פרוטוקול זה משתמש בתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים כדי להבדיל אותם לתאי ריאה על מנת לדגמן מחלת ריאות אנושית והתפתחות בצלחת. פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה קשה להשיג ותרבות רקמת ריאה אנושית ראשונית. היתרונות העיקריים של הבחנה בין תאי ריאה מתאי גזע פלוריפוטנטים הוא אספקה מתמדת של תאי ריאה ספציפיים כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות ומחלות.
תאים אלה יכולים להישמר בתרבית התאים לפרקי זמן ארוכים, ניתן להקריע עבור יישומים עתידיים, וניתן לתמרן אותם גנטית כדי לחקור מוטציות גנטיות. תוכיח את ההליך תהיה רייצ'ל מקוויקר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לפני תחילת הניסוי, להפשיר לאט גורם גדילה מופחת, או GFR, מטריצת קרום מרתף מדיום על קרח, לדלל אותו בנפח שווה של DMEM F12 קר.
מכניסים טיפים P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש. לאחר מכן, מצפים כל באר של צלחת 12 באר עם 500 microliters של 50% GFR מטריצת ממברנה מרתף מדיום, ולהסיר כל תערובת בינונית עודף בועות מן הבארות. מניחים את צלחות הבאר על גבי קרח רטוב או מקרר בארבע מעלות צלזיוס כדי להגדיר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחממה 37 מעלות צלזיוס לילה.
כאשר PSEs גבוה להגיע 70% השפעה, להוסיף 10 מעכבי סלע micromolar Y27632 לתאי גזע פלוריפוטנטים המושרה אנושי, ולחכות שעה לפני הניתוק. שאף את המדיה, ולשטוף את התאים פעם אחת עם PVS. נתק IPSCs על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ניתוק תאים בינוני לבאר, ודגר במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה, להוסיף 500 microliters של תאי גזע עובר מדיום לבאר. צנרת בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי לקבל השעיה תא אחד. לאחר מכן להעביר את התאים מנותקים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.Following צנטריפוגה, לשאוף את המדיום, ולנצל מחדש את גלולה התא עם מיליליטר אחד של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכבי ROCK micromolar.
לאחר ספירת התאים, הוסף פעמיים 10 ל- IPSCs החמישי לכל באר של צלחת מצופה בינונית GFR 12 היטב, ודגרה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאף את mTeSR פלוס לפני הוספת אנדודרם מוחלט, או DE, אינדוקציה מדיה. בימים שניים ושלוש, לשנות את התקשורת אינדוקציה DE.
ביום הרביעי, התחילו באינדוקציה של AFE על ידי החלפת מדיית אינדוקציה של DE במדיום בזאלי נטול סרום. שנה את AFE מדיום מדי יום למשך שלושה ימים לפני ניתוח יעילות AFE בסוף היום השישי. ביום השביעי, להפשיר מטריצת קרום מרתף GFR בינוני על קרח לשימוש מאוחר יותר.
בו זמנית, להמשיך עם בידול תא ריאות על ידי שאיפה של מדיה AFE ושטיפת בארות עם PVS. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לבאר ודגר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מדיה מרווה לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים.
שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. ודא שכל התאים מנותקים, אבל להעברתם לצינור חרוטי 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. הסר supernatant ו resuspend גלולה התא במדיה אינדוקציה LPC.
לספור את התאים, ולהוסיף 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים ל 100 microliters של מטריצת מרתף GFR קר מדיום, ולערבב היטב. מניחים טיפה לתוך באר של צלחת 12 טוב ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה LPC לכל טוב, להבטיח כי הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
ביום השמיני, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y27632. המשך לשנות את המדיה כל יומיים ולנתח את יעילות LPC בסוף היום ה-16. ביום 17, לשטוף בארות ולהוסיף 500 microliters של שני מיקרוגרם למיליליטר dispase.
פיפטה את תערובת dispase עם פיפטה P1000 ודגרה במשך 15 דקות, ולאחר מכן pipette את התערובת ודגורה במשך 15 דקות נוספות. לאחר הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה מרווה ל dispase המכיל בארות, ולהעביר את התאים לתוך צינורות חרוט. צנטריפוגה ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של PVS צונן, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה.
ואז resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיום ניתוק התא. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה צנטריפוגה שוב. Resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיה מרווה ומעכב 10 מיקרומולר רוק Y27632.
בצע ספירת תאים כדי לחשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג שמונה כפול 10 לתאים הרביעיים בכל באר. ואז aliquot נדרש נפח של אגרגטים תא LPC לתוך 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגות מיקרו, וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.הסר עודף supernatant מבלי להסעיר את גלולה התא, משאיר 10 microliters של מדיה שיורית. resuspend גלולה התא ב 200 microliters של מטריצת קרום מרתף GFR קר מדיום ולהעביר את התאים לתוספות קרום תרבית התא.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה אורגנויד תלת-ממדי לתא הבסולטרלי של ההוספה, והחליפו אותו במדיום טרי כל יומיים במשך שישה ימים. ביום 23, לעבור את המדיום להסתעפות 3D, ולאחר מכן לשנות את המדיום כל יומיים במשך שישה ימים.
ביום 29, עבור למדיום התבגרות תלת-ממדי, והמשיך להחליף את המדיום כל יומיים במשך ששת הימים הבאים. ביום הרביעי של אינדוקציה DE, תאים מחוברים להציג מורפולוגיה מרוצפת אבן קומפקטית. סמני אנדודרם סופיים CXCR4 ו SOX17 מצופה גרעין התבטא, המאשר בידול אנדודרמלי.
אינדוקציה מראש מראש אושרה ביום השביעי עם המורפולוגיה מראה תאים דחוסים יותר, ואת הסמנים FOXA2 ו SOX2 על גבי גרעינים. הדור של תאי ריאה תלת-ממדיים אושר עם כדורי תלת-ממד, והביטוי האנדוגני של NKX2-1 GFP בקו תא עיתונאי. לאחר שלושה שבועות של בידול לאורגנואידים של ריאות שלמות, סמני הריאות נותחו על ידי אימונוציטוכימיה.
סמנים עבור הסתעפות morphogenesis SOX2 ו SOX9 על גבי גרעינים נצפתה באורגנוידים. סמני ריאות פרוקסימליים P63 ו KRT5, שניהם סמנים של תאי בזאלי, זוהו בהצלחה יחד עם SCGB3A2, המהווה סמן לתאי מועדון. סמני ריאות דיסטליים המושרה סמני Pro SPC ו- SPB עבור תאי סוג II של כיפתנים.
וסמני HOPX של תאי סוג משופת I. בנוסף, NKX2-1 ו- ZO1 התבטאו בגרעין. סמני תאי הריאה של Mesenchyme PGFR Alpha, סמן לפיברובלסטים, שבא לידי ביטוי בשיתוף עם SOX9, ייצגו מזנשים דיסטליים.
וימנטין התבטא גם הוא ופוזר בכל הריאה. לאחר הליך זה, אורגנוידים ריאות ניתן להשקיע עם תאי גזע פלוריפוטנט המושרה המושרה אנדותל ותאי מערכת החיסון. התפתחות ריאות ומחלות מתרחשות על ידי איתות בין אוכלוסיות התאים האפיתל והמנשימאלי, אך גם מתאי אנדותל ומקרופות.
מערכת מודל רקמת ריאה תלת-ממדית רלוונטית קלינית לחקר מחלות האדם וטיפולים.
