Name: derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

אנו מודים יונתן לוקאס לסיוע טכני שלו עם תרבית תאים מזין, Servei Estabulari de la UAB עבור טיפול בבעלי חיים, מרטין Domènec עבור הקלטת הוידאו. עבודה זו היא נתמכה על ידי y Ministerio דה Economia Competitividad AGL2014-52408-R ו- Generalitat דה קטלוניה 2014 SGR-524. MVC הוא המוטב של מלגת PIF-UAB.

השימוש של בעלי החיים המתוארים בסעיפים שלהלן אושרה על ידי ועדת האתיקה על חיות והמחקר האנושי של ברצלונה דה Autònoma Universitat ועל ידי Departament d &#39; פסקה חקלאיות וציוד, Ramaderia, אני Alimentació של Generalitat דה קטלוניה (פרוטוקול #8741).
 1. מזין תאים איון ואחסון הערה: העורלה האנושי fibroblasts (HFF-1) היו בעבר קפוא 1 מ"ל של הקפאה פתרון בהיקף של 90% סרום שור עוברית (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד ( דימתיל סולפוקסיד) והם מאוחסנים חנקן נוזלי עד שימוש.
<ol><li>להפשיר בקבוקון קריוגני HFF-1 (1 מ"ל) במועט המבחנה באמבט מים 37 ° C.</li>
	<li>להוסיף את תכולת המבחנה קריוגני המופשרים ומחוממת מראש Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לעשות 1:10 דילול.</li>
	<li>זרע התאים מדולל (10 מ"ל) בבקבוקון T75 ואת תרבות אותן ב- CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>למחרת, לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>תרבות HFFs את ולשנות את המדיום כל 48 שעות עד התרבות מגיע השלב confluent. פעולה זו עשויה להימשך כ- 7 עד 10 ימים.</li>
	<li>להכין את הפתרון איון, לדלל מיטומיצין C ב- DMEM בתוספת 10% FBS-ריכוז סופי של 10 µg/mL. דגירה התאים עם הפתרון איון עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.</li>
	<li>להסיר הפתרון איון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) כדי לסלק שאריות מיטומיצין C.</li>
	<li>כדי לנתק את התאים מוחלש, להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA ומחוממת מראש ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהן מנותק (10 x המטרה עם מפתח נומרי או נה 0.3). אם הם לא, דגירה אותם במשך עוד כמה דקות-CO 37 ° C ו-5% 2. בדוק את התאים שוב תחת המיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>Pipette את הפתרון עם פיפטה פסטר על מנת לבטל כגיהנום תא.</li>
	<li>לנטרל את הפתרון אנזימטי על-ידי הוספת 4 מ ל בתוספת 10% FBS ו resuspend DMEM.</li>
	<li>לקחת את aliquot של התליה תא ולעשות לדילול בטחונות ב- HBSS. כדי לקבוע את מספר התאים, טען µL 10 של הדילול נויבאואר &#39; s קאמרית. לספור את התאים הממוקם באחד הריבועים הגדול של התא תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 x המטרה עם נה 0.45).
	<ol><li>לחזור על הספירה סך של ארבעה ריבועים גדולים. לחשב את המספר הכולל של תאים (N) כמו N = מספר ממוצע של תאים ספרתי x הנפח הכולל x דילול x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuge לשאר המדגם למשך 5 דקות ב 200 x ג' להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מקפיא פתרון ריכוז 10 6 תאים לכל mL-</li>
	<li>Aliquot התליה של מבחנות הקפאה עם 10 6 תאים (1 מ"ל) כל. מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכל ההקפאה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	<li>למחרת, לאחסן את הבקבוקונים הקפאה בחנקן נוזלי.</li>
</ol> 2. תרבית תאים מזין <ol><li>1-4 ימים לפני התחלת תהליך נגזרת, הפשרה בקבוקון קריוגני המכיל 1 x 10 6 להשבית HFF-1 תאים בתוך אמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לגרום לדילול 1:6 המופשרים HFF 1-מראש חימם DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור הטמפרטורה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מלא בכל טוב של צלחת 4-ובכן עם 500 µL של ג'לטין מראש ומחוממת 0.2% מן העור חזירי ולשמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות</li>
	<li>להסיר את µL 500 של ג'לטין מן הבארות ולהוסיף 500 µL של דילול HFFs. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות אחידה של HFFs על החלק התחתון של הבארות. להימנע בתנועות סיבוביות, אחרת התאים יתרכז במרכז הבאר.</li>
	<li>דגירה את הצלחת לפחות 24 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי להשיג של טפט של HFFs לא מופעל כל היטב.</li>
	<li>למחרת, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה (10 X המטרה עם נה 0.3) ולבדוק כי הם מחוברים, homogeneously מבוזרת. לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 500 µL של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
</ol> 3. אוסף העובר ותרבות <ol><li>4 ימים לפני אוסף העובר, לנהל 5 IU של סוסה הרה &#39; s גונדוטרופין סרום בזריקה בקרום הבטן לעכברים נקבה שבוע 6-12. 
	הערה: השתמשנו נקבות 129S2 או זנים B6CFAF1, למרות נקבות מפני זנים אחרים העכבר יכול לשמש. ובכל זאת, כאשר עובדים עם הנקבות ממתירני זנים (למשל כקבוצת), בינוני יש להשלימה עם 2i כאמור בשלב 4.2.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, לנהל 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי על-ידי הזרקת בקרום הבטן, חבר הנקבות עם גברים, זקנים, ביחס של 1:1 לפחות 8 שבועות. להפריד בין הנקבות מן הזכרים למחרת.</li>
	<li>יום לפני איסוף העובר, להכין תרבות 35 מ מ תא צלחת פטרי עם מספר 40 טיפות µL בינוני KSOMaag בתוספת 4 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), למלא את הצלחת עם שמן מינרלי כדי כיסוי מלא הטיפות. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי equilibrate של המדיום.</li>
	<li>להכין את העובר מניפולציה פיפטות, מחממים את חלק רזה זכוכית ארוך שקצהו פיפטה פסטר באמצעות מבער בונזן. ברגע רכים, מסירים אותה מן הלהבה ו להפריד את שני הקצוות. לשבור את זה עד לאורך הרצוי. הקוטר הפנימי בקצה צריך להיות 100-150 מיקרומטר.</li>
	<li>המתת חסד העכברים נקבה על ידי נקע בצוואר הרחם 45-48 h פוסט-coitum (p.c.).</li>
	<li>לנתח העכברים לחשוף את חלל הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים חדות מעוקלים חלקה ו של הצפק עם מספריים חדות ישר. תפוס את הרחם אחת עם מלקחיים, לחתוך את oviduct באמצעות מספריים חדות ישר, ולמקם אותו בינוני (HCZB) CZB Hepes באגירה 13-37 ° C. חזור על התהליך כדי להסיר את oviduct אחרים.</li>
	<li>סומק oviducts עם מזרק 1 מ"ל עמוסה HCZB שנערך במקום על ידי שען מלקחיים כדי לאסוף את העוברים 2-תא. 
	הערה: כדי להכין לקחת מחט שטיפה מחט תת-עורית 30 גרם, לחתוך את הקצה על הקרקע עד קצה קהה על אבן שוחקים.</li>
	<li>באמצעות המנגנון פיפטה בפה, לאסוף את העוברים, לכבס אותם במים HCZB, תרבות אותם בצלחת תרבות העובר מוכן קודם לכן ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד לשלב הבלסטוציסט. עד 50 עוברי יכול להיות בתרבית בתוך כל טיפה 40 µL. לעקוב אחר התפתחות העובר בכל 24 שעות תחת stereomicroscope. 
	הערה: לחלופין, העוברים ניתן לאסוף בשלב הבלסטוציסט כדי לקצר במבחנה העובר תרבות. במקרה זה, המתת חסד הנקבות ביום 3.5-4.5 p.c., לנתח את הרחם. מדובר עם HCZB.</li>
</ol> 4. תא גזע נגזרת <ol><li>הכנה של הלוחות נגזרת <ol><li>ביום של העובר זריעה, להכין המדיום נגזרת על ידי שכשהם DMEM בינוני עם 100 מיקרומטר 2-β mercaptoethanol, 1 x חומצות אמינו שאינם חיוניים , 20% של החלפת סרום ו- 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>במידת הצורך, גם להוסיף 1 מיקרומטר של המדכא MEK PD0325901 ו-3 מיקרומטר של המדכא GSK3 CHIR99021 כדי לקבל מדיום 2i.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן עם טפט של HFFs מוחלש (שלב 2.6) מ חממה. להסיר את המדיום ולהוסיף µL 800 נגזרת מראש ומחוממת בינוני כל טוב. להחזיר את הצלחת החממה.</li>
	</ol></li> <li>העובר זריעה וניקוי Zona pellucida <ol><li>הכנת תרבית תאים של 35 מ מ צלחת פטרי עם µL 30 שלוש טיפות של Tyrode חומצי &#39; s פתרון 14 ו- µL 30 שלוש טיפות של גזירת בינוני. לכסות את הטיפות עם שמן מינרלי ולשמור את המנה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קח את הצלחת תרבות העובר מן החממה. אחד אחרי השני, להעביר blastocysts את הטיפות התרבות Tyrode חומצי &#39; s פתרון טיפה באמצעות פיפטה מניפולציה של העובר. אם אפשר, בחר רק את blastocysts מורחבת כדי להתחיל את תהליך הערכת.</li>
		<li>לפקח על העיכול zona pellucida תחת stereomicroscope. ברגע pellucida zona נעלמת, להעביר את הבלסטוציסט ירידה בינונית נגזרת על מנת לשטוף את Tyrode חומצי &#39; פתרון s.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן נגזרת מן החממה ואת זרע אחד נטול zona הבלסטוציסט במזין תאים היטב לכל.</li>
		<li>להחזיר את הצלחת נגזרת 4-ובכן חממה והתרבות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	</ol></li> <li>בינוני וצמיחה של תאי גזע ניטור לשנות <ol><li>לפקח על התרבויות כל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 X המטרה עם נה 0.45). חשוב לשים לב אם קיימים סימנים של התמיינות תאי גזע, כגון נפוחות השבירה תאים המקיפים את תוצר או אפילו שדחקו את המזין תאים הצידה.</li>
		<li>בכל יום אחר, לשנות את המדיום של התרבות. לוקח את הצלחת 4-ובכן מן החממה, להסיר את המדיום מכל קידוח ולהוסיף µL 800 בינוני נגזרת מראש ומחוממת עם LIF ו- 2i, אם נעשה שימוש. לשמור על התרבות עד outgrowths שנצפו (6-8 ימים).</li>
	</ol></li></ol> 5. תא גזע תרבות ותחזוקה <ol><li>הכנת Kolle כמו ידיות, פיפטות מניפולציה תאי גזע. בצע צעד 3.4 להכין את תאי הגזע פיפטות מניפולציה בקוטר הפנימי בקצה של 250-300 מיקרומטר. השתמש החלק השני של פיפטה פסטר משך כדי להכין את הידית, כמו Kolle. מחממים ולעצב אותו עד קבלת וו.</li>
	<li>לוקח את הצלחת. ובכן 4 תרבות מתוך החממה ואתר את תוצר תחת stereomicroscope. להשתמש בידית כדי להרחיק את התאים הבדיל ומזינים את המקיפים את תוצר. 
	הערה: כדי להימנע בסופו של דבר הבידול של תוצר, חשוב להסיר את כל התאים הבדיל מהקצה של תוצר.</li>
	<li>וארוקן את תוצר עם פיפטה מניפולציה תאי גזע ולמקם אותו תבשיל חדש בטיפה טריפסין-EDTA 50 µL-</li>
	<li>השימוש באזמל לחתוך את תוצר בכמה חלקים על מנת disaggregate זה מכנית והן enzymatically.</li>
	<li>מיד, להעביר את שברי תוצר לתוך טיפה טריים של גזירת בינוני לנטרל טריפסין פעולה.</li>
	<li>להעביר השברים תוצר צלחת 4-ובכן חדשה עם טפט של מזינים. להעביר עד 10 קטעים מפוצלים טוב ואת תרבות אותם עם נביעה בינוני-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לשמור על התרבויות תאי גזע דמוי לפחות שישה שבועות לפני בהתחשב הקו mESC הוקמה. לשנות המדיום. כל יום, תת-תרבות אחרים אותם פעם בשבוע.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li><li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer.">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+and+techniques+for+mouse+embryonic+stem+cell+derivation+and+culture.">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells.">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li><li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+(ES)+cell+lines.">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li><li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות mESC קו נגזרת היא הליך ידועים בשימוש שגרתי במעבדות רבות, היעילות שלה אינה גבוהה כמצופה לאור הגורמים מרובים יכולים להפריע pluripotency תחזוקה תמיד. במאמר הנוכחי אנו מציגים, צעד אחר צעד, כיצד להקים קווי mESC עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוטה ואמינה. היעילות אלה דומים לאלה שדווחו בספרות.
<p...

תאי גזע עובריים (ESC) הם תאים pluripotent נגזר של עוברי, אשר לשמור על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים1. בהתבסס על מאפיינים אלה, ESC הפכו להיות כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית מידול המחלה, לימודי הנדסת רקמות2.
ESC נשאבו בפעם הראשונה מעוברים עכבר של, שמקורם קווים העכבר ESC (mESC) עם3,הצלחה נמוך4. במשך שנים, היעילות נגזרת נשאר נמוך בשל הקושי של שמירה על pluripotency חוץ גופית בתוך. חוץ מזה הנוכחות של מזין תאים5, אשר לשפר את יעילות נגזרת, לקדם את המושבה המצורף, לשפר את יציבות karyotypic6, מספר שינויים ההפניה פרוטוקול על שיפור בתחזוקת pluripotency. החשוב ביותר היה התוספת של לוקמיה מעכבים מקדם (LIF) mESC תרבות בינוני7,8, השימוש של העוברים רקע מתירניות 129S29 ומוגדר התרבות של mESC בינונית בתוספת סרום, ללא פוטנציאל התמיינות גורמים10. לאחרונה, ראיות משכנעות הראו כי תוספת של קוקטייל של שני מאפננים מולקולה קטנה של איתות המסלולים למדיום תרבות mESC (המכונה 2i) הוא הטוב ביותר לשמור על pluripotency. 2i קוקטייל כוללת שילוב של החומר המדכא MEK PD0325901, אשר מפחית את האותות בידול על ידי עיכוב מסלול מופעל mitogen חלבון קינאז (MAPK), החומר המדכא GSK3β CHIR99021, אשר משפר הישרדות cell-צפיפות נמוכה על ידי הפעלת מסלול ונ ט11.
במאמר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ביעילות לנבוע mESC קווים העכבר blastocysts. אנו עוקבים אחר הליכים סטנדרטיים, culturing העוברים מן מתירניות זני מזין בתאים נגזרת בינוני עם LIF, החלפת סרום12. בעקבות זה לפרוטוקול, שורות mESC יכולות לנבוע עם היעילות מקבילה לאלו שהושגו 2i בינוני. למרות זאת, ניתן להוסיף 2i כדי למנוע בעיות אפשריות עם pluripotency תחזוקה או בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode&#039;s solution&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&amp;ordm;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&amp;ordm;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &amp;alpha;SMA and AFP mouse antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&amp;ordm;C. Aliquot and store at -20&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>304000</td><td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;10828-028</td><td>Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&amp;ordm;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&amp;ordm;C and 5% CO2 a day prior to use.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo tested. Photosensitive.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&amp;ordm;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &amp;beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&#039;s serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td></tr></tbody></table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

העכבר בתאי גזע עובריים (mESC) נגזרת הוא התהליך על ידי pluripotent אשר נקבעו שורות תאים מעוברים. קווים אלה שומרים על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, mESC הם כלי שימושי ב רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולימודי הנדסת רקמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט להשיג mESC קווים עם יעילות גבוהה נגזרת (60-80%) מאת culturing blastocysts מן העכבר מתירניות זני מזין בתאים במדיום מוגדר עם לוקמיה מעכבות פקטור. הפרוטוקול ניתן גם ליישם ביעילות שואבים mESC קווים העכבר מתירני זנים, תוספת פשוטה של קוקטייל של שני מעכבי מולקולה קטנה למדיום נגזרת (2i בינוני). הליכים מפורטים על ההכנה ועל התרבות של תאים מזין, איסוף של תרבות של העכבר עוברי, נגזרת של התרבות mESC קווים הינם מסופקים. פרוטוקול זה אינו מצריך ציוד מיוחד, יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם מומחיות תרבות בסיסיים בתרבית של תאים.

בעקבות פרוטוקול זה, מעל 95% תוצר היווצרות צריך להיות מושגת לאחר השבוע הראשון של תרבות (איור 1 א'). הקמת קווי mESC לאחר 6 מעברים הוא משתנה בין משכפל ניסיוני, עם הצלחה ממוצע של 60-80%. התוספת של 2i לא באופן משמעותי לשפר את התוצאות בעת עבודה עם עכבר מתירניות זנים, כגון אל...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biology

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video