Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

עבודה זו בוצעה עם התמיכה של מענק, 5R21HD080684-02, מן המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם. המחבר מבקש להודות קן צ'ו שלו התלהבות ותמיכה מתמשכת. המחבר גם רוצה להכיר ברוס בלומברג לשימוש של המצלמה שלו, רבקה צ'רני, לקריאה ביקורתית של כתב היד, ואת שון מקנמרה, מרצ'ין Wlizla-המשאב הלאומי צפרדע רפואית (RRID:SCR_013731), עבור היקרה ערך שיחות בנוגע X. tropicalis האכלה, טיפול בבעלי חיים משטרי.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה אוניברסיטת קליפורניה באירוויין.
1. הערכות לקראת השתלת PGC
<ol><li>להכין כלי ניתוח מראש, כפי שתואר לעיל23. הערה: סכינים שיער הגבות משמשות ליצירת חתכים בסיועם של לולאה שיער כדי לייצב את העובר בעת ביצוע הניתוחים. שערות הגבה ולולאות שיער הם מודבקים לתוך זכוכית בורוסיליקט פסטר סיליקון זה קודם נמשכו ב להבה ושבר בחלק ורקמת (ראה איור 1A, ראש חץ) כדי ליצור קצר, צר יותר טיפ (איור 1B) עבור זריזות גדולה יותר בעת ביצוע ניתוחים.</li>
	<li>צור sgRNAs באמצעות הליכים שתואר לעיל24 . הערה: לזמן קצר, קצר תבניות DNA קידוד sgRNAs נוצרים באמצעות deoxyoligonucleotides חופפים המכילה 5' bacteriophage T7 היזמים, אשר הם annealed, "מילא" מאת פולימראז DNA ללא שגיאות, thermostable. במבחנה sgRNA סינתזה תגובות מודגרת למשך מספר שעות, למשך הלילה (בהתאם הערכה בשימוש). תגובות הן שטופלו DNAse כדי להסיר את התבנית. SgRNAs כבר טהור על ידי בשיטות הרגילות של פנול/כלורופורם החילוץ, אמוניום אצטט/אלכוהול איזופרופיל משקעים, על פי הוראות היצרן ערכת24.</li>
	<li>זמן קצר לפני ביצוע microinjections, להכין קומפלקסים Cas9-sgRNA הראשון denaturing ~ 250 ננוגרם של sgRNA ב 3 µL הנפח הכולל של נטול RNAse (שטופלו diethylpyrocarbonate) H2O ב- 60-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו קירור מהירה על קרח למשך 5 דקות. Centrifuge את sgRNA למשך כמה שניות, להוסיף 1 µL 1 µg/µL Cas9 החלבון, תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 ° C כדי לקדם היווצרות מורכבות. הערה: בעקבות זה דגירה, הצינור ניתן לשמור על קרח בעת הכנת העוברים microinjection.</li>
	<li>להשיג X. tropicalis העוברים על ידי במבחנה הפריה תוך שימוש בשיטות הרגילות, כפי שתואר לעיל25. מבטל את ג'לי25,26 העוברים על הפריה לאחר 10 דקות. הערה: זמן ההפריה נחשב הזמן אחרי ההשעיה זרע נוסף את הביצים ואת המנה מוצף 1/9thX של מארק ששינה רינגר (MMR)26. עבור X. tropicalis25, בניגוד X. laevis, לבצע את jellying דה ב- 1/9 x MMR המכיל 3% ציסטאין חינם בסיס (לא מלח HCl), pH להתאים ל- 7.8-8.0, ואחריו שוטף מרובים ב- 1/9 x MMR. להעביר את העוברים agarose (1%)-מאכל מצופה המכילה 1/9 x MMR בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר מיד את העוברים כדי להיות מוזרק כדי 1% מצופה agarose מנה המכילה 1 x MMR באמצעות פיפטה של פסטר.</li>
	<li>
להזריק בשלב 1-cell. ראה הפניות26,,27 , על תיאורים מפורטים של שיטות microinjection צפרדע רפואית .
	<ol>
<li>להזריק כל העובר באתר אחד בקוטב חיה, עם 4 nL של Cas9-sgRNA קומפלקס (הסכום הסופי = 1 ng של Cas9 ו פ ג ~ 250 של sgRNA; ראה הדיון)24. לאחר 10-20 דקות של הזרקת אתר ריפוי, להעביר את העוברים צלחת מצופים agarose המכילה 1/9 x MMR דגירה ב 25 º C. גם ליצור מנה של אחים uninjected עוברי אשר ישמש שתל נמענים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכינו צלחות פטרי (60 מ מ) המכילים של ~ 5 מ משכבה עבה של 1% agarose ב 0.3 x MMR, אם עושים השתלות X. tropicalis, או 1 x MMR עבור X. laevis.
	<ol>
<li>ליצור שקעים ~ 3-4 מ מ עמוק על-ידי הוספת 3-x 4-ובכן עובש (נוצר על ידי חיתוך צלחת PCR 96-ובכן) לתוך agarose מותכת כאשר מוזג את הצלחות (ראה איור 1C ו- D). החזק את התבנית מספר מילימטרים מעל החלק התחתון של הפטרי באמצעות מלחציים המצורפת עמדה הטבעת עד agarose שנוקשה.</li>
		<li>בנוסף, תעשה צלחת 24-ובכן העוברים הבודדים הבית על-ידי ציפוי הבארות עם שכבה דקה של 1% agarose ב 1/9 x MMR. הערה: המדיום תרבות נוספו הבארות הללו הוא x 1/9 ש-MMR בתוספת 50 µg של gentamycin סולפט/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. השתלת של PGCs
<ol><li>מתי העוברים פשוט להגיע Nieuwkoop, פאבר28 blastula שלב 9 (איור 2 א), ~4.5 h שלאחר ההפריה (hpf) עבור X. tropicalis, להסיר אותם מן החממה 25 ° C, לאפשר להם equilibrate לטמפרטורת החדר עבור נוספים 0.5 h.</li>
	<li>כדי להתחיל את השתלת בחמש hpf (איור 2B), להשתמש פיפטה פסטר להעביר אחד העובר התורם PGC (הזריק Cas9-sgRNA) למנה agarose 60 מ מ המכילים שקעים (שנוצרו בשלב 1.7) ב- 0.3 x MMR (או x MMR אם משתמש X. laevis). גם להעביר אחד העובר בין אחים uninjected, המטופל שתל, זה מאכל. הערה: זה קריטי כי זהותם של כל אחד העוברים האלה לא מבולבל.</li>
	<li>באופן ידני להסיר את המעטפות vitelline כל העובר באמצעות מלקחיים וסובב שני העוברים כך הפולנים vegetal שלהם הם בתצוגת ונגיש לניתוח. הערה: תיאור של דה-vitellination ידני של עוברי בעבר כבר את המתואר26.</li>
	<li>משתמש קצה הסכין שיער גבות חדה, להפוך ארבעה חתכים רדודים בצורת ריבוע על הקוטב vegetal של העובר הנמען, בתוך האזור שבו יהוו תאים בקבוק בעתיד המסמנות את blastopore. להפוך את החתכים על-ידי הוספת קצה הסכין שיער הגבה העובר, מתחת השטח, ולעשות כלפי מעלה עם פרוסות תנועות תוך ייצוב העובר עם הלולאה שיער. הערה: איור 2 מציג תצוגות פוליאותן של העובר במרווחי זמן חצי שעה מ- 4.5-7.0 hpf כדי להציג את גודל התא וכדי לספק מדריך עבור הערכת שבו התאים בקבוקים יהוו (עיגול לבן מקווקו). המטרה היא לעשות חתכים איפה הקופסה השחורה מקווקווים מציינים.</li>
	<li>פעם אחת מארבעת הצדדים של הכיכר מפורטים לפי חתכים, להעמיק בכל חתך עם הסכין שיער הגבות באמצעות תנועות חיתוך דומה כדי להגיע לעומק של 1/3 עד 1/2 המרחק על הרצפה blastocoel.</li>
	<li>לשחרר את explant רקמות פוליאותן של העובר הנמען (איור 3 א ו- B) על-ידי הפיכת אופקי (מקביל פני השטח צמחי) cut(s) באזור פוליאותן עמוק. הערה: גודל explant צמחי המכילות PGC הוא כ 0.4-0.45 מ מ בכל צד, 0.25-0.3 מ מ לעומק. זה explant פוליאותן של העובר הנמען אינו נחוץ עוד, ולכן יש להגדיר הצידה להיות מושלך.</li>
	<li>עובד מהר, חזור על הליך זה (שלבים 2.4-2.6) על העובר התורם PGC ליצור קטע רקמה פוליאותן בגודל דומה עבור השתלת. הערה: חשוב לבצע את זה דיסקציה השני עם השהיה קטן כדי למזער את הזמן העובר הנמען לרפא את הפצע פתוח.</li>
	<li>לאחר הרקמה המכילה PGCs יוסר העובר התורם, להשתמש הגבה שיער סכין והשיער הלולאה כדי להזיז את explant למקומן בפתיחה נוצר העובר הנמען. הערה: השטח הפנימי של שתל הפנים של התורם חייב להיות מול הפנים של העובר הנמען. . זה לא הכרחי להתאים את כיווני של הצירים הגבי הגחוני / ו משמאל של השתל עם העובר הנמען.</li>
	<li>השתמש האורכי של מוט של הסכין שיער הגבה, שנערך במקביל פני השטח של השתל, ללחוץ בעדינות את השתל לתוך הפתח השטח פוליאותן של העובר הנמען.</li>
	<li>לאחר השתל הושם, להשתמש hairloop או מוט של הסכין שיער גבות להחליק בעדינות "הגופה" של העובר התורם על פני השטח agarose ולתוך של דיכאון agarose. ודא כי הפצע הפתוח של הגופה פונה הנוזל בכמות גדולה. אם לא, להשתמש בסכין שיער הגבה כדי לסובב את העובר כדי להשיג את הכיוון הזה.</li>
	<li>להחליק העובר הנמען, עם השתל ריפוי במקום, בדיכאון סמוכים וודא באופן דומה כי הרקמה המושתל vegetal הקוטב פונה הנוזל בכמות גדולה.</li>
	<li>חזור על הליך זה (2.1 שלבים-2.11) באמצעות זוג נוסף של התורם ואת עוברי הנמען כדי ליצור זוג נוסף של השתלת/קארקאס; . להעביר אותם שקעים ריק. הערה: זה קריטי כי אחד גורם סימונים כדי לעקוב אחר זוגות תואמים של פגרי ו מניבי השתלת העוברים. הגוויות התורם ישמש כמדד עבור היעילות של Cas9-sgRNA-induced מוטגנזה מכוונת ב PGCs מושתל, אשר לא יכול להיות בקלות לבדיקה עד החיות מניבי להשתלה מגיעים לבגרות מינית (ראה שלב 3.3, להלן, ו את הדיון ).</li>
	<li>המשך ביצוע השתלות עד העוברים מגיעים כ מוקדם הבמה gastrula 10, אשר כ 6.5 hpf ב- X. tropicalis (ראה איור 2E).</li>
</ol>3. פוסט-ריפוי על העוברים
הערה: שתלים לרפא למקומו בתוך ~ 30 דקות, זה נורמלי לצפות כמה פסולת yolky פירוק התא מקרין מן העובר (איור 3C).
<ol><li>
לאחר החלימו, משתמשת פיפטה של פסטר בעדינות העברת העוברים מן שהמפלצת כדי בארות בודדים של צלחת 24-ובכן מצופים agarose. תפליט יהיה להסירו (איור תלת ממדי) על ידי נוזל ערבוב במהלך ההעברה.
	<ol>
<li>לסובב את העוברים, כך הם ממוקמים פוליאותן מוט למעלה, מול הפתרון בצובר. שוב, למקם את הגוויות התורם, להשתיל נמענים בבארות סמוכים כדי לסייע שמירה על מסלול של זוגות העובר; לתעד מידע זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הצלחת 24-ובכן המכיל העוברים אל חממה 25 ° C לתרבות לילה. הערה: למחרת, העוברים הגיעו tailbud בשלבים.</li>
	<li>להעביר לנמענים שתל לנקות 6-ובכן צלחות מצופה agarose המכיל x 1/9 ש-MMR בתוספת 50 µg של gentamycin סולפט/mL, עם העובר 1 לכל טוב. לשמור על תיעוד ברור של פגרי התורם התואמים את אלה להשתיל נמענים.</li>
	<li>כדי להעריך את יעילות מוטגנזה מכוונת על ידי רצף ה-PCR amplicons5,17,24 או בשיטות אחרות המסתמכות על PCR amplicons (ראה את הדיון), להעביר הגוויות בודדים 0.2 מ"ל רצועת המבחנות. להסיר את מרבית המדיום, homogenize 100 µL פירוק מאגר24 המכיל proteinase K (PK) על ידי חזר שיהיה pipetting באמצעות פיפטה P200.</li>
	<li>לבצע פירוק העובר24 ב 56 ° C עבור 6-אייץ ' ללון כדי לאפשר עיכול PK. בטל PK על ידי חימום זה 90-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו קירור מהיר עד 4 ° C. השתמש lysates ללא יותר ניקוי מדרגות כדי להפיץ את תגובות PCR כדי לקבל amplicons קצר עבור רצפי DNA סנגר ישירה24. לאחסן את lysates ב-20 ° C. הערה: תוך מספר ימים, הראשנים יגיע האכלה שלבים (כ שלב 45-46), יכולים להיות מוזנים השעיה של אבקת פלנקטוניים (סרה מיקרון).</li>
	<li>אחרי שבוע ~ 1, בשינויים יומי של תרבות מדיום כדי לשמור על ניקיון ולצמצם את יתר מיקרוביאלי, להעביר ראשנים טנקים קטנים במערכת הימית במחזור בתזרים בטפטוף. להשתמש בנתונים רצף הפרדת ראשנים עם PGCs יעילה מאוד mutagenized של ראשנים ביעילות מוטגנזה מכוונת נמוך יותר. לאחר המטמורפוזה הושלמה, להעביר froglets את המערכת הימית למבוגרים במעבדה. הערה: משטרי שפותחה על-ידי המשאב הלאומי צפרדע רפואית (המעבדה לביולוגיה ימית, חור וודס, MA) מספקים מדריך ראשן האכלה29 וצפרדע למבוגרים תחזוקה30.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

דוח זה מספק את פרוטוקול מפורט עבור השתלת רקמת צמחי המכיל PGCs. השתלת של PGCs נמצא בשימוש בשילוב עם טכנולוגיות לעריכת הגנום (לדוגמה, CRISPR/Cas9) כדי לשנות את germline של חיה בזמן שמירה על כמעט את כל הרקמות סומאטית שלה כסוג הפרוע גנטית. עבור קפיצת מדרגה מוצלח, ישנם מספר גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון ?...

איך מקודד גנוטיפ פנוטיפ כבר שאלה גדולה בביולוגיה מאז גילויה מחדש של חוקי מנדל. הבנה של התפקידים של גנים, רגולציה שלהם ואינטראקציות בתוך רשתות ג'ין, הפונקציות של מוצרים מקודד הבטחות כדי לספק כלים עבור חשיפת ביולוגיה חדש ועם מצבי מחלה ameliorating. במשך יותר מחצי מאה1, הצפרדע שנחטף ייזרק אפריקאי, צפרדע רפואית, כבר דוגמנית מובילה ללימודי במגוון רחב של נושאים בסיסיים בביולוגיה, וההתערבות, כולל הבקרה הגנטית של פיתוח. מבחינה היסטורית, רוב המחקרים על צפרדע רפואית השתמשה הצפרדע allotetraploid, X. laevis, אך לאחרונה, בשל diploidy שלה, X. tropicalis פותחה כמודל גנטי דו-חיים. רצף הגנום המלא יש הורכב מ2,שני מינים צפרדע רפואית 3. "קהילה צפרדע" הוא עכשיו נקודת מפנה שבו הגנום בסיסי שינוי הטכנולוגיה מאפשרת המחקר של תפקוד הגן, כמעט כרצונו. Endonucleases CRISPR/Cas9 לתכנות הפכו את מוטגנזה מכוונת של גנים יעילים ביותר, עם biallelic מוטציה אפשרית בתאים רוב של בעלי חיים4,5,6,7, 8,9,10,11. מחקרים אלה, על-ידי Bhattacharya. et al. 12 ו. Shigeta et al. 13, הראו כי הפונקציה של גנים רבים ניתן יהיה ללמוד על ידי מוטגנזה מכוונת בבעלי פסיפס של F0 . גישה זו יש יתרונות רבים; עם זאת, Cas9-sgRNA-microinjected עוברי מוצג לרוב פנוטיפים משתנה בשל אובדן לא שלם של פונקציה (LOF). יותר באופן משמעותי, של קווים מוטציה הדור יש יתרון מאוד עבור יישומים מסוימים — בפרט לומדים גנים בעלי תרומה mRNA אימהית. MRNAs האימהי ואת החלבונים והשפעות שלהם על אפיגנטיקה, נמשכות לתקופה ממושכת לתוך מופרה14,15,16, מתן תרומות התפתחותי מוקדם של גנים רבים חסיני אש ל F0 ניתוחים. לכן, גישות אחרות LOF נדרשים.
כאשר המבקשים ליצור קווים מוטציה, הדרך להשגת עוברי LOF homozygous יש מספר מכשולים. מוטגנזה מכוונת הראשון, יעיל לייצר מוטציות biallelic יכול להיות חסרון כי אובדן של גנים חיוניים פונקציות התוצאה היא כשל כדי לשרוד עד לבגרות מינית, הפרעה בייצור קו קיימא. פתרון משותף הוא טיטרציה זהירה של כמות Cas9-sgRNA משלוח. כאן, המטרה היא להשיג איזון בין הפחתת lethality תוך מיקסום גם germline מוטגנזה מכוונת יעילות. בעיה נוספת נובעת ערכת גידול רגיל, איפה ניתוחים פנוטיפי הם נדחים עד הדור2 F. באמצעות גישה סטנדרטי, בוגרת מינית F0 חיות המעבירים מוטציה אללים דרך germline הם outcrossed כדי לייצר F1 "שירות heterozygous", אשר לאחר מכן גדלים לבגרות מינית. שני F1 heterozygotes הם intercrossed ואז לייצר F2 עוברים מוטציה בתדר Mendelian הצפויה של 25%. לכן, שני דורות של רבייה נחוצים לצורך ניתוח של פנוטיפים מוטציה. חיות יכול להיות homozygotes או תרכובת heterozygotes (קרי, כשהיא המכיל שני אללים mutant שונים, תלוי אחרים של החיות הורים המשמשים את intercross1 F).
מכשולים אלה ניתן להתגבר על ידי כליאת לתכנות בתיווך נוקלאז מוטגנזה מכוונת לתאי נבט, המונחת שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה17. קפיצת מדרגה מכיל שני רכיבים מרכזיים: (1) microinjection של mRNA Cas יחד עם sgRNA, או קומפלקסים נוקלאז-sgRNA (או, עקרון, TALENs או אבץ אצבע nucleases) בשלב תא בודד כדי ביעילות mutagenize הגנום העוברי, ואחריו (2) השתלת של PGCs לתוך wildtype עוברי אח, איפה PGCs אנדוגני הוסרו. ניתן להשיג בשני שלבים את מועד החלפת germline יעילה, להשלים עם מוטציה בתאי הנבט. Blackler הפגינו בשנות ה-60 המוקדמות כי יכול להיות מושתלים צפרדע רפואית PGCs בין עוברי-neurula מאחר מוקדם tailbud שלבים18,19. עבור קפיצת מדרגה, הגישה של Blackler שונתה על-ידי ביצוע של השתלות על הבמה blastula17, כאשר PGCs מותאמים במוט vegetal20,עובר21. השתלת לפני gastrulation יש שני יתרונות עיקריים. קודם כל, engraftment של השתלות, להתפתחות תקינה לאחר מכן נמצאה כדי להיות יעיל יותר כאשר השתלת מבוצע בשלב blastula (שלא פורסמו תצפיות). שנית, על ידי ביצוע השתלות blastula-שלב זמן קצר לאחר תחילת שעתוק zygotic, אחד לא יכול למנוע את הקטלניות הנובעים ג'ין התפתחותית מוטציות לשבש gastrulation או אחרת להוביל neurulae מאוחר בעלת מבנה פגום. עוברי ("עד") השתלת מניבי PGC בוגרים לבגרות מינית, intercrosses בין בעלי חיים אלה F0 הדגימו כי, במקרים רבים, 100% צאצאים1 F להציג את פנוטיפ LOF (רוב להיות מורכבים heterozygotes), המציינת את החלפת germline להשלים עם מוטציות יישוב.
הוא צפוי כי קפיצת מדרגה נאיץ את גישות גנטיות בצפרדע רפואית. קפיצת מדרגה גם מספק אלטרנטיבה שיטת "לארח העברה"22 לניתוח LOF של גנים אמהי-אפקט (שלא פורסמו תצפיות). בפרסום הנוכחי, מוצג תיאור מפורט של השיטה, במיוחד התמקדות PGC ההשתלה, X. tropicalis (עם שינויים מזעריים עבור X. laevis). ההשתלה של PGCs הוא הפגין כאן כדי להקל על העברה מהירה יותר של טכנולוגיה זו למעבדות אחרות לעבוד עם צפרדע רפואית. עקרונות שיטה זו צריכה להיות מוצלחת דו-חיים אחרים (למשל, urodeles), וגם שינויים האורגניזם הספציפי של המתודולוגיה צריכה מאפשרים ליישום חיות רבות אחרות שבהן מוטגנזה מכוונת יעיל יכול להתבצע, PGCs הם ברצון שיפותחו.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

היצירה של מוטציה שורות על-ידי עריכת הגנום מאיצה ניתוח גנטי של אורגניזמים רבים. CRISPR/Cas9 שיטות הותאמו לשימוש באפריקה שנחטף ייזרק צפרדע, צפרדע רפואית, אורגניזם מודל ארוכת שנים המחקר הביו-רפואי. רבייה מסורתיים ערכות ליצירת קווים מוטציה homozygous עם CRISPR/Cas9-ממוקד מוטגנזה מכוונת יש מספר שלבים ההגדרה המפורטת. כדי להקל על יצירת עוברים מוטציה, במיוחד כדי להתגבר על מכשולים הקשורים לדפוק גנים חיוניים מופרה, פותחה שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה. טכניקה זו ממנפת את היציבות של עוברי צפרדע רפואית כדי "גזור והדבק" שיטות embryological. קפיצת מדרגה מנצל את העברת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) מעוברים התורם mutagenized ביעילות לתוך wildtype PGC ablated אחים. שיטה זו מאפשרת המוטציה יעיל של גנים חיוניים על-ידי יצירת חיות chimeric עם תאים סומטיים wildtype שנושאים germline מוטציה. כאשר שתי חיות F0 נושאים "" קפיצות חמור "השתלות" (קרי, מוטציה בתאי הנבט) הם intercrossed, הם מייצרים homozygous, או מתחם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, null F1 עוברי, ובכך לחסוך זמן דור מלא כדי לקבל נתונים פנוטיפי. קפיצת מדרגה מספק גם גישה חדשה לניתוח אפקט אימהי גנים, אשר הם דברים מעוותים F0 פנוטיפי ניתוח בעקבות מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9. כתב יד זה מפרט את שיטת קפיצת מדרגה, עם דגש מיוחד על איך לבצע בהצלחה השתלת PGC.

בעקבות ההשתלה, הקביעה איכותי יעילות של CRISPR/Cas9 מוטגנזה מכוונת צריכה להתבצע לפני משקיעים את המאמץ של גידול בעלי חיים לגדול ולשמור את החיות לבגרות מינית. מאחר חיות נושא השתלות קפיצת מדרגה הן תחושתיים wildtype germline קשה לגישה ישירה מעבדתיים, להציל את הגוויות העובר התורם הופכת לחש...

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Views.  University of California, Irvine. גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתל...

Video: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ומניפולציה

כמו תא גזע

שיבוט פונקציונלי שימוש