Name: protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. פיתוח העובר Zygotic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר צמחי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Medicago truncatula סוג בר Jemalong או isogenic הקרוב, מאוד מחדש generable גנוטיפ Jemalong 2HA 13 (המכונה 2HA) בחממה עם photoperiod 14 שעות ו / 19 ° טמפרטורת יום / לילה C 23 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס פני השטח של קליפת הזרע (עם מחט G 23) לפני זריעת הזרע כך המים שהורשו להיכנס לזרע ולספוג במים למשך הלילה. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הזרע באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים 3 בכל סיר בקוטר 15 סנטימטר (כולל של 10 סירים) בתערובת שתילה (חול, פרלייט, קויר-כבול הגס (1: 1) בתוספת 5 גרם של תקן Osmocote מדויק:: 1 דשן שחרור איטי) והעברה ל חממה. שמור השתיל הבריא לאחר נביטה ולכן יש צמח 1 לסיר ולהקיף ידי סבכה למפעל נובע לטפס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמילי קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תרמילים מwסוג הכשרת היישוב Jemalong או 2HA להשיג שלבי עובר המוקדם המתאימים כמתואר 9 ראשון. הערה: שלבי התרמיל השונים מוצגים באיור 1 ושלבי עובר המקביל מוצגים באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השלבים השונים בתרמיל הקציר באמצעות קריטריונים לפי טבלת 1. מדוד את הזמן שחלף מהשלב 6 כדי לעזור שלבים נפרדים 6 ו -7 (טבלה 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ביציות מתרמילים ובדיקת שלב העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ביציות מתרמילים באמצעות מלקחיים עדינים לבד או מיקרוסקופ לנתח סטריאו ומלקחיים בהתאם לצורך. אם נדרש שלב העובר ניתן לבדוק במהירות באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שונה הפתרון של Hoyer מכיל 7.5 גרם מסטיק ערבי, 100 כלורל גרם, 5 מיליליטר גליצרול, 60 מיליליטר deionized מים מזוקקים. ממיסים על ידי ערבוב במשך 3-5 שעות או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך יותר לחדדמיקרוסקופיה ד לנקות את הביציות גזור ב15,16 הפתרון של Hoyer שונה. בזהירות להרים את הביציות ללא פגע ומקום בנפח קטן של הפתרון של Hoyer (מספיק כדי לכסות את הביצית) בטמפרטורת חדר עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה דגימות עם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה. ללכוד תמונות iwth מצלמה דיגיטלי 9 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביציות אחידות ביותר מאזור התרמיל המרכזי ולצבור את המספר הנדרש. דוגמא מוצגת באיור 3 א. לאסוף את הביציות על קרח ולאחסן בטמפרטורה הנדרשת (חומצות -80 ° C לגרעין) לניתוח נוסף. הערה: לפרטים על ניתוח סעיפים היסטולוגית, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים, וכלאה באתר אנא ראה ניירות 8,9. </li></ol></li></ol> 2. פיתוח העובר סומטי במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מ &#39; לא זן truncatulaכובע הוא מסוגל ליצור בקלות עובר בתרבות. לפרוטוקול זה לexplants העלה להשתמש בצמחי 2HA 13,17 שישנים 2-4 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עלונים מעלו trifoliate האחרון כמעט הרחיבו באופן מלא של גזע מתארך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העלים trifoliate על מגבת נייר לחה בסיר תרבות כדי למנוע התייבשות. הערה: לאחר העלים trifoliate נקצרים הם צריכים להיות מנוצלים עם עיכוב מינימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מדיום התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים באגר (0.8% w: V) ב9 סנטימטרים צלחות פטרי. הערה: 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים מורכב של מדיום בסיס P4 18 בתוספת 10 חומצת 1 מיקרומטר-naphthaleneacetic (NAA), 4 מיקרומטר 6-benzylaminopurine (BAP), 1 מיקרומטר חומצת abscisic (ABA) ו -5 מיקרומטר gibberellic חומצה (GA). השימוש בGA + ABA מאיץ היווצרות עובר וגורם לעליות מהותיות במספר עובר 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 בL 1; בהיקף של מלחים גדול (לעשות calciuמ &#39;עד בנפרד), מלחי קטין וויטמינים (לוח 3), ברזל chelated (לפצות בנפרד), casamino חומצות (hydrolyzate קזאין), 30 גרם סוכרוז, 8 אגר ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מניות חנות של מלחים גדול, סידן, חומצות casamino, מלחים ויטמינים וקטין ב -20 מעלות צלזיוס aliquots המתאים. אחסן ברזל chelated ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את ברזל chelated (200x) על ידי המסת 7.44 גרם של Na 2 EDTA • 2H 2 O בכ 900 מיליליטר של מים מזוקקים deionized תוך ערבוב, ואז להביא את הפתרון ל98-99 מעלות צלזיוס תוך הוספת 1.853 גרם של 4 FeSO • 7H 2 א &#39; לבסוף לעשות עד 1 ליטר כאשר המרכיבים מומסים. חנות בענבר צבעונית בקבוקים ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 עם פתרונות המניות כבטבלה 4. ההורמונים במדיום הם 10 מיקרומטר NAA, 4 BAP מיקרומטר, ABA 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר GA (ראה טבלת טבלה 4 וחומרים ספציפיים). הוסף את NAAוBAP לפני מעוקר ולהוסיף ABA וGA לאחר המעוקר וקירור לכ -55 מעלות צלזיוס, באמצעות עיקור מסנן עם 0.22 מיקרומטר סינון מצורף מזרק. מערבבים היטב על ידי מתערבל עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התקשורת לpH 5.8 עם 1 M KOH לפני מעוקר. החיטוי בC ° 121 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעוקר להוסיף ABA המסנן מעוקר וGA, ויוצקים כ 25 מיליליטר של תקשורת ל9 סנטימטרים צלחות פטרי סטרילי בזרימה למינרית או ארון Biohazard. מגניב ולתת את אגר קבע עם המכסה. ואז לשים על המכסה ולוודא שאין עיבוי על המכסה. תווית כנדרש ולאחסן ב 4 ° C (בקופסא קרטון כדי למנוע עיבוי מכסה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור של רקמת העלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בזרימה למינרית עיקור UV או ארון Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום משאיר לרשת הכדור של infuser אביב תה autoclaved בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את infuser תה המכיל את העלים ב -70% (v: v) אתנול ברחוב ללאסיר ture למשך 30 שניות. הערה: לכל השלבים בהליך זה משתמשים 250 מיליליטר בורג סירי תרבות פוליקרבונט כובע שautoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים ולאחר מכן להעביר ולטבול את רקמת עלה 1: 8 (v: v) אקונומיקה מדוללת (כלור 0.5%) במשך 10 דקות. מערבולת בעדינות מהעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את אקונומיקה ולהעביר את infuser התה בסיר תרבות המכיל מים מזוקקים deionized סטרילית. מערבולת בעדינות וניקוז מים עודפים. חזור עוד פעם אחת עם סיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עלים מinfuser התה עם מלקחיים סטריליות לסיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. ברגים בכובע סטרילי ולשטוף על ידי היפוך ומתערבל. השאר עלים צפים על המים סטריליים עד מוכן להכין explants. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה וציפוי Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, לקצץ עלונים מעוקרים בודדים מהקצה עם אזמל, וחתך את המלבן שנותר לשניים או thrEE explants המלבני (8-10 x 3-5 מ&quot;מ) עם אמצע הווריד במרכזו של כל explant (איור 5 א). הערה: הגודל של explant הוא די חשוב בייזום שפשף הראשון. לבצע את החיתוך על עפעפי סטרילי ממכלי מזון לקחת משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 6 explants במדיום התרבות-הגדילו את אגר ב9 מנות קוטר סנטימטר פטרי (איור 5). צלחת בצד abaxial explants למטה כדי לשמור על אוריינטצית עלה רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחות פטרי עם Parafilm (איור 5 ג) נמתחו סביב הצלחת. הרקמה מוכנה לדגירה עכשיו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בחושך על 28 מעלות צלזיוס בטמפרטורה מבוקרת חדר או ארון צמיחה לאורך כל תקופת התרבות. הערה: explants ייזום dedifferentiation, לעבור חלוקת תא, התפשטות (היווצרות יבלת) ועובר (בידול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת expla ההבחנהNTS לאחר 3 שבועות למדיום חדש. בתת-תרבות זו להעביר את כל explant בעזרת מרית סטרילי נירוסטה ומלקחיים, בזרימה למינרית או ארון Biohazard. כשפשפתי מתרחש והיבלת חורגת מהגודל של אחד הגדול באיור 5 ג, להעביר 50% מהיבלת בודדת כאשר subculturing למדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעוברים הראשונים בכ -4 שבועות. אמנם יש מידה מסוימת של תיאום, לאסוף שלבי עובר שונים על תקופת דגירה 4-8 שבוע (איור 6 א &#39;, ב&#39;). לאסוף תחת מיקרוסקופ לנתח ותהליך על פי מטרות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת-תרבות כל 3 שבועות ולהסיר עובר מעת לעת, כך שexplants ימשיך לייצר עוברים במשך 3 חודשים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

הפרוטוקולים שתוארו הם יחסית ישר קדימה ולאפשר חקירה של עובר קטניות עם כל התא העכשווי וטכניקות מולקולריות. אנו מכירים בכך שיש יתרונות וחסרונות של שני in vivo ובגישות חוץ גופית. שני לאפשר יותר דגש על עובר מוקדם בהשוואה לתרבות של זרעים בשלים 19. <p class="jove_content" style="...

קטניות הן המשפחה השלישית בגודלה של צמחים גבוהים עם כ -20,000 מינים ומשפחת בלאגאמינוסא (או Fabaceae) הם שני לדגנים באזור שנקטפו וייצור כולל 1. סויה היא היבול טיפח השלישי בגודלה. קטניות דגנים מספקות כשליש מחלבון תזונתי ושליש משמן צמחי למאכל אדם 2. קטניות עם קיבולת תיקונם N 2 גם לתרום למערכות חקלאיות ברות קיימא. Truncatula Medicago, כמו סויה, חלבון חנויות ונפט בפסיגים של הזרעים והוא מודל קטניות גנטי והגנומי עם משאבים גנטיים והגנומי רבים 3,4. בעוד מ &#39; truncatula אפשר התקדמות בהבנת הסימביוזה הקטניות-rhizobium 4 זה כבר מועסק יותר ויותר ללמוד ביולוגיה זרע קטניות 5-7 ועובר 8,9. עובר ארבידופסיס נחקר בהרחבה 10,11 אבל זה אניללא קטניות sa ואת הפרטים של עובר אינן זהות לMedicago 8,10. עובר Zygotic במ &#39; יש truncatula תכונות מעניינות, עם היפופיזה ייחודית רב-תאית, suspensor endoployploid ותא העברת בסיס 8. עובר סומטי (SE) משמש בדרך כלל לחידוש צמחים 12. במודל הקטניות מ &#39; truncatula, קו זרע Jemalong 2HA (2HA) פותח מההורה Jemalong יש שיעור גבוה של עובר גופני 13. לאחרונה מספר העוברים שיוצרו כבר עלה באופן מהותי על ידי הוספת שתי חומצת gibberellic (GA) וחומצת abscisic (ABA) למדיום הוותיק 14. במקרה זה GA ומעשה ABA בסינרגיה, שהוא יוצא דופן בהתחשב בכך שGA וABA בדרך כלל לפעול באיבת 14. העוברים המופקים מיבלת לפתח על פני השטח המאפשר לשלב של עובר להיות בקלות נקבע visually ונקטף בקלות. לאחר ליד קווי isogenic שembryogenic (2HA) ולא embryogenic (Jemalong) מאפשרת החקירה של עובר גופני ושיש שני in vivo ובמערכות מבחנה מספקת אפשרויות ניסויים שונות. הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחות עובר היא חיונית לזרע הבנה והתפתחות צמח. בקטניות, כמו בdicotyledons האחר, זה הפסיגים של העובר שלאחסן את המוצרים המשמשים לתזונת אדם. עובר מוקדם כרוך חלוקת תא מהירה, ודפוסי עובר נכונים. בכ 8 ימים לאחר ההפריה, מ &#39; עובר truncatula מגיע שלבים מוקדמים טבורית. אפיון מורפולוגי לא הצביע בדיוק על ידי ימים לאחר הפריה בתנאי חממה. לפיכך, גישה סטנדרטית יעילה כדי לציין את השלב של עוברים מתפתחים היא רבת ערך בלימוד regul הגנטיני של עובר zygotic המוקדם. במאמר זה, אנו מספקים שני פרוטוקולים סטנדרטיים לאסוף עוברים מתפתחים למחקרים ביולוגיים של עובר במודל הקטניות מ &#39; truncatula. הראשון הוא לאסוף עוברי zygotic ידי שיוך מורפולוגיה עובר ותרמיל ואילו השני הוא עובר גופני באמצעות explants עלה culturing לספק מספרי עובר גדולים לגשת בקלות.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Dissolve in small amount of ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Or similar, with suitable optics</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavable</td></tr></tbody></table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

עובר מוקדם החל מהזיגוטה תא בודדת עובר דרך חלוקת תאים מהירה והמורפוגנזה, ומאופיין מורפולוגית בשלבים טרום-כדורי, כדורי, לב, טורפדו וטבורית. פיתוח מתקדם זה הוא תחת הרגולציה ההדוקה של רשת מולקולרית מורכבת. קציר עוברים מוקדם מספיק בשלב דומה של פיתוח הוא חיוני לחקירת הוויסות התאית ומולקולרית של עובר מוקדם. זה לא פשוט מאז עובר מוקדם עובר המורפוגנזה מהירה בזמן קצר לדוגמא 8 ימים לMedicago truncatula להגיע שלב טבורית המוקדם. כאן, אנו מתייחסים לנושא בשתי גישות. הראשון קובע זיקה בין התפתחות עובר ומורפולוגיה תרמיל בסיוע מצביע על השלב של עובר zygotic. זה מבוסס בעיקר על מספר ספירלות תרמיל והפיתוח של עמוד השדרה. דרך חלופית כדי להשלים את in vivo שלtudies הוא באמצעות explants עלה culturing לייצר עוברים גופניים. הבינוני כולל שילוב הורמון יוצא דופן - אוקסין (חומצת 1-naphthaleneacetic), ציטוקינין (6-benzylaminopurine), חומצת abscisic וחומצת gibberellic. ניתן להבחין בשלבים השונים הצומחים מתוך היבלת ללא נתיחה.

למבני תרמיל zygotic עובר שונה המתאימים לשלבי עובר השונים מוצגים באיור 1 א - F ואילו שלבי העובר השונים מוצגים באיור 2 א - F. על ידי בחירת תרמילים באותו השלב, דגימות של ביציות שניתן להשיג אחיד למדי (איור 3 א). על ידי שימוש בעובר RT-qPCR ג...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Views.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Genetics

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

בידוד וגנוטיפ של עובר עכבר גסטרולציה לריצוף תא בודד

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Author Spotlight: צינור לניתוח עוברים מוטנטיים ספציפיים לשושלת ברזולוציה של תא בודד

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה