלה תרמו ניתוח איתות Wnt במהלך התפתחות קנה נשימה. 

Video: Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Biology

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be differentiated stepwise into 3D multicellular lung organoids, made of both epithelial and mesenchymal cell populations. We recapitulate embryonic developmental cues by temporally introducing a variety of growth factors and small molecules to efficiently generate definitive endoderm, anterior foregut endoderm, and subsequently lung progenitor cells. These cells are then embedded in growth factor reduced (GFR)-basement membrane matrix medium, allowing them to spontaneously develop into 3D lung organoids in response to external growth factors. These whole lung organoids (WLO) undergo early lung developmental stages including branching morphogenesis and maturation after exposure to dexamethasone, cyclic AMP and isobutylxanthine. WLOs possess airway epithelial cells expressing the markers KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) and MUC5AC (goblet) as well as alveolar epithelial cells expressing HOPX (alveolar type I) and SP-C (alveolar type II). Mesenchymal cells are also present, including smooth muscle actin (SMA), and platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR&#945;). iPSC derived WLOs can be maintained in 3D culture conditions for many months and can be sorted for surface markers to purify a specific cell population. iPSC derived WLOs can also be utilized to study human lung development, including signaling between the lung epithelium and mesenchyme, to model genetic mutations on human lung cell function and development, and to determine the cytotoxicity of infective agents.

The article describes step wise directed differentiation of induced pluripotent stem cells to three-dimensional whole lung organoids containing both proximal and distal epithelial lung cells along with mesenchyme.

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This process requires complex and coordinated paracrine interactions between signal-sending and signal-receiving cells. Given that these interactions can occur between various types of cells from different lineages, in vivo evaluation of cell-specific defects can be challenging. The present study describes a highly reproducible method to evaluate paracrine noncanonical Wnt signaling in vitro. This protocol was designed with the ability to (1) conduct functional and molecular assessments of noncanonical Wnt signaling between any two cell types of interest; (2) dissect the role of signal-sending versus signal-receiving molecules in the noncanonical Wnt signaling pathway; and (3) perform phenotypic rescue experiments with standard molecular or pharmacologic approaches.
This protocol was used to evaluate neural crest cell (NCC)-mediated noncanonical Wnt signaling in myoblasts. The presence of NCCs is associated with an increased number of phalloidin-positive cytoplasmic filopodia and lamellipodia in myoblasts and improved myoblast migration in a wound-healing assay. The Wnt5a-ROR2 axis was identified as a crucial noncanonical Wnt signaling pathway between NCC and second heart field (SHF) cardiomyoblast progenitors. In conclusion, this is a highly tractable protocol to study paracrine noncanonical Wnt signaling mechanisms in vitro.

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

The present study outlines a highly reproducible and tractable method to study paracrine noncanonical Wnt signaling events in vitro. This protocol was applied to evaluate the impact of paracrine Wnt5a signaling in murine neural crest cells and myoblasts.

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioengineering

סקירה מקיפה של פרוטוקולי תרבית צמחילת עור עוברי בעופות

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

מחבר זרקור: תובנה לגבי המתודולוגיות הניסיוניות הנוכחיות של צמחי עור העופות

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

לימוד Wnt איתות במהלך דפוסים של איירווייס ניצוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

באמצעות ניתוח של Confocal

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו

עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה