Name: directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. בניית ספריית Mutant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו את האזורים להיות חשופים Morphing בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מודלי הומולוגית מבנה או קריסטל הזמין 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, למקד שני אזורים של AAO מ Pleurotus eryngii עבור mutagenesis ו רקומבינציה אקראית (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), תוך הגברה והשאר של הגן (844 נ&quot;ב) על ידי באיכות גבוהה PCR (איור 1). הערה: מקטעים אחדים ניתן ללמוד על ידי Morphing באופן עצמאי או בשילוב 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שהותקפו על ידי מוטגנים PCR. צור חפיפה בין אזורים ובין מגזרים (~ 50 נ&quot;ב כל אחד) על ידי superimposing PCR תגובות של האזורים המוגדרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן PCR מוטגנים של מגזרים ממוקדים נפח סופי של 50 μl המכילים תבנית ה- DNA (0.92 ng / μl), 90 תחושת אוליגו ננומטר (RMLN עבור המגזר אמ&quot;ן AAO-BP עבור המגזר M-II), 90 ננומטרפריימר ntisense (AAO-92C עבור מגזר אמ&quot;ן RMLC עבור מגזר M-II), 0.3 מ&quot;מ dNTPs (0.075 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 0.05 מ&quot;מ MnCl 2 ו 0.05 U / μl פולימראז תקי DNA. רצפי Primers מפורטים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (1 מחזור); 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -74 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שאינם מוטגנים עם פולימראז נאמנות הגבוהה במיוחד וכולל אזורים המקבילים חופפי המגזרים מוטגנים / או סככות וקטור הוא לינארית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת התגובה בנפח סופי של 50 μl המכיל: תבנית ה- DNA (0.2 ng / μl), 250 ננומטר תחושה אוליגו HFF, 250 HFR antisense אוליגו ננומטר, 0.8 מ&quot;מ dNTPs (0.2 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) ו 0.02 U / μl iproof DNA פולימרז. רצפי Primers מפורטים &lt;strong&gt; איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (1 מחזור); 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). הערה: עם התנאים המתוארים 1.2 ו -1.3 חפיפות של 43 נ&quot;ב (אזור פלסמיד-M1); 46 נ&quot;ב (אזור לאזור HF M1); 47 נ&quot;ב (אזור-M2 HF באזור) ו -61 נ&quot;ב (פלסמיד אזור- M2) נועדו (איור 1) להעדיף ב שחבור vivo בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל שברי PCR (מוטגנים הלא מוטגנים) עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטור כך איגוף אזורים של כ -50 נ&quot;ב נוצרים כי הם הומולוגיים אל 5&#39;- ו 3&#39;-הקצוות של גן המטרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה לינאריזציה המכיל 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 U בם HI, 7.5 U Xho לי, 20 מיקרוגרם BSA ו -2 μl של הצפת Baמ HI 10x בנפח סופי של 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו -40 דקות. לאחר מכן, להמשיך עם איון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הווקטור לינארית על ידי מיצוי ג&#39;ל agarose כדי למנוע זיהום עם הפלסמיד העגול שיורית (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת התגובה העיכול אל-היטב מגה של ג&#39;ל agarose נקודת התכה נמוכה חצי preparative (0.75%, w: נ) וכן aliquot (5 μl) של תערובת התגובה ב הסמוך גם ככתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה אלקטרופורזה DNA (5 V / ס&quot;מ בין האלקטרודות, 4 ᵒC) ולהפריד את הג&#39;ל agarose המתאים היטב מגה ולאחסן אותו ב 4 ᵒC ב 1x טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השביל עם סולם המשקל המולקולרי ואת הכתב. דמיינו את הלהקות תחת אור UV. ניק במצב שבו מקומות הווקטור לינארית. הערה: ככל איכות הווקטור לינארית המטוהר היא critiגורם cal עבור רקומבינציה והרכבה מוצלחת בשמרים, להימנע מכתים ג&#39;ל אלקטרופורזה DNA חצי preparative. השימוש של צבעים וחשיפת UV להפקת ג&#39;ל עשוי להשפיע על היציבות של וקטור DNA, להתפשר על יעילות רקומבינציה vivo. כפי אלטרנטיבת צבעי EtBr רעילים, ג&#39;ל אדום וצבעי SYBR משמשים עבור מכתים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיעדר אור UV, לזהות את הווקטור לינארית ב שהבר מגה-גם באמצעות הדרכתו של ניקס בנתיב הכתב המוכתם כך שהוא יכול להיות מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את הווקטור לינארית מ agarose ולטהר אותו עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: וקטורים הסעות episomal גבוהה עותק השתמש בטושים אנטיביוטיקה auxotrophy: בדוגמה זו שיישמנו אורציל עצמאית אמפיצילין התנגדות וקטור pJRoC30, תחת שליטה של האמרגן שמרים GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיל equimolarxture של שברי PCR ומערבב אותו עם הווקטור לינארית ב יחס של 2: 1, עם לא פחות מ -100 ננוגרם של פלסמיד לינארית (יחסים שונים במבחן וקטור equimolar ספרייה / פתוח להשיג תשואות טרנספורמציה טובות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של שברי PCR ו הווקטור לינארית ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר כדי לקבוע הריכוז והטוהר שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform בתאי שמרים מוסמך בתערובת DNA באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים מסחרית (ראה טבלה עבור אספקה) על פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש פרוטאז לקוי URA3 - תלוי ס זן cerevisiae, BJ5465. להפוך את התאים עם וקטור circularized הורית כסטנדרט פנימי במהלך ההקרנה (ראה להלן). בנוסף, לבדוק את הרקע על ידי הפיכת הווקטור לינארית בהעדר שבר PCR. הערה: במקרה של התגלה רמות הפרשה נמוכות ראשוניות, השתמש סcerevisiae פרוטאז זנים לקוי כמו BJ5465 לטפח הצטברות של חלבון פעיל supernatants תרבות. אם אנזים היעד עובר hyperglycosylation, שימוש זני glycosylation מחסר (למשל, Δ kre2 כי הוא מסוגל רק הצמדת oligomers מנוז הקטן) יכול להיות אופציה מתאימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי טרנספורמציה על צלחות נשירת SC הדגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. פלייט (על צלחות הנשירה SC בתוספת אורציל) URA3 - ס תאי cerevisiae חסרי פלסמיד כביקורת שלילית להקרנה (ראה להלן). </li></ol> 2. תפוקה גבוהה הקרנת Assay (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מספר מתאים של 96-גם צלחות סטרילי (23 צלחות לנתח ספרייה של 2,000 שיבוטים) עם 50 μl בינוניים מינימאלי לכל טוב בעזרת רובוט pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות בודדות מתוך SC-נושרים צלחות ולהעבירם צלחות 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת, לחסן מספר העמודה 6 עם סוג הורית כסטנדרט פנימי היטב H1 עם URA3 - ס תאים cerevisiae (במדיום SC בתוספת אורציל) ללא פלסמיד כביקורת שלילית. הערה: ובכן H1 מלא במיוחד עם התקשורת הנשירה בתוספת אורציל. מדיה ריק היטב המכיל ללא תאים ניתן להכין גם כפקד עקרות נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם ועוטפים אותם Parafilm. דגירת צלחות עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל&quot;ד ולחות יחסית 80% שייקרו ולח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Parafilm, להוסיף 160 μl של מדיום ביטוי היטב כל בעזרת רובוט pipetting, לאטום את צלחות דגירה אותם במשך שעות 24 נוספות. הערה: בינוני מינימל ובינוני ביטוי ערוך כפי שדווחו במקומות אחרים 19. רמות ההפרשה עשויות להשתנות תלויים הגן נחקר ובהתאם, tהוא הדגירה פעמים חייבות להיות מותאמות בכל מקרה לסנכרן את צמיחת תאים בכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות (צלחות אב) ב 2,800 x ז במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של supernatant מבארות בצלחת המאסטר לצלחת העתק באמצעות נוזל טיפול multistation רובוטית. הערה: כדי להעדיף הפרשת אנזים רצוי להחליף את הפפטיד אות יליד חלבון המטרה על ידי פפטידים אות נפוצים ביטוי Heterologous בשמרים (למשל, גורם α prepro-המנהיג, המנהיג של הרעלן Killer 1 K מ ס cerevisiae, או גרסאות כימרי אפילו של שני פפטידים 13). לחלופין, הפפטיד אות היליד ניתן התפתח באופן בלעדי עבור הפרשה בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 2 מ&quot;מ p -methoxybenzylalcohol ב- pH חיץ פוספט נתרן 100 מ&quot;מ 6.0 בעזרת הרובוט pipetting. מערבבים את צלחות בקצרה עם 96-אנחנוll מערבל צלחת דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רובוט pipetting, להוסיף 160 μl של מגיב FOX על כל צלחת העתק ומערבבים בקצרה עם מערבל (הריכוז הסופי של תערובת FOX בבאר: 100 מיקרומטר xylenol כתום, 250 מיקרומטר Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 ו 25 מ&quot;מ H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספר ותוספות מגיבים כדי לשפר את הרגישות, כגון ממסי שיתוף אורגניים (DMSO, אתנול, מתנול) או סורביטול 17. הנה, להגביר את התגובה על ידי הוספת סורביטול לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ (איור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחות (מצב נקודת סיום, t0) ב 560 ננומטר על קורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב RT עד שצבע מפתחת מדידת הבליעה שוב (t 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את הפעילות היחסית מהפער בין שווי Abs לאחר דגירה וכי המדידה הראשונית מנורמל פאךקסוג פתיחות opening סגירות closures עבור כל צלחת (Δt 1 - t0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא להיטי המוטציה הטובים ביותר לשני מחדש הקרנות רצופות כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות. הערה: בדרך כלל, מחדש הקרנות כוללות בידוד פלסמיד מן השמרים, הגברה וטיהור Escherichia coli, ואחריו טרנספורמציה של תאי שמרים טריים עם הפלסמיד 19. כל כפיל שנבחר מחדש הוקרן pentaplicate. </li></ol>

<ol>
	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

במאמר זה, יש לנו סכמתי רוב הטיפים והטריקים המועסקים במעבדה שלנו להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ס cerevisiae (באמצעות AAO כדוגמא), כך שהם יכולים להיות מותאמים לשימוש עם מערכות אנזימים האיקריוטים רבות אחרות על ידי ביצוע הגישה הנפוצה פשוט המתואר כאן. במונחים של יצירת ספרייה, Morphing היא שיטה בסיר אחד מהר כדי להציג ולשלב מחדש מוטציות אקראיות בתוך רצועות חלבון קטנות תוך השארת האזורים הנותרים של החלבון 16 ללא שינוי. ספריות עם כמה המון מוטציוני ניתן להכין בקלות recombined in vivo, יחד עם הפלסמיד לינארית, כדי ליצור וקטור מלא משכפלים באופן אוטונומי. זה קריטי, כי רצפים חופפים אגף כל מתיחה לאפשר שברי הגן המלא להיות מחדש באמצעות רקומבינציה in vivo, הימנעות PCR תגובות נוספות בצעדי קשירה במבחנה. ב p זהrotocol, תדירות אירועים מוצלבים בין שברי PCR יכול להיות מוגברת על ידי הקטנת הגודל של האזורים החופפים, אם כי זה עשוי לסכן את יעילות השינוי. לא משנה של polymerases DNA המשמש PCR מוטגנים, נטען מוטציוני יכול להיות מותאם על ידי בנייה בעבר וניתוח נופי ספריית מוטציה קטנה (איור 5 א). אם ערכת GeneMorph השנייה משמשת, זה עדיין מומלץ לעקוב גישה זו מאז רקומבינציה DNA vivo ב יכולה לשנות את עומסי מוטציוני בעיקר מוערכים על ידי היצרן. באופן כללי, נופים מוטנטית, 35 - 50% של שיבוטים הכולל הוקרנו יש פחות מ -10% מפעילות ההורים מתאימים קמפייני אבולוציה מכוונים, אם כי מספר זה משתנה כפונקציה של חלבון המטרה ופעילותה. בדרך כלל, הניתוח של נופי ספריות מוטציה מאומת נוסף על ידי רצפי DNA של מדגם אקראי של מוטציות. בדוגמה הנוכחית, תקי<html> DNA פולימרז שמש בשל השיעור הגבוה של הטעות שלה, אשר קשור לחוסר 3&#39;→ 5&#39;proof-קריאת פעילות exonuclease. נטען מוטציוני בספריות תקי שונו על ידי תוספת של ריכוזים שונים של MnCl 2, אך השימוש dNTPs מאוזן ו / או הפחתה בריכוזי תבנית הגן הם גם אפשרויות מתאימות. ולמגבלות של Morphing נובעת ממספר מגזרים להיות recombined. על פי הניסיון שלנו, עד ארבעה בלוקי חלבון (חמישה אירועים מוצלבים ספירה באזורים רקומבינציה עם הווקטור לינארית) ניתן שחבור עם תשואות טרנספורמציה טובות (~ 10 5 שיבוטים לכל תגובת טרנספורמציה). שיטה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי mutagenesis באתר-רוויה מרובה בצע (למשל, באמצעות NDT פריימרים מנוונים או יצירת ניוון עבור 22 קודונים ייחודיים) לחקור מספר תפקידים בו זמנית תוך צמצום מאמצי ההקרנה באופן משמעותי 21,22. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; פרוטוקול ההקרנה &quot;העיוור&quot; הישיר AAO הוא מאוד רגיש ואמין (מבוסס על זיהוי הישיר של H 2 O 2 תלות המצע בשימוש על ידי האנזים), מייצג assay משלים אחר ותיק עקיף פרוטוקולים לזהות חמצניים (peroxidases צימוד בעיקר עם מצעים colorimetric). ואכן, assay FOX הועסק באופן שגרתי כדי למדוד H 2 O 2 ב נוזלים ביולוגיים, וזה יכול עכשיו להיות מתורגם בקלות לתוך פרוטוקולים להתפתח AAO וכל אחרים H 2 O 2 בייצור אנזימים (למשל, oxidases גלוקוז, דהידרוגנאז cellobiose, Glyoxal oxidases, oxidases מתנול), במיוחד עבור פעילות על מצעים שאינם טבעיים שבו תגובות קשות אחרת כדי לזהות. ס cerevisiae הוא המארח הנאות ביותר אבולוציה מכוונת של גנים אוקריוטים שכן הוא מציע יעילויות הטרנספורמציה גבוהות (עד 1 x 106 transformants / מיקרוגרם DNA), הוא מבצע עיבוד שלאחר translational מורכב ושינויים (כולל N- ועיבוד C- מסוף, ו glycosylation) וזה מייצא חלבונים זרים לתוך מרק התרבות באמצעות מסלול הפרשה. בנוסף, כלי ביולוגיה מולקולרית ומבוססים זמינים לעבודה עם שמרים זה, כולל וקטורי הסעות חַד או דו-כיוונית episomal (בלתי משתלב) בשליטת היזמים של עוצמות שונות. ואחרון חביב, תדירות הגבוהה של רקומבינציה DNA ההומולוגית אפשרה מגוון של שיטות כדי להתפתח להשיג גיוון DNA כי נמצאים בשימוש כיום להתפתח חלבונים יחידים, כמו גם מסלולי אנזימים מורכבים יותר 8, 12, 13, 23. תיקון פער ​​vivo ב ואת מכשיר קורא ההוכחה שמרים זה יכול גם להיות מועסק כדי ליצור מפלצות כאשר recombining גנים שונים (הכולל כ. 60% של זהות רצף ה- DNA), כמו גם דשדוש טובת צאצאים / מוטציות מתוך ישירה&quot;ד קמפיין האבולוציה, או להפגיש במבחנה בשיטות רקומבינציה vivo בסיבוב אחד של האבולוציה, ובכך להעשיר ספריות מוטציה מבחינת foldability ותפקוד.

אבולוציה מולקולרית בימוי היא שיטה חזקה, מהירה ואמינה לעצב אנזימים 1, 2. דרך סיבובים איטרטיבי של מוטציות אקראיות, רקומבינציה הקרנה, הגירסות משופרות של אנזימים יכולות להיוצר שפועלים על מצעים חדשים, בתגובות רומן, ב שאינו טבעי סביבות, או אפילו כדי לסייע התא כדי להשיג את המטרות מטבוליות חדשות 3-5. בין המארחים המשמשים אבולוציה מכוונת, את cerevisiae Saccharomyces שמרי בירה מציע רפרטואר של פתרונות עבור הביטוי הפונקציונלי של חלבונים איקריוטיים מורכבים שאינם זמינים אחרת עמיתיהם פרוקריוטים 6,7. משומשים ממצה מחקרים בביולוגיה של התא, מודל אוקריוטים הקטן הזה יש יתרונות רבים מבחינת שלאחר translational שינויים, קלות ויעילות מניפולציה וטרנספורמציה, שכולן הן התכונות החשובות להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת 8. יתר על כן, תדירות גבוההשל רקומבינציה DNA ההומולוגית ס cerevisiae מצמיד את מנגנון הוכחת הקריאה היעיל בה פותח מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ספרייה והרכבת גני in vivo, טיפוח האבולוציה של מערכות שונות אנזימים יחידים מסלולים מלאכותיים מורכבים 9-12. המעבדה שלנו בילתה את העשור האחרון בעיצוב כלים ואסטראטגי עבור האבולוציה המולקולרית של ligninases השונה בשמרים (oxidoreductases מעורב השפלה של ליגנין במהלך דעיכת עץ טבעית) 13-14. בתקשורת זו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכין וספריות מוטצית מסך ס cerevisiae עבור מודל flavooxidase, מונואמין -aryl-אלכוהול (AAO 15) -, כי יכול להיות מתורגם בקלות אנזימים רבים אחרים. הפרוטוקול כרוך שיטת אבולוציה ממוקדת מכוון (Morphing: תהליך רקומבינציה מוטגנים מאורגן על ידי הומולוגי in vivo קיבוץ) נעזרה במנגנון שמרים תא 16, גידולassay ההקרנה מאוד רגיש דה המבוססת על התגובה פנטון על מנת לזהות פעילות AAO מופרש לתוך המרק תרבות 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

אבולוציה מכוונת ב שמר אפייה מציעה יתרונות רבים אטרקטיביים בעת תכנון אנזימים עבור יישומים ביוטכנולוגיים, תהליך כרוך בבנייה, שיבוט וביטוי של ספריות מוטציה, מצמיד את רקומבינציה DNA בתדר גבוה ההומולוגית in vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור ספריות מוטציה מסך בשמרים המבוססת על הדוגמא של מונואמין aryl-אלכוהול פטרייתי (AAO) כדי לשפר את הפעילות הכוללת שלה. שני מקטעי חלבון היו נתונים האבולוציה ממוקד בבימויו של mutagenesis אקראי וב רקומבינציה DNA vivo. מסוכך של ~ 50 נ&quot;ב איגוף בכל מגזר אפשר וההרכבה הנכונה של גן AAO-פיוז&#39;ן וקטור לינארית והוליד פלסמיד משכפלים מלא באופן אוטונומי. ספריות Mutant מועשרות גרסות פונקציונליות AAO הוקרנו ס supernatants cerevisiae עם assay תפוקה גבוהה רגיש המבוססת על התגובה פנטון. התהליך הכללי שלבניית ספרייה ב ס cerevisiae המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם להתפתח גני האיקריוטים רבים אחרים, הימנעות PCR תגובות נוספות, ב- DNA במבחנת צעדי רקומבינציה קשירה.

AAO מ פ eryngii הוא flavooxidase תאי המספק peroxidases פטרייתי עם H 2 O 2 כדי להתחיל לתקוף ליגנין. שני קטעים של AAO היו נתוני אבולוציה ממוקדת בבימויו של Morphing כדי לשפר את פעילותה וביטויו ס cerevisiae 19. בלא קשר עם אנזימים חוץ שטיפחו ס cerevisiae, הנושא הקריטי ביותר בעת בניית ספריות מוטציה בשמרים נוגעת ההנדסה של אזורים חופפים ספציפיים להעדיף את השחבור בין שברי השיבוט שלהם לתוך הווקטור לינארית. בדוגמה הנוכחית, עבור כל תגובה PCR, כל שברי היה המסוכך של כ -50 נ&quot;ב לקדם שחבור vivo בשמרים. מספר אירועי רקומבינציה תלוי במספר המגזרים צריך להרכיב את הציוד משובט עם הווקטור לינארית (כלומר, שני אירועים מוצלבים התקיימו ביןבשלושה מגזרים PCR -The בשני מגזרי מוטגנים איגוף segment- הלא mutagenized בתוספת שני צמתים נוספים עם וקטור לינארית; איור 1). על פי הניסיון שלנו, רצפים חופפים יותר מ -50 נ&quot;ב להקטין את הסבירות של רקומבינציה פנימית בזמן שהם לא לשפר את היעילות הטרנספורמציה. המון מוטציוני הותאמו באמצעות דגימת ספריות מוטציה עם נופים שונים, בחישוב מספר שיבוטים עם &lt;10% של פעילות האנזים הורית, ובהמשך לבדוק אותם על ידי רצף מדגם אקראי של וריאנטים הפעיל והלא פעיל (איור 5 א). לקביעת המקדם השונה ס תאי cerevisiae שהוסבו עם AAO ההורים מצופים על ושחרר SC צלחות. מושבות בודדות היו נקטפים מחוסנים בתוך צלחת גם 96 ואת הפעילות של השיבוטים הוערכה מן ההכנות טריות. מדגם מוטגנים2 (תקי / MnCl 2 0.05 מ&quot;מ) נבחר כנקודת היציאה לבניית הקרנת ספרייה. היות והפעילות הביולוגית של AAO מגביר את הריכוז H 2 O 2 במדיום התגובה, חיפשנו assay רגיש ומדויק לכמת שינויים קלים H 2 O 2. FOX היא שיטה כימית המבוססת על התגובה פנטון 20, לפיה חמצון על ידי H 2 O 2 כוננים התגובה של Fe 3+ עם כתום xylenol לגבש כחול-סגול מורכבים (o -cresolsulfone-phthalein 3 &#39;, 3&#39; &#39;- bis (methylimino) diacetate ε 560 = 1.5 x 10 4 M -1 cm -1). צעד חמצון הברזל היה מוגבר על ידי הוספת סורביטול כדי לשפר את הרגישות של assay, הגדלת ההתפשטות של רדיקלים עם ε לכאורה 560 = 2.25 x 10 5 M -1 cm -1 (אלחוטיאיור 4). את גבול הגילוי של assay זה (בטווח מיקרומטר) חושב לפי שיטת קביעת בלנק בצלחת 96-היטב עם סטנדרטים בשלושה עותקים (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו -4 מיקרומטר H 2 O 2 ) ושימוש כמה supernatants מ ס cerevisiae חסר URA3 - פלסמיד (איור 5). את הבחינה כמו ליניארי בנוכחות סורביטול (עד 8 מיקרומטר של H 2 O 2), ולמרות ליניאריות היה יותר מתמיד בהיעדר סוכר זה (לפחות עד 30 מיקרומטר של H 2 O 2), התגובה הייתה חלשה (למשל, ב -6 מיקרומטר של H 2 O 2, שיפור של פי 4 הושג בנוכחות סורביטול -deep בסגול מתוך ספיגה של 0.24 בהעדרה -dark הכתום (איור 5 ב)). הקשר בין שרירי בטן ואת ריכוז AAO הוערך עם כמויות גדלות והולכות של דוארnzyme (מן supernatants שמרים) ו תגובה ליניארי נצפה; R 2 = 0.997 (איור 5 ג). ראוי לציין כי אות FOX הייתה יציבה במשך כמה שעות ללא כל הפרעה נראית לעין על ידי הגורמים השונים במרק התרבות. הרגישות המוערכת של FOX הייתה ~ 0.4 מיקרומטר של H 2 O 2 המיוצר על ידי AAO ב supernatant בנוכחות סורביטול, ו ~ 2 מיקרומטר בהעדרה. ספריית מוטציה של 2,000 שיבוטים נבנתה והוקרנה עם assay זה. מוטנטים כמה AAO זוהו עם הפרשה השתפרה בעיקר ופעילות נגד אלכוהול p -methoxybenzyl (5D איור) 19. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig1.jpg" /> איור 1.. Morphing פרוטוקול אבולוציה AAO שני אזורים שונים של AAO היו מטרה mutagenesis ו רקומבינציה אקראית: M1 (כחול, 590 נ&quot;ב) הכוללת את הפפטיד האות (SP); M2 (צהוב, 528 נ&quot;ב). אזור HF (האפור, 844 נ&quot;ב) היה מוגבר עם polymerases איכות גבוהה. אזורים מוטגנים מופו במבנה הגבישי של AAO (PDB מזהה: 3FIM). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig2.jpg" /> הכנה איור 2. של מוצרים PCR ואת לינארית וקטור (א) ג&#39;ל agarose אנליטית (1% w: נ). המכיל סמן משקל מולקולרי (1 סולם kb) במסלולים 1 ו -7; בם HI ו Xho וקטור לינארית לי, מסלול 2; PCR קטע M1, מסלול 3; PCR קטע M2, מסלול 4; HF קטע PCR, מסלול 5; נאיבו מחדש וקטור לינארית עם Nhe אני (המכיל את גן AAO המלא עם אזורי MI, HF ו- M-II), ליין 6. (ב) לינאריזציה וקטור, מסלולי 1 ו -6 סטנדרטים מולקולריים, סולם Kb 1; פלסמיד miniprep, מסלול 2; פלסמיד לינארית עם Nhe אני, מסלול 3; פלסמיד לינארית עם Bam HI ו Xho לי, מסלול 4; הפלסמיד לינארית מתקבל על ידי מיצוי ג&#39;ל לניקוי לאחר עיכול, ליין 5. (ג) פרוטוקול טיהור פלסמיד. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig3.jpg" /> איור 3. פרוטוקול הקרנת תפוקה גבוהה. סקירה כללית של התהליך. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig4.jpg" /> איור 4. שיטת FOX. פטריות לבנות-ריקבון לתקוף את דופן התא של עץ באמצעות תגובה פנטון שמייצרת הידרוקסיל רדיקלי OH •. זוגות שיטת FOX שתגובה זו xylenol הכתום (XO), ואת הספיגה של מתחם 3+ XO-Fe נמדדה ב 560 ננומטר. חמצון שחור מוגבר על ידי התוספת של סורביטול לתערובת המגיבה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig5.jpg" /> איור 5. מוטגנים נופי הדרכה לספריות Morphing שימוש שגיאה שונה נוטה PCR תנאים ותיקוף של Assay ההקרנה. (א </stro<html> ng&gt;) נופים Morphing. קו אופקי מוצק מציגה את פעילות מן הסוג ההורים ב assay ואילו קווים מקווקווים מציינים את מקדם ההשתנות של assay. האחוזים מציינים את מספר שיבוטים עם פחות מ -10% של פעילות האנזים ההורית. פעילויות נרשמות בסדר יורד. (ב) גבול גילוי FOX הוערך עם ריכוז גדל והולך של H 2 O 2 (העיגולים השחורים) הנוכחות והיעדרות (ריבועים לבנים) של סורביטול. (C) קשר לינארי בין ריכוז AAO (supernatants transformant) ו- ABS 560nm. כל נקודה תואמת את הממוצע של 8 ניסויים וכולל את סטיית התקן. (ד) נוף הספרייה Mutant. וריאנטים הנבחרים (המרובע מוצל) היו rescreened כפי שדווחו במקומות אחרים 19. קו מוצק מציג את הפעילות מסוג הורי AAO.&gt; אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Views.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Genetics

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של תפקודי חלבונים באמצעות טכניקות תצוגת פני שטח של שמרים

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioengineering

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

בימוי שיטת אבולוציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב