Name: growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

אנו מודים לחברי הווה ובעבר של המעבדה רובינשטיין למתן סביבת מחקר תומכת ונלהבת. אנו מודים ריאן ט גיבסון לסיוע בפרוטוקול אופטימיזציה. אנו מודים למארק Hochstrasser (אוניברסיטת ייל) ודיטר וולף (Universität שטוטגרט) לזני שמרים ופלסמידים. אנו מודים למבקרים האנונימיים שלנו לעזרתם בשיפור הבהירות והשירות של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי הפרס מחקר מהפרק סטייט הכדור של Sigma Xi לSGW, המכונים לאומי לבריאות מענק (R15 GM111713) לEMR, הפרס מחקר כדור מדינה לשאוף לאוניברסיטת EMR, וקרנות מאוניברסיטת מדינת הכדור משרד המכללה והמחלקה לביולוגיה.

1. Assay צמיחת שמרים לזיהוי מוטציות מועמד פגומים בפירוק חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך wild-type ותאי שמרים שעברו מוטציה עם קידוד פלסמיד חלבון יציב התמזגו, במסגרת, לאנזים מטבולי כתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מיליליטר של סינטטי מוגדר בינוני מינימאלי (SD) שהוא סלקטיבי לתאי חסת מולקולות פלסמיד. דגירה הלילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה. הערה: לאחר דגירה הלילה, תאים בתרבית יכולה להיות בכל שלב צמיחת לוגריתמים או נייח אבל צריך להגיע OD מינימאלי 600 של 0.2. שמרי זנים גדלים לאט מאוד עשויים לדרוש פעמים דגירה יותר מלילה אחד, או חיסון של מספר גדול יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי שישה דילולים סדרתי של תאי שמרים הפכו בצלחת 96-היטב סטרילי, החל בתאים מדוללים לn OD 600 של 0.2. מניחים כל transformant שמרים להיות מאושרים בשורה שונה בצלחת 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל transformant, לחשב את הנפח של תרבות הלילה נדרשת לדלל תאים לOD 600 של 0.2 בנפח סופי של 200 μl. הוספת נפח זה של תרבות הלילה למתאים היטב בטור 1. הוסף את הכמות המתאימה של מים סטריליים כדי להביא את הנפח 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל שורה של שמרים, להוסיף 125 μl של מים סטריליים לבארות בעמודות 2, 3, ו -4. הערה: 96-גם צלחות סטרילי עטופות בנפרד עשויות להיות ארוזות עם מכסי סטרילי. המכסים עשויים לשמש כמאגרים למים סטריליים שמופץ בשלב זה. זה מאפשר העברה סימולטנית של מים סטריליים לכל הבארות בעמודת נתונה עם pipettor רב-ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התוכן של העמודה הראשונה (השמרים מדוללים לOD 600 של 0.2) על ידי pipetting מעלה ומטה עם pipettor רב-ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfאה 25 μl של שמרים מהטור 1 לעמודה 2, באמצעות pipettor רב-ערוצי. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. העברה 25 μl מטור 2 לטור 3, ו -25 μl מהעמודה 3 לעמודה 4 (ערבב היטב בכל שלב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כל דגימה עם pipettor רב-ערוצי. ימשיך מרוב לדלל לדלל לפחות עמודות של שמרים, פיפטה 4 μl של כל דגימה על שתי צלחות המכילות מצע סלקטיבי המתאים. השתמש בצלחת אחת עם מדיום ששומרת על בחירת פלסמיד (צלחת זה משמשת כתצפית שמרים ושליטה צמיחה). השתמש בצלחת שנייה עם מדיום שבוחר עבור תחזוקת פלסמיד וביטוי של החלבון יציב התמזג אנזים הכתב. משום שמרים להתיישב במהירות, לערבב תאים על ידי pipetting מעלה ומטה במרווחי זמן קבועים. הערה: צלחות Drier יותר בקלות תספוג נוזלים מאשר צלחות מוכנות טרי ולכן מומלצים לניסויים אלה. צלחות לחות עשויות להיות מיובשות על ידי דגירה בטמפרטורת חדר בloלחות w עבור 1-2 ימים או incubations קצר יותר בזרימה למינרית. צלחות עלולות להתייבש בצורה לא אחידה, אם את זרימת האוויר למינרית היא מקבילה לספסל. שימוש בתבנית עושה את זה קל יותר לזהות תאי שמרים במרחקים קבועים. שתי תבניות מדגם מסופקות באיור 1. אלה עשויים להיות מודפסים, לגזור, ומודבקים לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות לייבוש על גבי הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על C ° 30 ל2-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם כל צלחת לאחר דגירה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> איור 1. תבניות לאיתור תאי שמרים על צלחות אגר 100 מ&quot;מ. תבניות אלו עשויות לשמש כדי להקל על איתור שמרים במרחקים קבועים עם pipettor רב-ערוצי. תבניות ניתן להדפיס, לגזור, ומודבקים לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי. מניחים צלחת פטרי עם צמיחהמכסה בתוך בינוני עם תבנית מודבקת. תבניות מסומנות בחריץ כדי לעקוב אחר כיוון. מומלץ צלחות המשמשות במבחני צמיחה תסומן באופן דומה עם חריץ כדי לעקוב אחר כיוון. תבניות לאיתור ארבעה (א) או חמישה (B) דילולים סדרתי של תאי שמרים מסופקים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה להדפסה של נתון זה עם תבניות 100 מ&quot;מ.</a> 2. אישור ביוכימית של Assay צמיחת שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחה של תאי שמרים והפקת חלבון Post-אלקליין (שונה מ -31) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך wild-type ותאי שמרים שעברו מוטציה עם פלסמיד המקודד את החלבון יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מיליליטר של מדיום SD שהוא סלקטיבי לתאי חסת מולקולות פלסמיד. דגירה הלילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של כל מ&quot;ק לילהlture. הערה: לאחר דגירה הלילה, תאים יכולים להיות בכל שלב צמיחת לוגריתמים או נייח אבל צריך להגיע OD 600 שיאפשר דילול לOD 600 של 0.2 ב 10 מיליליטר בינוני טרי סלקטיבית (צעד 2.1.4). שמרי זנים גדלים לאט מאוד עשויים לדרוש פעמים דגירה יותר מלילה אחד, או חיסון של מספר גדול יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאי שמרים לOD 600 של 0.2 ב 10 מיליליטר בינוני סלקטיבית טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לדגור תאים על 30 מעלות צלזיוס, מסתובב או רועד, עד תרבויות להגיע OD 600 בין 0.8 ו -1.2 (כלומר נמצאות בצמיחת אמצע לוגריתמים). הערה: אם החלבון לא יציב של עניין הוא תחת שליטתו של אמרגן ויסות, התזמון האופטימלי של אינדוקציה של ביטוי חלבון וקציר תא עשוי להשתנות בהתאם למחקרים קודמים או תצפיות אמפיריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של התרבות ב 15 מ&quot;ל חרוטיאל צינור על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. הערה: OD אחת 600 יחידה מוגדרת כסכום של שמרים הנוכחיים ב 1 מיליליטר של התרבות בOD 600 של 1.0. הנפח של התרבות (במ&quot;ל) נדרש למסוק 2.5 OD 600 יחידות (V) ניתן לקבוע באמצעות המשוואה הבאה: V = 2.5 OD 600 יחידות OD נמדד / 600 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 1 מיליליטר מים מזוקקים. העבר את התאים מושעים לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב6,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 100 μl מים מזוקקים על ידי pipetting מעלה ומטה או vortexing, ולהוסיף 100 μl 0.2 M NaOH. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. דגירה דגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה (שרובם עדיין לא שוחררו חלבונים ועדיין קיימא) על ידי צנטריפוגה ב18,000 xגרם במשך 5 דקות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה ב50-100 μl חיץ מדגם Laemmli 1x, אשר lyse תאים, על ידי pipetting מעלה ומטה או vortexing. הערה: הסרת supernatant אלקליין הבא צנטריפוגה וresuspension הבא של תאים במאגר מדגם Laemmli תמציות חלבונים בpH תואם עם ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide (SDS-PAGE) dodecyl נתרן באמצעות מערכת חיץ ריצת טריס-גליצין ומערבי סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל באופן מלא חלבונים, דגירה lysates על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הערה: חלבוני צבירה מועדים (למשל חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני) עשויים להיות בלתי ניתנים לפתרון, כאשר טופחו על 95 מעלות צלזיוס. לכן, צריך להיות מודגרות lysates בטמפרטורות נמוכות יותר (למשל 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כאמפירי שנקבע, לניתוח של חלבונים מסוג זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates מגניב על ידי הנחת על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates צנטריפוגות ב 18,000 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה חומר מסיס. הפרד את supernatant (solubilized חלבון חילוץ) על ידי SDS-PAGE לפני ניתוח שלאחר מכן מערבי כתם (סעיף 2.2). לחלופין, lysates החנות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול מערבי סופג נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון נפח אמפירי נחוש של lysates בג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;ל ב 200 V עד לפני לצבוע הגיע לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מן ג&#39;ל לפלואוריד polyvinylidene קרום (PVDF) על ידי העברה רטובה ב 20 V ל60-90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק על ידי דוגרים ב 5% חלב דל שומן בטריס שנאגרו מלוח (TBS), נדנדה, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין (או תג epitope ממנו) ב 1% חלב דל שומן בTBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) לשעה 1 בחדר temperature, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות מתאימים ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. הערה: מאחר fluorophores הן רגישה לאור, דילולים של נוגדני fluorophore מצומדות צריכים להיות מוכנים בחושך. בנוסף, דגירה של ממברנות בנוכחות נוגדני fluorophore מצומדות צריכה להתרחש במיכלים lightproof. זה יכול להיות מושלם על ידי עטיפת מגשי דגירה ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של קרום באמצעות Li-Cor אודיסיאה CLX ותוכנת Studio התמונה (או ציוד הדמיה דומה ותוכנה), על פי המלצות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לעומסing חלבון שליטה ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות מתאימים ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של קרום באמצעות Li-Cor אודיסיאה CLX ותוכנת Studio התמונה (או ציוד הדמיה דומה ותוכנה), על פי המלצות יצרן. </li></ol></li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת קביעה המהירה ואישור ביוכימיים של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים בתאי שמרים. ניסויים אלה מדגישים את השירות ואת כוחו של שמרי כאורגניזם מודל אוקריוטים (כמה ביקורות מצוינות של שמרי ביולוגיה וליקוטים של פרוטוקולים לטיפול, אחסון, ומניפולצית תאי שמרים (למשל 41-44) זמינים לחוקרים חדשים לאורגניזם). בקלות ניתן ליישם הטכניקות לחקור את ההשפלה ושפע של מגוון רחב של סוגי חלבונים. לדוגמא, אחרים מועסקים באסטרטגיה זו כדי לאפיין את מנגנוני השפלה של cytosolic יציב, גרעיני, וluminal ER וחלבונים הטרנסממברני 45-49. כמה גורמים יש לקחת בחשבון בבחירה של אנזים מטבולי איחוי חלבון יציב. ראשית, זה חיוני כי גרסה תקינה של הגן המקודדת את האנזים לאלהיות נוכח בגנום המארח. כדי למזער את התוצאות חיוביות כוזבות (כלומר צמיחה בתנאים סלקטיבית כאשר החלבון לא יציב הוא מושפל למעשה), מומלץ לעבוד עם זנים כי הנמל אינו חוזר אללים מוטציה של גן הכתב (מחיקות גן רצוי מלאה) 50. שיקול נוסף לבחירת אנזים כתב הוא הזמינות של מעכבים תחרותיים, אשר יכול להיכלל במדיום הגידול סלקטיבי כדי להפחית צמיחת רקע ולשפר את חומרת assay. זה עשוי להיות שימושי במקרים של חלבונים עם שיעורי תחלופה נמוכים יחסית אפילו בנוכחות של מנגנוני השפלה מתפקדים במלואה. בניסויים הנציג המוצגים כאן, ההכללה של 3-AT, אשר תחרותי מעכב את אנזים HIS3, מפחיתה צמיחת רקע 40. באופן דומה, במתחם 6-azauracil מעכב URA3, אנזים הדרוש לסינתזת אורציל 51. ריכוז המעכב בי הצמיחה מתרחש בשפלה-דאבל לא wild-type, efective, תאים חייבים להיקבע באופן אמפירי. כמה אנזימים מטבוליים עשויים גם להיות נגד נבחרים נגד. בתנאים נגד סלקטיבית, תאים עשויים לצמוח רק כאשר החלבון לא יציב נפגע (והאנזים מטבולים התמזגו אינו נוכח). לדוגמא, URA3 ממיר את חומצת המתחם 5-fluoroorotic (5-פואה) לתרכובת הרעילה, 5-fluorouracil 52. תאים לבטא חלבון URA3-היתוך יגדלו רק בנוכחות של 5-פואה אם ​​חלבון היתוך URA3 נפגע. באופן דומה, חומצת המתחם 5-fluoroanthranilic (5-FAA) היא רעילה לתאים עם מסלול סינתזת טריפטופן פונקציונלי. 5-FAA ניתן אפוא לשמש נגדי לבחור עבור תאים לבטא חלבוני TRP1-היתוך 53. אסטרטגיות Counter-בחירה עשויות להיות שימושיות לזיהוי מדכאי של מוטציות לפגוע-השפלה. האמרגן להשתמש בכונן ביטוי של כתב השפלה חייב להיות גם שנבחר בקפידה. רמות נמוכות של &quot;ביוסינט&quot;אנזימי etic עשויים להיות מספיק כדי לתמוך בצמיחה בהעדר המטבוליט מסופק exogenously, אמרגן חלש מומלץ 54. בניסויים הנציג המוצגים כאן, אמרגן GAL4, שמודחק בנוכחות של גלוקוז 55, משמש כדי לקדם את התעתיק של Deg1 -Sec62-HIS3. ביטוי בסיסי של חלבון ההיתוך הזה, לפי תנאי דיכוי (כלומר גלוקוז 2%) מספיק כדי לתמוך בצמיחה בתנאים סלקטיבית (כלומר היעדר היסטידין והנוכחות של 1 - 2 מ&quot;מ 3-AT) כאשר מנגנון השפלה מושבתת. עם זאת, רמות החלבון מספיקות כדי לתמוך בצמיחה בתנאים סלקטיבית צפויים להיות מתחת לסף גילוי על ידי מערבי סופג. לכן, ייתכן שיהיה צורך לנהוג ביטוי עם אמרגן חלש עבור assay הצמיחה ואמרגן חזק לאישור ביוכימיים. במקרה של Deg1 -Sec62 (עם או בלי היתוך HIS3), robus יותראמרגן t (כאן, אמרגן MET25 39) נדרש להדמיה חלבון על ידי ניתוח מערבי. כפי שתואר כאן, assay הצמיחה מבוסס השמרים יכול להתבצע על בקנה מידה קטנה, גישה מבוססת מועמד. דילולים סדרתי של תאי שמרים ערוכים צלחת 96-היטב והועברו על ידי pipetting למדיום גידול מוצק; שיטה חלופית להעברה היעילה ושחזור של השעיות תא שמרים מדוללים על מדיום מוצק היא השימוש במשכפל רב-סיכה, המכונה גם &quot;Frogger&quot; 56. הזמן האידיאלי לצלם צלחות ישתנו עם זני שמרים ותנאים. מומלץ לצלם את צלחת נתון כאשר מושבות מתרבות הצמיחה המהירה ביותר להיות גלויות ראשונה במקום לדלל ביותר. זה בדרך כלל השלב שבו הבדלים בשיעורי צמיחה בין דגימות ברורות ביותר. זה עשוי להיות כדאי לצלם בימים מרובים, במיוחד במקרה של שמריםמציג מגוון רחב של שיעורי צמיחה. Assay הכתב המבוסס על הצמיחה גם עשוי להיות מותאם לקנה מידה גדולה ניתוחים. לדוגמא, כתב השפלה ניתן להכניסו לספרייה זמינה מסחרי של 5,000 זני שמרי מחיקת גן הפלואידים קיימא ~ שימוש בטכנולוגיה סינתטית מערך גנטי (SGA) 46,57. בטכניקה זו, זן שמרים הפלואידים עם חלבון היתוך כתב חילוף חומרים chromosomally משולב הזדווגו לכל זן של ספריית מחיקת הגן. תאי דיפלואידי התוצאה מושרים לsporulate (לעבור מיוזה) ונתונים לבחירה לצאצאי meiotic הפלואידים מחסה שני כתב חילוף החומרים ומחיקות גן בודדים. אז זנים אלו מועברים בהמוניהם לסלקטיבית בינוניים לתאים שבחלבון כבר התייצב. באשר לקנה מידה קטנה מנתח, אם גן עם תפקיד בפירוק חלבונים נמחק, חלבון ההיתוך יהיה מיוצב, וצמיחת תאים תהיה משופרת. להשוואהpproaches כבר המציא, המאפשר לשינוי סימולטני של אוסף גדול של זנים עם פלסמידים-נוספים chromosomally נשמרו; אסטרטגיה זו מבטלת אינטגרציה כרומוזומליות, הזדווגות, נביגה, ובחירת meiotic 54. כאשר מוטציה נמצאת מעניקה יתרון צמיחת תאי מחסה כתב מטבולים, יש צורך לאשר ביוכימית שהמוטציה מגדילה את השפע של החלבון של עניין. הליך שמרי תמוגה מהיר ואמין, מותאם באופן הדוק מהשיטה של 31 Kuhsnirov, מוצג. פרוטוקול זה מאפשר להפקת חלבונים בצורה ישירה מתאימה לניתוח על ידי מערבי סופג. לניתוח של חלבון נתון, כמות lysate להיות טעונה בכל טוב, תכונות ג&#39;ל acrylamide, בחירה של קרום, נוגדנים המשמשים ודילוליו, ושיטה של ​​זיהוי חייבת לקבוע באופן אמפירי. הפרוטוקול המערבי סופג הנציג תאר utilizes נוגדנים משני מוצמדים לצבעי ניאון; פרוטוקולים נפוצים אחרים להסתמך על chemiluminescence תלויה באנזימי נוגדנים מצומדות 58. כפי שתואר כאן, הקרום משמש לאיתור החלבון של עניין ניתן reprobed ישירות עם נוגדנים לחלבון בקרת טעינה. אם הנוגדנים העיקריים המשמשים לאיתור החלבון של עניין וחלבון בקרת הטעינה הועלו מאותו המין, reprobing הקרום אפשרי כל עוד הלהקות הנובעות מחלבונים אלה אין שיתוף להגר. אם, לעומת זאת, הנוגדנים העיקריים המשמשים לאיתור החלבון של עניין וחלבון בקרת הטעינה הועלו ממינים שונים, באותו הקרום עשוי להיות נחקר ברצף, גם אם שיתוף להגר להקות, אם הנוגדנים משני כבר מוצמדים לfluorophores עם אורכי גל פליטה שונים. במקרה שהחלבון של עניין ושיתוף להגר חלבון בקרת טעינה והנוגדנים הראשוניים בהתאמה היה ראיSED מאותו המין, דגימות עשויות להיפתר בשני ג&#39;לי SDS-PAGE, הועבר לקרום PVDF, ומששו בנפרד עם נוגדנים ספציפיים לחלבון חלבון ריבית ושליטה טעינה של. לחלופין, עקביות טעינה עלולה להישפט על ידי דוגרים קרומים עם כתמים שאינם ספציפיים חלבון (לדוגמא Coomassie או Ponceau S). יתר על כן, הפרוטוקול המערבי סופג הנציג מניח חלבון או epitope שהוא זוהה על ידי דגירה רציפה של נוגדנים ראשוניים ומשניים, כאופייני. חלבוני ההיתוך ניתחו בתוצאות הנציג מכילים שתי epitopes נגזרת מחלבון Staphylococcus aureus (PRA באיורים 2 ו -3). חלבון נקשר ישירות לנוגדני יונקים, ולכן ניתן לאתר באמצעות נוגדנים משני בלבד (כלומר אין צורך בשלב דגירה נוגדן הראשוני) 59. יתכן ששילוב של אנזים כתב עשוי להשפיע שפע חלבון אוהשפלה. אי לכך, מומלץ לאשר ביוכימית התוצאות משתמשים בגרסה של המצע משוחרר על ידי חלבון הכתב. לבסוף, שני מבחני המתוארים כאן מסתמכים על הבדלים ברמות חלבון מצב יציב כמדד להבדלים ביציבות חלבון. בגלל שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון והשפלה, אנליזה ביוכימית נוספת (למשל cycloheximide ניסויי מרדף או מרדף דופק) חייב להיות מועסק על מנת לנתח את פרופיל השפלה הדינמי של חלבון באופן ישיר. תוצאות הנציג להקים יישום רומן של פרוטוקול זה לקביעת דרישות גנטיות לפירוק של חלבון שaberrantly עוסקת translocon ER. Deg1 -Sec62-HIS3 העניק יתרון שמרי צמיחה בתנאים סלקטיבית כאשר מסלול השפלה היה מובטלת (כלומר ב היעדר האנזים יוביקוויטין Hrd1). לשעבר חלבון מהיר ואמיןשיטת גרירה ואחריו מערבי סופג אישרה עלייה בשפע של Deg1 -Sec62 (עם או בלי HIS3) בהעדר Hrd1. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהמנגנון של השפלה Hrd1 תלויה של החלבונים הקשורים translocon שונה מאלה של מצעי luminal או הטרנסממברני Hrd1 ER אחרים 32. לעבוד בעתיד יהיה להעסיק את חלבון היתוך Deg1 -Sec62-HIS3 במסכים גנטיים בקנה מידה גדולה לזיהוי גני רומן הנדרשים למנגנון השפלה ייחודי זה.

פירוק חלבוני סלקטיבי הוא חיוני לחיים אוקריוטים, ופירוק חלבונים שינה תורם למספר מצבים רפואיים, כוללים מספר סוגים של הסרטן, מחלה ניוונית של מערכת עצבים, מחלות לב, וסיסטיק פיברוזיס 1-5. מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS), המזרז פירוק חלבונים סלקטיבית, היא יעד טיפולי המתעוררים לתנאים אלה 6-10. ligases יוביקוויטין קוולנטית לצרף פולימרים של היוביקוויטין חומצת אמינו 76-לחלבוני 11. חלבונים שסומנו עם רשתות polyubiquitin מוכרים וproteolyzed על ידי ~ 2.5 megadalton 26s פרוטאזום 12. מחקרים שיזמו באורגניזם אוקריוטים מודל Saccharomyces cerevisiae (שמרי ניצנים) היו מכוננים בהבהרת מנגנוני פירוק חלבונים בתאים אוקריוטים. המצע הפיזיולוגי הפגין הראשון של UPS היה מדכא תעתיק שמרי 13 MATα2, 14 ורכיבים שמורים ביותר, רבים של UPS זוהו לראשונה או מתאפיינים בשמרים (למשל 15-26). התגליות שנעשו באורגניזם מודל רב-תכליתי וצייתן גנטי זה, צפויות להמשיך ולספק תובנות חשובות מנגנוני שימור של השפלה בתיווך היוביקוויטין. הכרה והשפלה של רוב מצעי UPS דורשים פעולה מתואמת של חלבונים מרובים. לכן, מטרה חשובה באפיון השפלה המוסדרת של חלבון יציב נתון היא לקבוע את הדרישות הגנטיות לproteolysis. גישות קלאסיות (למשל דופק מרדף וניסויים cycloheximide-מרדף 27) לניטור פירוק חלבונים בתאי יונקים או שמרים הן מייגע וגוזל זמן. בעוד אלו סוגים של המתודולוגיה לספק אמצעי רגיש מאוד לאיתור פירוק חלבונים, שהם אינם מתאימים לניתוח מהיר של פירוק חלבונים או screeni בקנה מידה גדולהng למוטציות המונעות פירוק חלבונים. כאן, assay המבוסס על צמיחת שמרים לזיהוי המהיר של דרישות גנטיות לפירוק של חלבונים לא יציבים מוצג. בשיטה המבוססת על צמיחת שמרים לניתוח פירוק חלבונים, חלבון יציב של עניין (או אות השפלה) מותך, במסגרת, לחלבון שנדרש לשמרי צמיחה בנסיבות מסוימות. התוצאה היא מצע מלאכותי שעשויות לשמש ככלי רב עוצמה כדי לקבוע את הדרישות הגנטיות של פירוק חלבונים של החלבון יציב של עניין. נוח, זני שמרי מעבדה הנפוצים ביותר בנמל פנל של מוטציות בגני מקודדי אנזימים מעורבים בחילוף חומרי הסינתזה של חומצות אמינו מסוימות או בסיסים חנקניים (למשל 20,28-30). אנזימים אלה חיוניים לשגשוג תאי בהעדר מטבוליטים סיפקו אקסוגני בסינתזה שהאנזימים להשתתף. כזהאנזימים מטבוליים עשויים כך לתפקד ככתבים המבוסס על צמיחה לפירוק של חלבונים לא יציבים שאליו הם התמזגו. הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים אפשר לבאר בקלות, שכן מוטציות המונעות proteolysis תאפשר תאי מחסה כתב השפלה לגדול בתנאים סלקטיבית. יתרון צמיחה הוא אינדיקציה עקיפה שמוטציה מסוימת מגדילה את השפע של החלבון של עניין. עם זאת, נדרשת אנליזה ביוכימית ישירה כדי לאשר שמוטציה מאפשרת צמיחה דרך רמות חלבון מוגברות ולא באמצעות גורמים עקיפים או artifactual. ההשפעה של מוטציה בחלבון שפע עשויה להיות מאושרת על ידי ניתוח כתם המערבי של רמות חלבון במצב יציב בתאים שעושים ולא נמל מוטציה מסוימת. שיטה למיצוי המהיר ויעיל של חלבוני שמרים (דגירה רציפה של תאי שמרים עם נתרן הידרוקסידי וחיץ מדגם) בצורה מתאימהלניתוח על ידי מערבי סופג מוצג גם 31. יחד, ניסויים אלה להקל על זיהוי המהיר של רגולטורי מועמד של פירוק חלבונים.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#039;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#039;s laboratory.</td></tr><tr><td>3-amino-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinant form from &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.</td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Available from a variety of manufacturers&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.</td></tr><tr><td>Plate imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

פירוק חלבונים מוסדר הוא חיוני עבור כמעט כל פונקציה סלולרית. הרבה ממה שידוע על המנגנונים המולקולריים וגנטיות לדרישות פירוק חלבונים האיקריוטים בתחילה הוקם בSaccharomyces cerevisiae. ניתוחים קלאסיים של פירוק חלבונים יש לסמוך על מתודולוגיות דופק מרדף וcycloheximide-מרדף ביוכימיים. בעוד טכניקות אלה מספקים אמצעים רגישים להתבוננות פירוק חלבונים, שהם, זמן רב מייגע, ונמוכה-תפוקה. גישות אלה אינן ניתנות לסינון מהיר או בקנה מידה גדולה למוטציות המונעות פירוק חלבונים. כאן, assay המבוסס על צמיחת שמרים לזיהוי הקליל של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים מתואר. ב assay זה, אנזים כתב הנדרש לצמיחה בתנאים סלקטיבית מסוימים התמזג חלבון יציב. תאים חסרי אנזים כתב אנדוגני אך המבטא את חלבון ההיתוך יכול לגדול תחת Sele גודלתנאי ctive רק כאשר חלבון ההיתוך הוא התייצב (כלומר, כאשר פירוק חלבונים נפגעת). בassay הצמיחה המתואר כאן, דילולים סידוריים של wild-type ותאי שמרי מוטציה מחסה פלסמיד קידוד חלבון היתוך הם הבחינו על מדיום סלקטיבית ולא סלקטיבי. צמיחה בתנאים סלקטיבית עולה בקנה אחד עם ליקוי השפלה ידי מוטציה נתון. שפע חלבון מוגבר צריך להיות מאושר ביוכימית. שיטה להפקת המהירה של שמרי חלבונים בצורה מתאימה לאלקטרופורזה ומערבית סופג הוא הוכיח גם. קריאה מבוססת צמיחה ליציבות חלבון, בשילוב עם פרוטוקול פשוט להפקת חלבון לאנליזה ביוכימית, מאפשרת זיהוי מהיר של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים. ניתן להתאים את הטכניקות הללו כדי לפקח השפלה של מגוון רחב של חלבונים קצרים ימים. בדוגמא המוצגת, אנזים HIS3, אשר נדרש לסינתזת היסטידין, התמזגלDeg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 מיועד לפירוק לאחר שaberrantly עוסק translocon reticulum endoplasmic. תאי מחסה Deg1 -Sec62-HIS3 היו מסוגלים לגדול בתנאים סלקטיבית כאשר החלבון התייצב.

כדי להמחיש מתודולוגיה זו, אנזים HIS3 כבר התמזג carboxy-הסופי של reticulum endoplasmic מודל השפלה -associated (ER) (ERAD) מצע, Deg1 -Sec62 (איור 2 א) כדי ליצור Deg1 -Sec62-HIS3 (איור 3) . Deg1 -Sec62 מייצג חבר מייסד של כיתת רומן של מצעי ERAD ממוקדות הבאים עמותה מתמשכת, סוטה עם translocon, הערוץ אחראי בעיקר להעברת חלבונים על פני קרום ER 32-34. חלבונים לא יציבים כגון זמניים נקראו ERAD-T (הלקשורים translocon) מצעים. מחקרים קודמים מצביעים על כך ש, על האירוסין translocon חריגים, Deg1 -Sec62 מיועד לפירוק על ידי האנזים יוביקוויטין Hrd1 (איור 2-D) 32, 34, 35. מופיעים גורמים הנדרשים לפירוק של מצעי Hrd1 אחרים להיות מיותר עבור &lt;em&gt; השפלה Deg1 -Sec62, המצביע על מנגנון השפלה רומן 32. בתנאים של שומנים בדם לקויים מחייבים ועמותת translocon ממושכת, אפוליפופרוטאין B, מרכיב החלבון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה של יונקים, נראה מושפל על ידי מנגנון קשור 36-38. לכן, Deg1 -Sec62 עשוי לספק מודל שימושי לפירוק של חלבונים הקשורים translocon רלוונטיים מבחינה רפואית. wild-type תאי שמרים וhrd1Δ שחסרים את גן HIS3 כרומוזומליות הפכו עם וקטור ריק 39 או קידוד פלסמיד Deg1 -Sec62-HIS3 והבחינו על מדיום סלקטיבית צמיחה (איור 4). כדי לוודא שמספר שווה של תאי שמרים הפכו הועברו לצלחות, תאים הבחינו על טריפטופן הבינוני חסר (שבוחר עבור תאי מחסה פלסמיד) אבל היסטידין מכיל. צמיחה דומה נצפתה עבור כל תאי השמרים הפכו.תאים המבטאים Deg1 -Sec62-HIS3 היו צפויים לגדול בהעדר היסטידין רק כאשר חלבון ההיתוך הוא התייצב (כלומר, כאשר ERAD-T נפגעת). ואכן, שמרי hrd1Δ להביע Deg1 -Sec62-HIS3 הציגו צמיחת יתרון יחסי לתאי wild-type להביע Deg1 -Sec62-HIS3 על טריפטופן החסר הבינוני והיסטידין. עם זאת, ציין צמיחת היתוך חלבון תלוי בהעדר היסטידין נצפה אפילו בנוכחות של Hrd1. על מנת להגדיל את ההחמרה של assay, היסטידין הבינוני חסר היה בתוספת 3-אמינו-1H-1,2,3-triazole (3-AT), מעכב תחרותי של אנזים HIS3 40. מרים להביע Hrd1 גדל בצורה גרועה מאוד על היסטידין החסר הבינוני בתוספת 1 - 2 מ&quot;מ 3-AT; כאשר HRD1 נמחק, צמיחת תאים שוחזרה. הכללה של 3-AT בריכוז של 3 מ&quot;מ צמיחה דרמטית עכבות של כל התאים, ללא קשר לנוכחות או העדר של Hrd1. מיל אלה<html> אולטס עולה בקנה אחד עם מצע השפלה Hrd1 תלויה. בשלב הבא, שפע המצב היציב של חלבון Deg1 -Sec62-HIS3 בשמרים להביע או חסר אנזים Hrd1 נבדק באופן ישיר. ניתוח מערבי סופג מצויינים עלייה דומה בDeg1 -Sec62-HIS3 וחלבון Deg1 -Sec62 בhrd1Δ שמרים ביחס לתאי wild-type (איור 5). זה מאשר את התפקיד לHrd1 בויסות הרמות של שני החלבונים. השפלה Hrd1 תלויה של Deg1 -Sec62 ממשיכה אחרי החלבון aberrantly עוסק translocon ER 32. חשוב לציין, Deg1 -Sec62-HIS3 aberrantly עוסק translocon באופן דומה (נתונים שלא פורסמו), אימות השימוש בDeg1 -Sec62-HIS3 ככתב המבוסס על צמיחה לפירוק של Deg1 -Sec62 במיוחד וחלבונים הקשורים translocon בדרך נוסף. s &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig2.jpg" width="700" /> epitope דגם לפירוק של Deg1 -Sec62 הבא אירוסין translocon הסוטים () תיאור סכמטי של Deg1 -Sec62 Deg1 (67 חומצות אמינו אמינו מסוף מMATα2) ואחריו, ברצף, על ידי הדגל (F): איור 2.. , Reticulum 2-הטרנסממברני endoplasmic (ER) חלבון Sec62, ושני עותקים של ס &#39; חלבון aureus (PRA). לשם בהירות, חלבון ההיתוך נקרא Deg1 -Sec62. (ב) בעקבות ההכנסה רגילה של שני מגזרים הטרנסממברני לתוך קרום ER, אינטראקציה מתמשכת של Deg1 -Sec62 עם translocon מפעילה חריגה, Deg1 + תלוי translocon אירוסין. בעקבות engagemen translocon החריג חלק מזנב אמינו מסוף תחילה cytosolic נכנס-וaberrantly סביר נשאר בתוך-translocon. (C)t, Hrd1 מכיר וubiquitylates Deg1 -Sec62. עיגולים אדומים מצביעים על מולקולות יוביקוויטין. (ד) Deg1 -Sec62 אז חולץ מן קרום ER ומושפל על ידי הפרוטאזום, סביר להניח להקלת חסימת translocon. <img alt="איור 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig3.jpg" width="300" /> איור 3:. תיאור סכמטי של Deg1 -Sec62-HIS3 הבא אירוסין translocon חריגים Deg1 אחרי, ברצף, על ידי epitope הדגל (F), חלבון 2-הטרנסממברני ER Sec62, שני עותקים של ס &#39; חלבון aureus (PRA), ואנזים השמרים HIS3. לשם בהירות, חלבון ההיתוך נקרא Deg1 -Sec62-HIS3. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig4.jpg" width="700" /> איור 4: פיוזינג HIS3 לDeg1 </eמ &#39;&gt; -Sec62 מאפשר בחירה של מוטציות השפלה פגומה. דילולים סידוריים של wild-type (HRD1) ושמרי hrd1Δ הפך עם וקטור ריק או קידוד פלסמיד Deg1 -Sec62-HIS3 הבחינו בי על טריפטופן הבינוני חסר, חסר טריפטופן הבינוני והיסטידין , ובינוני חסרי טריפטופן והיסטידין בתוספת 3-אמינו-1H-1,2,3-triazole (3-AT), מעכב תחרותי של HIS3, בריכוזים מצויינים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52428/52428fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig5.jpg" width="300" /> איור 5:. שפע מוגבר של Deg1 -Sec62 וDeg1 -Sec62-HIS3 בתאים חסרי Hrd1 תמציות חלבון הוכנו מwild-type (+) וhrd1Δ(Δ) מרים להביע Deg1 -Sec62 או Deg1 -Sec62-HIS3. חלבונים (שווה ערך ל 0.125 OD 600 יחידות) הופרדו על ידי SDS-PAGE, ואחריו מערביים סופג עם נוגדנים משני ארנב נגד עכבר, אשר ישירות יחייבו את epitopes חלבון של חלבוני ההיתוך. מערבי סופג לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים לPgk1 מספק טעינה מלאה. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון </td><td> רכיבים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td rowspan="3"> סינטטי מוגדר (SD) שמרים בינוניים מינימאלי </td><td rowspan="3"> דקסטרוז 2%, 0.67% בסיס שמרי חנקן ללא חומצות אמינו, אדנין 0.002%, אורציל 0.004%, ארגינין 0.002%, היסטידין 0.001%, isoleucine 0.006%, לאוצין 0.006%, ליזין 0.004%, מתיונין 0.001%, פנילאלנין 0.006%, 0.005 תראונין%, טריפטופן 0.004%. למדיום מוצק (צלחת), כולל אגר 2%. </td><td> 1. מדיום סלקטיבי הוא הוכן על ידי השמטת apחומצת אמינו propriate (ים) או בסיסים חנקניים. </td></tr><tr><td> 2. לנוחיותכם, מרכיבים אלו יכולים להישמר כפתרונות מניות מרוכזים כדלקמן. חומצות אמינו יכולות להישמר כפתרון מניות 100X המכיל את כל חומצות אמינו הרצויות. בסיס חנקן שמרים יכול להישמר בפתרון 20X מניות (13.4%). דקסטרוז יכול להישמר בפתרון מניות 40%. אדנין ואורציל יכולים להישמר כפתרונות מניות 1% ב 0.1 M NaOH. </td></tr><tr><td> 3. לעקר בינוני על ידי מעוקר. </td></tr><tr><td rowspan="2"> מאגר מדגם 1X Laemmli </td><td rowspan="2"> 2% SDS, גליצרול 10%, 5% β-mercaptoethanol, 60 מ&quot;מ טריס HCl pH 6.8, bromophenol 0.008% כחול </td><td> 1. חיץ מדגם 1X מוכן לעתים קרובות על ידי דילול מניות מרוכזות יותר (למשל 5X). </td></tr><tr><td> 2. bromophenol הכחול הצבע ניתן להוסיף לעצמה רצויה. &quot;קמצוץ&quot; (כמות קטנה מאוד טפח מקצה מרית) היא בדרך כלל מספיק. </td&gt; </tr><tr><td> 0.2 M סודיום הידרוקסיד </td><td></td><td> הכן במים. נתרן הידרוקסידי מגיב עם זכוכית. לכן, לאחסון לטווח ארוך, 0.2 M נתרן הידרוקסידי יש לשמור במיכלי פלסטיק. </td></tr><tr><td> Laemmli הפעלת מאגר (5X) </td><td> 125 מ&quot;מ טריס, 960 מ&quot;מ גליצין, 0.5% SDS </td><td> כדי להכין 1 ליטר של 1X Laemmli הפעלת מאגר, לדלל 1: 5 ב DH 2 O </td></tr><tr><td> העברת טריס Acetate-SDS הצפת (5X) </td><td> 125 אצטט מ&quot;מ טריס (pH 8.8), 960 מ&quot;מ גליצין, 0.05% SDS </td><td> כדי להכין 20 L של 1X טריס Acetate-SDS העבר את המאגר, לשלב 4 L של מניית 5X, 4 L של מתנול, ו -12 ליטר של DH 2 O </td></tr><tr><td> 10X טריס שנאגרו מלוח (TBS) </td><td> 500 מ&quot;מ טריס, 1.5 M NaCl; pH 7.5 מותאם ל </td><td> כדי להכין 1 ליטר של TBS 1X, לדלל 1:10 ב DH 2 O. 1X TBS ניתן להשלים עם Tween-20 אבקת הכביסה וחלב דל שומן אבקה, לפי עניין. </td></tr></tbody></table&gt; טבלה 1: פתרונות ומאגרים שימשו במחקר זה. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם זן </td><td> כינוי </td><td> גנוטיפ הרלוונטי </td><td> דמויות </td><td> מקור </td></tr><tr><td rowspan="7"> VJY6 </td><td rowspan="7"> MHY500 </td><td> מאטה </td><td rowspan="7"> 4 ו -5 </td><td rowspan="7"> חן et al., 1993 </td></tr><tr><td> his3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY10 </td><td rowspan="8"></td><td> מאטה </td><td rowspan="8"> 4 ו -5 </td><td rowspan="8"> מחקר זה </td></tr><tr><td> his3- Δ 200 </td></tr><tr> &lt;td&gt; leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> hrd1 :: kanMX4 </td></tr></tbody></table> טבלה 2:. זני שמרים המשמשים במחקר זה פרטים של הבנייה הנן זמינים לפי בקשה. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פלסמיד מספר </td><td> מלא פלסמיד שם </td><td> איור </td><td> מקור </td></tr><tr><td> pVJ30 </td><td> pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA </td><td> 5 </td><td> רובינשטיין et al., 2012 </td></tr><tr><td> pVJ121 </td><td> pRS414-P MET25 (וקטור ריק עם אמרגן MET25) </td><td> 4 </td><td> Mumberg et al., 1994 </td></tr><tr><td> pVJ467 </td><td> pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 </td><td> 5 </td><td> מחקר זה </td></tr><tr><td> pVJ477 </td><td> pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 </td><td> 4 </td><td> מחקר זה </td></tr></tbody></table> לוח 3:. פלסמידים שימשו במחקר זה שים לב שכל פלסמידים מכילים שמרי centromere לאפשר שכפול בתאי שמרים, גן TRP1 לבחירה בתאי שמרים, ואת גן AmpR לתחזוקה בתאי חיידקים. מפות פלסמיד, רצפים, ופרטי הבנייה זמינות לפי בקשה.

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Views.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Video: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Biochemistry

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunology and Infection

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

בימוי שיטת אבולוציה

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס