私たちは、組織学的手順で共焦点イメージングとゲイルマッケとマイクMuntiferingとマットKofronの支援を認めます。この作品は、部分的に健康NHLBI（DSへK01HL115447）の国立研究所によってサポートされていました。

動物を無菌条件下で飼育しました。マウスはCCHMC施設内動物管理使用委員会（オハイオ州シンシナティUSA）によって承認されたプロトコルに従って取り扱われました。これらの研究を通して利用したマウスは混合バックグラウンドで維持しました。 1.ホールマウントX-ガラクトシダーゼ染色<ol><li> CO 2吸入によって、E14.5にE11.5で妊娠中の女性を安楽死させます。 、CO 2室で動物を置き、CO 2でチャンバーを充電。 5分間の最低室で動物を維持します。頚椎脱臼により安楽死の二次方法を実行します。 </li><li>エタノール（エタノール）70％と、単一の腹部正中切開で開腹術を行うときれいな腹部領域。手術用ハサミと標準パターン（ストレート鋸歯状）鉗子を利用します。 </li><li>鉗子と細かいハサミを使用して子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液を含むペトリ皿に組織を配置します。先に進むまで氷上で組織を維持胚を単離します。 </li><li>子宮角から胚を分離します。解剖顕微鏡を使用して、胚気管肺組織を分析。胚を放出子宮組織とconceptiを保持し、穿刺する先端の細いピンセットやハサミを使用しています。 <ol><li>残りの胚膜を削除します。針刃の支援を受けて胚および横隔膜下の下半身部分の頭をカット。ランドマークとして、肝臓の位置を確認します。 </li><li>胚の胸部の単離後、針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の側面を除去するために進んでください。気管組織を傷つける避けるために心を除去しながら注意してください。最後に、慎重に、針の刃の支援を受けて食道を引いて、気管から食道を分離します。氷上のPBS溶液中で組織を維持します。 </li></ol></li><li> 4ミリリットル中に組織を置き、ガラスを使用して、キャップバイアルまたは転送ピペットをねじ込みます。 30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で気管肺組織を修正しました。固定後、PBSで組織をすすぎます。すすぎながら、X-gal染色溶液（5mMのK 3のFe（CNを追加）6を、（100μlの0.5 Mストック）5 mMのK 4のFe（CN）6（100μlの0.5 Mストック）2のMgCl 2、（準備20μlの1 Mストック）0.01％NaDOC（50μlの2％ストック）、0.02％NP 4 O（100μlの2％ストック）、1mg / mlのX-galを（20 mg / mlでストック500μlの）および9.13ミリリットル10mlの最終容量）をもたらすために蒸留水。 </li><li>残りのPBSを削除し、ガラスバイアルにX-gal染色溶液の2ミリリットルを追加します。シェーカー上トレイにバイアルを置きます。 X-gal染色溶液で染色組織1~2時間。さらに処理および埋め込みのために4時間のX-gal溶液中で組織をインキュベートします。 </li><li> 3％のジメチルスルホキシド-PBSで組織を洗浄することによって反応を停止させます。 5分間、PBS中の70％エタノール中で各洗浄や店舗を3回すすいでください。 </li><li> 1％アガロース/ PBS溶液でペトリ皿を埋めます。アガロース固化することを可能にします。ガラス転移ピペットを用いて、アガロース共同で組織を配置PBS溶液で満たされたatedプレート。解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。明のための適切なフィルタを選択します。 </li><li>優れたパラフィン包埋し、切片用のX-gal染色処理サンプルのサイトを区別するために。細かい画面カセットでサンプルを置きます。 <ol><li>自動化されたプロセッサを使用するパラフィン包埋のためにサンプルを処理し、次のように短い周期を設定するには：アルコールの6変更：5分最初の変更及び残りの各変化当たり3分。キシレンの三つの変化：5分最初の変更と3分次の二つの変更。前の手順は、30℃で実施されています。 25分、8分および5分：最後に、62℃におけるパラフィンの3変更を行います。 </li></ol></li><li>ボートを埋め込むの底に平らに横たわっている組織で埋め込むための東洋サンプル。慎重に埋め込むボートを埋めるためにパラフィンを追加します。パラフィンが凝固するまで駅を埋め込むのコールドプレートにすぐに冷却します。ボートを埋め込むからブロックを削除してください。ミクロトームを用いて、6ミクロンのを生成ections。スライド上の前処理し、スライドやドライスライド上のマウント部1時間42℃で暖かいセット。 </li><li>焼く56ºCのオーブンで一晩スライドします。ラックにスライドを置きます。脱パラフィンは、100％キシレンの3変化、10分ごとにスライドします。キシレンの200ミリリットルで満たされた皿を染色に使用します。 </li><li> 10〜30秒間核ファーストレッドで対比染色する前にPBSに段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％及び30％、工程ごとに1分間）を用いてスライドを再水和します。水道水で5分間の核ファストレッドの過剰を削除するたびに3回スライドを洗浄します。 </li><li>キシレンベースの取り付けメディアで滑る3キシレンの変化（20ディップそれぞれ変化する）と、カバー中で洗浄する前に段階的エタノールシリーズ（50％、70％および100％エタノール）でスライドを脱水。 </li></ol> 2.レクチン染色<ol><li>ステップ1.4から1.1に記載されているようにE13.5とE14.5の気管肺組織を解剖。ガラス転送ピペットを使用すると、スクリューキャップバイアルに組織を配置します。 2mlで気管肺組織を修正しました。4℃で2％PFA溶液を一晩。固定後、PBSで10分間ずつ洗浄するための三回の試料をすすぎます。 </li><li>緩衝溶液の10mlを、通常、最終容積を遮断準備します。 8mlのPBSにBSA（1％）の0.1グラムを追加します。 BSAが溶解することを可能にします。ヤギ血清（2％）トリトンX-100（0.3％）の0.03ミリリットルの0.2ミリリットルを追加します。 PBSで10ミリリットルに最終容量を持参。室温でブロッキング緩衝液の0.5ミリリットルで1時間ブロックサンプル。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、ブロッキング緩衝液を除去し、レクチンのを50μg/μlの、10％ヤギ血清およびPBSで構成されるレクチン溶液と交換してください。サンプルあたりのレクチン溶液の250μlのを使用してください。 4℃で一晩インキュベートします。アルミホイルで組織を含有するガラスバイアルをカバーすることを確認します。レクチン溶液とインキュベートした後、10分間、PBS中で3回のサンプルをリンス。 </li><li>サンプルをカバーするのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に入れ植。蛍光解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。 appropを選択riateフィルタは、蛍光を検出します。レクチンPNAは通常、GFPに結合されています。 </li></ol> 3.ホールマウント免疫染色および共焦点顕微鏡<ol><li> 4ミリリットルガラススクリューキャップバイアルに移し、4％PFAで一晩固定し、気管肺組織を分離します。 E11.5組織を2％PFAで固定することができます。メタノール中の100％を保管してください。サンプルは-20℃で数ヶ月まで保存することができます。 </li><li>トランスファーピペットを用いてメタノールを除去し、2時間デントのブリーチ（4部メタノール、1部のDMSOと1部の30％H 2 O 2）を用いて試料を透過。次のようにPBSで希釈したメタノールの段階的シリーズの水和物組織：100％メタノール、75％メタノール、50％メタノール、25％メタノール、100％PBS。水和の各ステップ中、室温で10分間インキュベートします。 </li><li> PBSで希釈した0.5％ブロッキング試薬でブロック組織攪拌しながら室温で2時間（詳細は材料を参照されたいです）。 </li><li>ブロッキング、一次抗体を希釈溶液（Sox9を1：100、Nkx2.1 1：200、αSMA1：250）と4℃で一晩サンプルをインキュベートします。室温でPBSでサンプルを5回洗浄。 1時間ごとの洗浄を行います。 </li><li> 0.5％のブロッキング溶液中で1：500希釈で二次抗体を適用します。二次抗体の間で結合を防止するために二次抗体を慎重に選択します。暗い部屋で4℃で一晩インキュベートします。洗浄サンプルを室温で20分間3回洗浄しました。 25％メタノール、50％メタノール75％メタノール、100％メタノール、10分で各工程を以下のようにPBSで希釈したメタノールの段階的な系列でサンプルを脱水します。 注：サンプルはアルミホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えるたままであることを確認してください。撮影されるまで、組織は現在、数週間4℃で保存することができます。 </li><li>カスタムメイドへの転送サンプルステージプレートは、マレーの透明な溶液19,20（2部安息香酸ベンジル、1部ベンジルアルコール）、直ちにBEFの約200μlのメタノールとクリアを削除します鉱石イメージング。共焦点顕微鏡を用いて写真。プロセスおよびイメージングソフトウェアを用いて画像を解析します。 </li></ol> 4.細胞増殖<ol><li>体重を100μgのBrdU / gの濃度でのBrdUの溶液で腹腔内E11.5妊娠マウスに注入します。 E12.5またはE13.5で胚を、プロトコルのセクション1で説明し、単離のように女性を生け贄に捧げます。ナイフの刃、消費税ヘッドや胸腔下の下半身を使用。 </li><li> 4ミリリットルキャップバイアルをねじで胸部組織を置き、一晩4％PFAの1ミリリットルで固定します。 5分間のPBSで2回洗浄サンプルを、以下のように70％エタノールを蒸留水までで希釈したエタノールの一連のサンプルを脱水：30％、50％および70％エタノールを、5分間、各ステップは。 <ol><li>ミディアムサイズの画面カセットに入れサンプル。プロセッサを使用し、自動化されたパラフィン包埋のためのプロセスの組織。 8分間、アルコールの6変化、6分間、キシレンの3変化、3つのCを次のように周期を設定します25分、9分と8分間のパラフィンのhanges、。 </li></ol></li><li>スライド上のセクション1.セクションで説明したように6ミクロンの横方向または縦方向のセクションを生成し、組織が1時間42℃でスライドウォーマーセットにスライドするように付着することを可能にする所望の位置に組織を配向パラフィンに埋め込みます。 </li><li>一晩56℃のオーブンでその両側にスライドし、焼きます。プラスチック製のラックにスライドを置きます。 100％キシレンの3変化、変化当たり10分に浸漬することによって脱パラフィンを塗るスライド。完全にスライドを沈めるためにキシレンの200ミリリットルを使用してください。 PBS（5分）まで段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％および30％、攪拌しながらステップごとに5分）を用いてスライドを再水和します。 </li><li> 0.1 Mクエン酸の18ミリリットルは、一水和物、クエン酸緩衝液混合物の100ミリリットルと0.1 Mクエン酸ナトリウムの82ミリリットルを調製するために、10mMのにクエン酸緩衝液、pHが6を用いて、抗原回復を実行します。 <ol><li>高電力で6.5分間、抗原回収溶液とマイクロ波で満たされたプラスチック製のコプリンジャーに入れサンプル。 DISを追加6分間40％のパワーで蒸発させ、クエン酸緩衝液と再加熱を補償するために、コプリンジャーに水を耕作。 </li><li>水でトップ、そして6分間、40％のパワーで再び再加熱するコプリンジャーを記入してください。マイクロ波の時間は、使用されるマイクロ波に基づいて異なる場合があります。 </li><li>スライドを5分間PBSに続いて、1分間蒸留水でスライドを洗浄する前に室温で20分間冷却してください。 PBS後TBS（トリス塩基の2.425 gの蒸留水1Lに希釈したNaClを8.765 g）を10％ロバ血清および1％BSAを含有するブロッキング溶液中で、2時間ブロックスライドを洗います。 </li></ol></li><li>溶液（10％ロバ血清および1％BSAを含むTBS）をブロックに希釈した一次抗体を加えます。 BrdU（有糸分裂マーカー）、Nkx2.1（気道上皮）、Sox9を（軟骨に上昇を与える細胞）およびαSMA（平滑筋細胞）。 4℃で、一晩スライドをインキュベートします。抗体を節約するために、オーバーレイメソッドを使用します。ガスケットへの抗体の180μLを適用した後、カバースリップかのようにスライドを取り付けpingを実行。 </li><li>蒸留水にスライドを浸漬することによりガスケットを外します。ガスケットを除去した後、0.1％のTween-20を含むTBSで6 5分間の洗浄を行うことにより、未結合一次抗体を洗浄します。 <ol><li>室温で1時間、200：1の希釈でブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。それらの間の望ましくない結合を防ぐために慎重に二次抗体を選択します。 0.1％のTweenを含むTBSで3 5分間洗浄を行うことにより、未結合の二次抗体を除去します。 </li><li> 5分間二回、0.1Mトリス塩基でスライドを洗浄し、5分間二回、その後0.05 M Tris塩基。またはDAPI（1.5 / mlの）せずに取り付けメディアを使用してcoverslipingながらスライドを0.05 Mトリス塩基のままになることがあります。 4℃でスライドフォルダに保管スライドとアルミホイルでフォルダを覆うことにより、光から保護します。 </li></ol></li><li>自動化された蛍光顕微鏡を用いて染色し、写真を視覚化します。標識細胞とで撮影フィールドあたりの全細胞を数えます20Xと40Xは、全細胞に増殖細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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&quot;著者らは、開示することは何もありません。」

気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示して...

気道の開発は腹側内胚葉の前腸1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織3で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。 肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ10-16を駆動する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系17の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。 アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , rabbit</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, rabbit</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mouse</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, guinea pig</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, mouse</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, sheep</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Molecular probes</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Component of TSA kit #2&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc cassettes Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy cassettes</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Available in different colors</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&amp;nbsp; Kernechtrot 0.1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro knives</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ceramic coated</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wide field microscope</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluorescence Dissecting microscope</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Automated fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Leica Application suite</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica imaging software</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon imaging software</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Imaging processing software</td></tr></tbody></table>

studying wnt signaling during patterning of conducting airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Wnt /βカテニン活動ホールマウントラック-Z染色は記者Axin2 ラック -Zマウス 11から分離された胚の気管・肺組織で検出されました。染色のサイトは、Wnt /βカテニンの活性を示しています。全マウント染色のセクションの分析は、Wnt /βカテニン活性は気管の間充織における途上の肺の周辺領域...

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。

誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.3K ビュー.  Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. 全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

発生生物学

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

生物学

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be differentiated stepwise into 3D multicellular lung organoids, made of both epithelial and mesenchymal cell populations. We recapitulate embryonic developmental cues by temporally introducing a variety of growth factors and small molecules to efficiently generate definitive endoderm, anterior foregut endoderm, and subsequently lung progenitor cells. These cells are then embedded in growth factor reduced (GFR)-basement membrane matrix medium, allowing them to spontaneously develop into 3D lung organoids in response to external growth factors. These whole lung organoids (WLO) undergo early lung developmental stages including branching morphogenesis and maturation after exposure to dexamethasone, cyclic AMP and isobutylxanthine. WLOs possess airway epithelial cells expressing the markers KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) and MUC5AC (goblet) as well as alveolar epithelial cells expressing HOPX (alveolar type I) and SP-C (alveolar type II). Mesenchymal cells are also present, including smooth muscle actin (SMA), and platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR&#945;). iPSC derived WLOs can be maintained in 3D culture conditions for many months and can be sorted for surface markers to purify a specific cell population. iPSC derived WLOs can also be utilized to study human lung development, including signaling between the lung epithelium and mesenchyme, to model genetic mutations on human lung cell function and development, and to determine the cytotoxicity of infective agents.

The article describes step wise directed differentiation of induced pluripotent stem cells to three-dimensional whole lung organoids containing both proximal and distal epithelial lung cells along with mesenchyme.

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This process requires complex and coordinated paracrine interactions between signal-sending and signal-receiving cells. Given that these interactions can occur between various types of cells from different lineages, in vivo evaluation of cell-specific defects can be challenging. The present study describes a highly reproducible method to evaluate paracrine noncanonical Wnt signaling in vitro. This protocol was designed with the ability to (1) conduct functional and molecular assessments of noncanonical Wnt signaling between any two cell types of interest; (2) dissect the role of signal-sending versus signal-receiving molecules in the noncanonical Wnt signaling pathway; and (3) perform phenotypic rescue experiments with standard molecular or pharmacologic approaches.
This protocol was used to evaluate neural crest cell (NCC)-mediated noncanonical Wnt signaling in myoblasts. The presence of NCCs is associated with an increased number of phalloidin-positive cytoplasmic filopodia and lamellipodia in myoblasts and improved myoblast migration in a wound-healing assay. The Wnt5a-ROR2 axis was identified as a crucial noncanonical Wnt signaling pathway between NCC and second heart field (SHF) cardiomyoblast progenitors. In conclusion, this is a highly tractable protocol to study paracrine noncanonical Wnt signaling mechanisms in vitro.

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

The present study outlines a highly reproducible and tractable method to study paracrine noncanonical Wnt signaling events in vitro. This protocol was applied to evaluate the impact of paracrine Wnt5a signaling in murine neural crest cells and myoblasts.

in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

生物工学

鳥類胚性皮膚外植片培養プロトコルの包括的なレビュー

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

著者スポットライト:現在の実験的鳥類皮膚外植片方法論への洞察

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

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シンプルの力：ウニ胚として

マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究