Name: growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

نشكر أعضاء الحاليين والسابقين في المختبر روبنشتاين لتوفير بيئة بحثية داعمة ومتحمسة. نشكر ريان T. جيبسون للمساعدة في بروتوكول الأمثل. نشكر كافة Hochstrasser (جامعة ييل) وديتر وولف (جامعة شتوتغارت) للسلالات الخميرة والبلازميدات. نشكر المراجعين المجهولين لدينا لمساعدتهم في تحسين وضوح وفائدة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة بحثية من جامعة ولاية الفصل الكرة من سيجما كاي لSGW، والمعاهد الوطنية للصحة منح (R15 GM111713) لإقليم شرق المتوسط، وهي جائزة بحوث جامعة ولاية الكرة أسباير لإقليم شرق المتوسط، وصناديق من جامعة ولاية الكرة مكتب نائب مدير الجامعة وقسم الأحياء.

1. الخميرة الفحص النمو لتحديد المسوخ المرشح عيب في تدهور البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة مع ترميز البلازميد بروتين غير مستقر تنصهر، في الإطار، إلى إنزيم مراسل التمثيل الغذائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم transformants في 5 مل من الاصطناعية تعريف (SD) الحد الأدنى من المتوسط ​​الذي هو انتقائية لخلايا إيواء جزيئات البلازميد. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والخلايا في الثقافة قد تكون إما في مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت الحد الأدنى من OD 600 من 0.2. قد تتطلب سلالات الخميرة جدا بطيئة النمو مرات حضانة يلة تعد من واحد، أو تلقيح عدد أكبر من الخلايا، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ستة أضعاف التخفيفات المسلسل من خلايا الخميرة تحول في العقيمة لوحة 96-جيدا، بدءا من الخلايا المخفف لن OD 600 من 0.2. وضع كل المحولة الخميرة إلى أن يعاير في صف مختلف في لوحة 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل المحولة، وحساب حجم الثقافة بين عشية وضحاها المطلوبة لتمييع الخلايا إلى OD 600 من 0.2 في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. إضافة هذا الحجم من الثقافة بين عشية وضحاها إلى المقابلة بشكل جيد في العمود 1. إضافة كمية مناسبة من الماء المعقم لتبرزي حجم إلى 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل صف من الخميرة، إضافة 125 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الآبار في الأعمدة 2 و 3 و 4. ملاحظة: قد يتم تعبئتها ملفوفة بشكل فردي معقمة لوحات 96-جيدا مع أغطية معقمة. ويمكن استخدام الأغطية كمخازن للمياه معقمة التي يتم توزيعها في هذه الخطوة. وهذا يسمح نقل في وقت واحد من الماء المعقم لجميع الآبار في عمود معين مع pipettor الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط محتويات العمود الأول (الخميرة المخفف إلى OD 600 من 0.2) من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع pipettor الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfإيه 25 ميكرولتر من الخميرة من العمود 1 إلى العمود 2، وذلك باستخدام pipettor الأقنية. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقل 25 ميكرولتر من العمود 2 إلى العمود 3، و 25 ميكرولتر من عمود إلى عمود 3 4 (يمزج جيدا في كل خطوة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط كل عينة مع pipettor الأقنية. وانطلاقا من معظم مخفف إلى الأقل يخفف أعمدة من الخميرة، وماصة 4 ميكرولتر من كل عينة على اثنين من لوحات تحتوي على وسيلة انتقائية المناسب. استخدام لوحة واحدة مع المتوسطة التي تحافظ على اختيار بلازميد (تخدم هذه اللوحة بمثابة اكتشاف الخميرة والسيطرة النمو). استخدام لوحة الثانية مع المتوسط ​​أن يختار لصيانة بلازميد والتعبير عن بروتين غير مستقر تنصهر إلى إنزيم مراسل. لأن الخميرة تستقر بسرعة، ومزيج الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا على فترات منتظمة. ملاحظة: سوف جفافا لوحات تمتص بسهولة أكثر سيولة من الطازجة لوحات، وبالتالي ينصح لهذه التجارب. قد يكون المجفف لوحات رطبة من قبل حضانة في درجة حرارة الغرفة في لوالرطوبة ث ل1 - 2 أيام أو حضانات أقصر في غطاء تدفق الصفحي. لوحات قد يجف بشكل غير متساو إذا كان تدفق الهواء صفائحي موازية للمقاعد البدلاء. استخدام قالب يجعل من السهل على الفور خلايا الخميرة على مسافات منتظمة. وتقدم اثنين من عينة القوالب في الشكل 1، وهذه قد تكون طباعة، قطع، واضافته إلى داخل طبق بتري غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحات لتجف على أعلى مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 2 - 6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير كل لوحة بعد الحضانة. </li></ol><img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> الشكل 1. قوالب لاكتشاف خلايا الخميرة على لوحات أجار 100 ملم. ويمكن استخدام هذه القوالب لتسهيل اكتشاف الخميرة على مسافات منتظمة مع pipettor الأقنية. قد تتم طباعة القوالب، وقطع بها، واضافته الى داخل طبق بتري غطاء. وضع طبق بتري مع النموغطاء داخل متوسطة مع قالب الملصقة. وتتميز القوالب مع الشق لتتبع التوجه. فمن المستحسن أن لوحات تستخدم في فحوصات النمو يتم وضع علامة بالمثل مع الشق لتتبع التوجه. قوالب لاكتشاف أربعة (A) أو خمسة (B) يتم توفير التخفيفات المسلسل من خلايا الخميرة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة قابلة للطباعة من هذا الرقم مع قوالب 100 ملم.</a> 2. تأكيد البيوكيميائية دمغ المصوغات نمو الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نمو خلايا الخميرة وبعد القلوية البروتين استخراج (معدلة من 31) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة مع ترميز البلازميد بروتين غير مستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم transformants في 5 مل من SD المتوسطة التي هي انتقائية لخلايا إيواء جزيئات البلازميد. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من كل متر مكعب بين عشية وضحاهاlture. ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، قد تكون الخلايا في أي مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة ولكن ينبغي أن يكون وصلت إلى OD 600 من شأنها أن تسمح التخفيف إلى OD 600 من 0.2 في 10 مل المتوسطة انتقائية جديدة (الخطوة 2.1.4). قد تتطلب سلالات الخميرة جدا بطيئة النمو مرات حضانة يلة تعد من واحد، أو تلقيح عدد أكبر من الخلايا، كما تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع خلايا الخميرة إلى OD 600 من 0.2 في 10 مل المتوسطة انتقائية الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في احتضان خلايا في 30 درجة مئوية، بالتناوب أو الهز، وحتى الثقافات التوصل الى OD 600 بين 0.8 و 1.2 (أي هي في نمو منتصف لوغاريتمي). ملاحظة: إذا كان البروتين غير مستقر من الفائدة هو تحت سيطرة أحد المروجين regulatable، قد تختلف التوقيت الأمثل للتحريض التعبير البروتين والحصاد خلية وفقا لدراسات السابقة أو الملاحظات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 2.5 OD 600 وحدة الثقافة في 15 مل مخروطيآل أنبوب بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. ملاحظة: واحد OD يعرف 600 وحدة كما كمية الخميرة موجودة في 1 مل من ثقافة في OD 600 من 1.0. حجم الثقافة (في مل) المطلوبة لحصد 2.5 OD 600 وحدة (V) ​​يمكن تحديد باستخدام المعادلة التالية: V = 2.5 OD 600 وحدة / OD قياس 600 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 1 مل الماء المقطر. نقل خلايا علقت لأنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 6،500 x ج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر الماء المقطر pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل، وإضافة 100 ميكرولتر 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه (معظمها لم يصدر بعد البروتينات ولا تزال قابلة للحياة) بواسطة الطرد المركزي عند 18،000 العاشرز لمدة 5 دقائق. إزالة طاف قبل pipetting أو الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 50-100 ميكرولتر 1X Laemmli عينة العازلة، والتي سوف ليز الخلايا، من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو vortexing ل. ملاحظة: إزالة طاف القلوية التالية الطرد المركزي وإعادة تعليق لاحق من الخلايا في Laemmli عينة عازلة استخراج البروتينات في الرقم الهيدروجيني متوافقة مع دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) باستخدام نظام تشغيل عازلة تريس، جليكاين والنشاف الغربي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتفسد تماما البروتينات، واحتضان لست] في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قد تصبح البروتينات تجميع المعرضة لل(مثل البروتينات مع عدة قطاعات عبر الغشاء) غير قابلة للذوبان عندما حضنت في 95 ° C: ملاحظة. ولذلك، ينبغي المحتضنة لست] في درجات حرارة منخفضة (على سبيل المثال 37 ° C - 70 ° C) لمدة 10 - 30 دقيقة، كما تحدد تجريبيا، لتحليل هذه البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] باردة عن طريق وضع على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لست] الطرد المركزي في 18،000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. فصل طاف (يذوب البروتين المستخرج) من خلال SDS-PAGE قبل لاحق تحليل لطخة الغربي (القسم 2.2). بدلا من ذلك، لست] تخزينها في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول النشاف الغربي تمثيلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حجم تصميما تجريبيا لللست] في جل SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام في 200 V حتى صبغ الجبهة وصلت إلى الجزء السفلي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من هلام لفلوريد البولي فينيل (PVDF) الغشاء عن طريق التحويل الرطب في 20 V لل60-90 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غشاء التي تفرخ في 5٪ الحليب الخالي من الدسم في تريس مخزنة المالحة (TBS)، هزاز، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين من الفائدة (أو علامة حاتمة منها) في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS مع 0.1٪ توين-20 (TBS / T) لمدة 1 ساعة في غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع fluorophore مترافق المناسب الضد الثانوية في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. ملاحظة: لأن fluorophores حساسة للضوء، ينبغي إعداد التخفيفات من الأجسام المضادة fluorophore مترافق في الظلام. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يحدث حضانة الأغشية في وجود الأجسام المضادة fluorophore مترافق في حاويات lightproof. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق لف صواني الحضانة في رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة غشاء باستخدام لى كو أوديسي CLX والبرمجيات صورة استوديو (أو معدات التصوير المماثلة والبرمجيات)، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير الغشاء، واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لتحميلالبروتين السيطرة جي في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع fluorophore مترافق المناسب الضد الثانوية في 1٪ الحليب الخالي من الدسم في TBS / T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل الأجسام المضادة، وغسل غشاء 3 × 5 دقائق مع TBS / T في درجة حرارة الغرفة، هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة غشاء باستخدام لى كو أوديسي CLX والبرمجيات صورة استوديو (أو معدات التصوير المماثلة والبرمجيات)، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

منهجية المقدمة هنا تسمح لتحديد السريع وتأكيدا الكيمياء الحيوية من متطلبات الجينية للتدهور البروتين في خلايا الخميرة. هذه التجارب تبرز فائدة وقوة الخميرة على أنها كائن وحيد الخلية نموذج (عدة مراجعات ممتازة من الخميرة البيولوجيا ومصنفات من بروتوكولات لمناولة وتخزين، والتلاعب خلايا الخميرة (على سبيل المثال 41-44) متاحة للمحققين جديد للكائن الحي). يمكن بسهولة تطبيق تقنيات للتحقيق في تدهور وفرة من مجموعة متنوعة من فئات من البروتينات. على سبيل المثال، وآخرون استخدام هذه الاستراتيجية لتوصيف آليات تدهور عصاري خلوي غير مستقر والطاقة النووية، وER اللمعية والبروتينات عبر الغشاء 45-49. ويجب النظر في عدد قليل من العوامل في اختيار انزيم الأيضي لتلتحم لبروتين غير مستقر. أولا، من الضروري أن نسخة وظيفية من الجينات ترميز الانزيم لاأن تكون موجودة في الجينوم المضيف. للحد من نتائج إيجابية كاذبة (أي نمو في ظل ظروف انتقائية عندما البروتين غير مستقر هو المتدهورة في الواقع)، فمن المستحسن للعمل مع السلالات التي تؤوي غير بالعودة-الأليلات الطافرة من الجين مراسل (الحذف الجينات ويفضل كاملة) 50. وهناك اعتبار آخر لاختيار الإنزيم المراسل هو توافر مثبطات تنافسية، والتي يمكن تضمينها في وسط النمو الانتقائي للحد من النمو الخلفية وتعزيز فحص صرامة. قد يكون هذا مفيدا في حالات البروتينات مع معدلات دوران منخفضة نسبيا حتى في وجود آليات تدهور تعمل بكامل طاقتها. في التجارب التمثيلية المعروضة هنا، وإدراج 3-AT، الذي يثبط انزيم تنافسية HIS3، ويقلل من نمو الخلفية 40. وبالمثل، فإن مجمع 6-azauracil يمنع Ura3، انزيم اللازمة لاليوراسيل الحيوي 51. تركيز مثبط فى النمو الذي يحدث في تدهور-دefective في، ولكن ليس البرية من نوع، ويجب تحديد خلايا تجريبيا. قد تكون بعض الإنزيمات الأيضية أيضا اختيار مضادة ضد. في ظل ظروف مكافحة انتقائية، قد خلايا تنمو فقط عند تدهور البروتين غير مستقر (وانزيم الأيض تنصهر غير موجود). على سبيل المثال، Ura3 تحويل مجمع حمض 5-fluoroorotic (5-FOA) إلى مركب سام، 5-فلورويوراسيل 52. سوف الخلايا معربا عن بروتين Ura3 الانصهار تنمو إلا في وجود 5-FOA إذا تدهور البروتين الانصهار Ura3. وبالمثل، فإن مجمع حمض 5-fluoroanthranilic (5-FAA) هو سامة للخلايا وظيفية مع التربتوفان الحيوي المسار. وبالتالي قد 5-FAA أن تستخدم لمكافحة حدد لخلايا التعبير عن البروتينات Trp1 الانصهار 53. قد تكون استراتيجيات مكافحة اختيار مفيدا لتحديد المكثفات من الطفرات إضعاف تدهور. المروج تستخدم لدفع التعبير عن مراسل تدهور كما يجب مختارة بعناية. مستويات منخفضة من حيث biosynthقد تكون الإنزيمات ETIC كافية لدعم النمو في غياب المستقلب الموردة خارجيا، ويوصى المروج ضعيفة 54. في التجارب التمثيلية المعروضة هنا، المروج GAL4، التي قمعت في وجود الجلوكوز 55، ويستخدم لتعزيز نسخ من Deg1 -Sec62-HIS3. التعبير القاعدية من هذا البروتين الانصهار في ظل ظروف قمع (أي 2٪ الجلوكوز) كافية لدعم النمو في ظل ظروف انتقائية (أي عدم وجود الحامض الاميني وجود من 1 - 2 مم 3-AT) عندما تم تعطيل آلية تدهور. ومع ذلك، مستويات البروتين كافية لدعم النمو في ظل من المحتمل أن تكون دون عتبة الكشف عن طريق النشاف الغربي شروط انتقائية. لذلك، قد يكون من الضروري لدفع التعبير مع المروج ضعيفة للمقايسة النمو والمروج أقوى لتأكيد الكيمياء الحيوية. في حالة Deg1 -Sec62 (مع أو من دون الانصهار HIS3)، وهو أكثر robusر المروج (هنا، المروج MET25 39) مطلوب لتصور البروتين عن طريق التحليل الغربي. كما هو موضح هنا، ونمو فحص القائم على الخميرة يمكن أداؤها على نهج القائم على مرشح على نطاق صغير. يتم إعداد التخفيفات المسلسل من خلايا الخميرة في لوحة 96 جيدا ونقل من قبل pipetting إلى متوسطة النمو القوي. طريقة بديلة لنقل فعالة وقابلة للتكرار من المخفف تعليق خلية الخميرة على وسط صلب هو استخدام المكرر متعددة دبوس، ويشار إليه باعتباره &quot;FROGGER&quot; 56. الوقت المثالي لتصوير ستختلف وحات مع سلالات الخميرة والشروط. فمن المستحسن لتصوير لوحة معينة عندما المستعمرات من أسرع تنامي ثقافة تصبح أول مرئية في البقعة الأكثر المخففة. هذا هو عادة النقطة التي الاختلافات في معدلات النمو بين العينات هي الأكثر وضوحا. قد يكون من المستحسن لالتقاط صور فوتوغرافية على أيام متعددة، لا سيما في حالة من الخميرةمعرض مجموعة واسعة من معدلات النمو. ويمكن أيضا أن تتكيف مراسل مقايسة على أساس النمو ليحلل نطاق واسع. على سبيل المثال، يمكن إدخال مراسل تدهور في مكتبة المتاحة تجاريا من ~ 5،000 سلالات فرداني حذف الخميرة الجينات قابلة للحياة باستخدام الاصطناعية صفيف الوراثي (SGA) والتكنولوجيا 46،57. في هذه التقنية، تزاوج سلالة الخميرة فرداني مع متكامل صبغويا الأيض البروتين مراسل الانصهار في كل سلالة من المكتبة حذف الجينات. ويتسبب الخلايا الناتجة مضاعفا لبذرت (الخضوع الانقسام المنصف) وتعرض لاختيار ذرية الانتصافي فرداني بايواء كل من مراسل الأيض والحذف الجينات الفردية. ثم يتم نقل هذه السلالات بشكل جماعي لانتقائية المتوسط ​​للخلايا التي تم استقرت البروتين. أما بالنسبة للتحليل على نطاق صغير، إذا تم حذف الجينات التي لها دور في تدهور البروتين، سيتم استقرت البروتين الانصهار، وسيتم تعزيز نمو الخلايا. مقارنة لوقد وضعت pproaches التي تسمح للتحول في وقت واحد من مجموعة كبيرة من سلالات مع اضافية صبغويا البلازميدات الإبقاء عليها؛ هذه الاستراتيجية يغني التكامل الكروموسومات، التزاوج، تبوغ، واختيار الانتصافي 54. عند العثور على طفرة في منح ميزة نمو الخلايا ايواء مراسل التمثيل الغذائي، فمن الضروري لتأكيد كيميائيا أن الطفرة تزيد من وفرة من البروتين من الفائدة. إجراء الخميرة تحلل سريع وموثوق بها، وتكييفها بشكل وثيق من طريقة Kuhsnirov 31، وتقدم. هذا البروتوكول يسمح لاستخراج البروتينات في شكل مناسب مباشرة لتحليلها من قبل النشاف الغربي. لتحليل بروتين معين، ومقدار المحللة إلى أن يتم تحميل لكل بئر، والخصائص هلام الأكريلاميد، يجب أن يكون اختيار الغشاء، والأجسام المضادة المستخدمة والتخفيفات منها، وطريقة الكشف العزم تجريبيا. وصف بروتوكول النشاف الغربي تمثيلي التحريرilizes الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى الأصباغ الفلورية. البروتوكولات الأخرى التي تستخدم عادة تعتمد على معان كيميائي يعتمد على الأجسام المضادة مترافق الانزيمات 58. كما هو موضح هنا، الغشاء المستخدمة للكشف عن البروتين من الفائدة قد يكون reprobed مباشرة مع الأجسام المضادة لبروتين تحكم التحميل. إذا كان قد تم رفع الأجسام المضادة الأولية المستخدمة للكشف عن البروتين من الفائدة والبروتين تحكم التحميل من نفس النوع، reprobing الغشاء هو ممكن طالما أن العصابات الناشئة عن هذه البروتينات لا شارك في الهجرة. ولكن، إذا تم رفع الأجسام المضادة الأولية المستخدمة للكشف عن البروتين من الفائدة والبروتين تحكم التحميل من مختلف الأنواع، ونفس الغشاء يمكن بحثها بالتتابع، حتى لو العصابات شارك في الهجرة، إذا كان قد تم مترافق الأجسام المضادة الثانوية لfluorophores مع انبعاث موجات مختلفة. في حالة أن البروتين من الفائدة وتحكم التحميل البروتين شارك في ترحيل والأجسام المضادة الأولية منها كانت الرايالحوار الاقتصادي الاستراتيجي من نفس النوع، يمكن حل عينات على اثنين من المواد الهلامية SDS-PAGE، ونقل إلى غشاء PVDF، تناولت بحث بشكل منفصل مع الاجسام المضادة المحددة للبروتين البروتين الفائدة والسيطرة التحميل. بدلا من ذلك، قد يكون الحكم الاتساق تحميل التي يحتضنها الأغشية مع بقع البروتين غير محددة (على سبيل المثال Coomassie أو الشقائقية S). وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول النشاف الغربي التمثيلي يفترض بروتين أو حاتمة التي تم الكشف عنها بواسطة حضانة متتابعة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية، كما هي الحال. البروتينات الانصهار تحليلها في نتائج تمثيلية تحتوي على اثنين من الحواتم المستمدة من المكورات العنقودية الذهبية البروتين ألف (تحليل مخاطر الآفات في أرقام 2 و 3). البروتين ويربط مباشرة إلى المناعية الثدييات، وبالتالي يمكن الكشف باستخدام الأجسام المضادة الثانوية وحدها (أي لا يلزم خطوة حضانة الأجسام المضادة الأولية) 59. ومن الممكن أن الاندماج من إنزيم مراسل قد تؤثر على وفرة البروتين أوتدهور. ولذلك فمن المستحسن لتأكيد كيميائيا النتائج باستخدام نسخة من الركيزة غير المربوطة التي كتبها البروتين المراسل. وأخيرا، سواء المقايسات الموصوفة هنا تعتمد على الاختلافات في مستويات البروتين الحالة المستقرة كوكيل لاختلافات في استقرار البروتين. بسبب وفرة البروتين تعكس التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور، مزيد من التحليل الكيميائي الحيوي (على سبيل المثال سيكلوهيكسيميد مطاردة أو نبض مطاردة التجارب) يجب أن توظف لتحليل الشخصية مباشرة الديناميكي تدهور البروتين في. نتائج تمثيلية تضع تطبيق الرواية من هذا البروتوكول لتحديد متطلبات الجينية للتدهور البروتين الذي يشارك aberrantly في translocon ER. Deg1 -Sec62-HIS3 تمنح ميزة نمو الخميرة تحت شروط انتقائية عندما تم إبطال مفعولها مسار التدهور (أي في غياب اليوبيكويتين يغاز Hrd1). بروتين سريعة وموثوق بها سابقاطريقة الجر تليها النشاف الغربي أكد زيادة في وفرة من Deg1 -Sec62 (مع أو بدون HIS3) في غياب Hrd1. وتشير الدراسات السابقة أن آلية تدهور Hrd1 التي تعتمد على البروتينات المرتبطة translocon تختلف عن تلك الخاصة الأخرى Hrd1 ER اللمعية أو عبر الغشاء ركائز 32. والعمل في المستقبل توظف البروتين الانصهار Deg1 -Sec62-HIS3 في شاشات الوراثية على نطاق واسع لتحديد جينات جديدة اللازمة لهذه الآلية تدهور فريدة من نوعها.

تدهور البروتين انتقائية ضروري للحياة حقيقية النواة، ويسهم تدهور البروتين تغير لعدد من الحالات الطبية، بما في ذلك عدة أنواع من السرطان وأمراض الاعصاب وأمراض القلب والأوعية الدموية، والتليف الكيسي 1-5. النظام اليوبيكويتين-proteasome و(UPS)، والذي يحفز تدهور البروتين انتقائية، هو الهدف العلاجي الناشئة عن هذه الظروف 6-10. ligases اليوبيكويتين نعلق تساهميا البوليمرات من حمض اليوبيكويتين 76-الأمينية إلى بروتينات 11. يتم التعرف على البروتينات التي تم تحديدها مع سلاسل polyubiquitin وبروتين محلل من قبل ~ 2.5 megadalton 26S proteasome و12. وكانت الدراسات التي بدأت في كائن وحيد الخلية نموذج خميرة الخباز (مهدها الخميرة) التأسيسي في توضيح آليات تدهور البروتين في الخلايا حقيقية النواة. وكانت أول الركيزة الفسيولوجية أثبتت من UPS الخميرة قامع النسخي MATα2 13، تم تحديد أول 14، والعديد من المكونات حفظا للغاية من UPS أو تتميز في الخميرة (على سبيل المثال 15-26). الاكتشافات التي تمت في هذا النموذج الحي تنوعا ولين العريكة وراثيا من المرجح أن تواصل تقديم نظرة ثاقبة على آليات الحفاظ عليها من التدهور بوساطة اليوبيكويتين. الاعتراف وتدهور معظم ركائز UPS تتطلب اتخاذ إجراءات متضافرة من البروتينات متعددة. ولذلك، هدفا هاما في وصف تدهور المنظم للبروتين غير مستقر معين هو لتحديد متطلبات الوراثية لالتحلل البروتيني. النهج الكلاسيكية (مثل نبض مطاردة والتجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة 27) لرصد تدهور البروتين في خلايا الثدييات أو الخميرة هي شاقة وتستغرق وقتا طويلا. في حين أن هذه الأنواع من منهجية توفر وسيلة حساسة للغاية للكشف عن تدهور البروتين، فهي ليست مناسبة للتحليل السريع للتدهور البروتين أو على نطاق واسع screeniنانوغرام للطفرات التي تمنع تدهور البروتين. هنا، يتم تقديم مقايسة على أساس نمو الخميرة لتحديد السريع لمتطلبات الوراثية لتحلل البروتينات غير مستقرة. في طريقة أساس نمو الخميرة لتحليل تدهور البروتين، وهو بروتين غير مستقر من الفائدة (أو إشارة تدهور) وتنصهر، في الإطار، إلى البروتين ما هو مطلوب لنمو الخميرة تحت ظروف معينة. والنتيجة هي الركيزة الاصطناعية التي قد تكون بمثابة أداة قوية لتحديد متطلبات الوراثية من تدهور البروتين من بروتين غير مستقر في المصالح. ملائم، الأكثر استخداما سلالات الخميرة مختبر تؤوي لجنة من الطفرات في الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية تشارك في التركيب الحيوي معينة من الأحماض الأمينية أو القواعد النيتروجينية (على سبيل المثال 20،28-30). هذه الإنزيمات ضرورية لانتشار الخلوي في غياب المقدمة خارجيا الأيض في التوليف الذي الإنزيمات تشارك. مثلوبالتالي قد الإنزيمات الأيضية تعمل كما صحفيين القائم على النمو لتحلل البروتينات غير المستقرة التي تنصهر فيها. متطلبات الجينية للتدهور البروتين يمكن توضيح بسهولة، لأن الطفرات التي تمنع التحلل البروتيني سيسمح خلايا إيواء مراسل تدهور في النمو في ظل ظروف انتقائية. وهناك ميزة النمو وهذا مؤشر غير مباشر أن طفرة معينة تزيد من وفرة من البروتين من الفائدة. ومع ذلك، مطلوب تحليل الكيمياء الحيوية المباشر للتأكد من أن طفرة تسمح النمو من خلال زيادة مستويات البروتين وليس عن طريق أسباب غير مباشرة أو مصطنعة. ويمكن تأكيد تأثير طفرة على وفرة البروتين عن طريق تحليل لطخة الغربي من مستويات البروتين الحالة المستقرة في الخلايا التي تفعل وليس لإيواء طفرة معينة. وهناك طريقة لاستخراج السريع والفعال للبروتينات الخميرة (حضانة متتابعة من خلايا الخميرة مع هيدروكسيد الصوديوم وعازلة عينة) في شكل مناسبلتحليلها من قبل النشاف الغربي ويقدم أيضا 31. معا، وهذه التجارب تسهيل التعرف السريع على المنظمين مرشح للتدهور البروتين.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#039;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#039;s laboratory.</td></tr><tr><td>3-amino-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinant form from &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.</td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Available from a variety of manufacturers&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.</td></tr><tr><td>Plate imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

تدهور البروتين المنظم هو أمر حاسم لتقريبا كل وظيفة الخلوية. تأسست بكثير من ما هو معروف عن الآليات الجزيئية ومتطلبات الوراثية للتدهور البروتين وحيد الخلية في البداية في خميرة الخباز. وقد اعتمدت التحليلات الكلاسيكية للتدهور البروتين على نبض مطاردة وسيكلوهيكسيميد مطاردة منهجيات البيوكيميائية. بينما توفر هذه التقنيات الوسائل الحساسة لمراقبة تدهور البروتين، فهي شاقة، تستغرق وقتا طويلا، وانخفاض الإنتاجية. هذه الأساليب ليست قابلة للفحص السريع أو على نطاق واسع للطفرات التي تمنع تدهور البروتين. هنا، يتم وصف مقايسة على أساس نمو الخميرة لتحديد سطحي من متطلبات الجينية للتدهور البروتين. في هذا الاختبار، وتنصهر إنزيم مراسل المطلوبة للنمو في ظل ظروف انتقائية محددة لبروتين غير مستقر. خلايا تفتقر إلى إنزيم مراسل الذاتية ولكن تعبر عن انصهار بروتين يمكن أن تنمو تحت سيليشروط التفاعلية الذي نظمه فقط عندما يستقر البروتين الانصهار (أي عندما تتعرض للخطر تدهور البروتين). في مقايسة النمو وصفها هنا، ورصدت التخفيفات المسلسل من النوع البري وخلايا الخميرة متحولة إيواء ترميز البلازميد بروتين الانصهار على المتوسطة انتقائي وغير انتقائي. النمو في ظل ظروف انتقائية يتسق مع تدهور ضعف عن طفرة معينة. وينبغي تأكيد زيادة وفرة البروتين كيميائيا. ويتجلى أيضا هناك طريقة لاستخراج السريع للبروتينات الخميرة في شكل مناسب لالكهربائي والنشاف الغربي. هناك قراءات والقائم على النمو للاستقرار البروتين، جنبا إلى جنب مع بروتوكول بسيط لاستخراج البروتين لتحليل الكيمياء الحيوية، ويسهل التعرف السريع على متطلبات الجينية للتدهور البروتين. هذه التقنيات يمكن تكييفها لمراقبة تدهور مجموعة متنوعة من البروتينات قصيرة الأجل. في المثال المقدمة، الانزيم HIS3، وهو مطلوب لالحامض الاميني الحيوي، وتنصهرلDeg1 يستهدف -Sec62. Deg1 -Sec62 للتدهور بعد أن يشرك aberrantly شبكية هيولي باطني translocon. كانت خلايا إيواء Deg1 -Sec62-HIS3 قادرة على النمو في ظل ظروف انتقائية عندما استقرت البروتين.

لتوضيح هذه المنهجية، وقد تنصهر الإنزيم HIS3 إلى محطة-كربوكسي من طراز الشبكة الإندوبلازمية (ER) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، Deg1 -Sec62 (الشكل 2A) لإنشاء Deg1 -Sec62-HIS3 (الشكل 3) . يمثل Deg1 -Sec62 أحد الأعضاء المؤسسين لفئة جديدة من ركائز ايراد التي تستهدف التالية المستمرة وتكوين الجمعيات الشاذة مع translocon، والقناة مسؤولة في المقام الأول لنقل البروتينات عبر الغشاء ER 32-34. وقد تم مؤقتا تسمى هذه البروتينات غير مستقرة اراد-T (للالمرتبط translocon) ركائز. وتشير الدراسات السابقة أنه عند الخطبة translocon الشاذة، والتي تستهدف Deg1 -Sec62 للتدهور من قبل Hrd1 يغاز اليوبيكويتين (الشكل 2B-D) 32، 34، 35. يبدو أن العوامل المطلوبة لتدهور ركائز Hrd1 أخرى ليكون الاستغناء عنها ل&lt;م&gt; تدهور Deg1 -Sec62، مما يشير إلى آلية تدهور رواية 32. في ظل ظروف ضعف الدهون ملزمة وتكوين الجمعيات translocon لفترات طويلة، ئي B، المكون من البروتين من الثدييات البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة، يبدو أن تدهورت بفعل آلية ذات الصلة 36-38. لذلك، قد Deg1 -Sec62 تقدم نموذجا مفيدا للتدهور البروتينات المرتبطة translocon ذات الصلة طبيا. تحولت من النوع البري وhrd1Δ الخميرة الخلايا التي تفتقر إلى الجين الكروموسومات HIS3 مع ناقلات الفارغة 39 أو ترميز البلازميد Deg1 -Sec62-HIS3 ورصدت على متوسط ​​نمو الانتقائي (الشكل 4). للتأكد من أن أعداد متساوية من خلايا الخميرة تحول نقلوا إلى لوحات، تم رصد الخلايا على المتوسط ​​تفتقر التربتوفان (الذي يختار لخلايا إيواء البلازميد) ولكن تحتوي على الحامض الاميني. وقد لوحظ نمو مماثل لجميع خلايا الخميرة تحول.وكان من المتوقع أن ينمو في ظل غياب الحامض الاميني فقط عندما يستقر البروتين الانصهار الخلايا التي تعبر عن Deg1 -Sec62-HIS3 (أي عندما تتعرض للخطر اراد-T). في الواقع، hrd1Δ الخميرة معربا عن Deg1 -Sec62-HIS3 أظهرت نموا ميزة بالنسبة إلى البرية من نوع الخلايا معربا عن Deg1 -Sec62-HIS3 على المتوسط ​​التربتوفان التي تفتقر إلى والحامض الاميني. ومع ذلك، شهد النمو الانصهار تعتمد على البروتين في لوحظ عدم وجود الحامض الاميني حتى في وجود Hrd1. من أجل زيادة التشدد في الفحص، واستكملت المتوسطة تفتقر الحامض الاميني مع 3-الأمينية-1H-1،2،3-الترايازول (3-AT)، مثبط تنافسي للإنزيم HIS3 40. الخميرة معربا عن Hrd1 نمت سيئة جدا على المتوسطة تفتقر الحامض الاميني تستكمل مع 1 - 2 مم 3-AT. عندما تم حذف HRD1، تم استعادة نمو الخلايا. إدراج 3-AT بتركيز 3 ملي نمو تحول دون بشكل كبير من جميع الخلايا، بغض النظر عن وجود أو عدم وجود Hrd1. هذه الدقة<html> ults تتسق مع تدهور الركيزة التي تعتمد على Hrd1. وبعد ذلك، تم اختبار وفرة ثابتة للدولة من البروتين Deg1 -Sec62-HIS3 في الخميرة أو التعبير عن تفتقر إلى إنزيم Hrd1 مباشرة. وأشار تحليل الغربية التنشيف زيادة مماثلة في Deg1 -Sec62-HIS3 والبروتين Deg1 -Sec62 في hrd1Δ الخميرة بالنسبة لخلايا من النوع البري (الشكل 5). وهذا يؤكد دور للHrd1 في تنظيم مستويات كل من البروتينات. تدهور Hrd1 التي تعتمد من Deg1 -Sec62 العائدات بعد البروتين يشارك aberrantly في translocon ER 32. الأهم من ذلك، Deg1 -Sec62-HIS3 يشارك aberrantly في translocon بطريقة مشابهة (بيانات غير منشورة)، مما يؤكد استخدام Deg1 -Sec62-HIS3 كمراسلة القائم على النمو لتدهور Deg1 -Sec62 تحديدا والبروتينات المرتبطة translocon عموما. الصورة &quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig2.jpg" width="700" /> الشكل 2:.. نموذج لتدهور Deg1 -Sec62 التالية المشاركة translocon الشاذة (A) تصوير تخطيطي من Deg1 -Sec62 Deg1 (67 الأحماض الأمينية-الأمينية محطة من MATα2) ويلي، في تسلسل، من خلال العلم (F) حاتمة و2-عبر الغشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER) البروتين Sec62، ونسختين من S. البروتين الذهبية ألف (برا). من أجل الوضوح، ويشار البروتين الانصهار باسم Deg1 -Sec62. (B) بعد الإدراج الطبيعي للقطاعات الغشاء اثنين في غشاء ER، والتفاعل المستمر للDeg1 -Sec62 مع translocon يطلق الشاذ، Deg1 معتمد على translocon الاشتباك. جزء من الذيل الأمينية محطة عصاري خلوي في البداية يدخل وaberrantly المرجح يبقى داخل لtranslocon. (C) في أعقاب الاشتباك translocon غير طبيعيةر، Hrd1 تعترف وubiquitylates Deg1 -Sec62. الدوائر الحمراء تشير إلى جزيئات اليوبيكويتين. ثم يتم استخراج (D) Deg1 -Sec62 من الغشاء ER والمتدهورة التي proteasome و، من المحتمل تخفيف translocon العرقلة. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig3.jpg" width="300" /> الرقم 3: تصوير تخطيطي من Deg1 -Sec62-HIS3 التالية المشاركة translocon الشاذة ويتبع Deg1، في تسلسل، من خلال العلم (F) حاتمة، و2-عبر الغشاء بروتين ER Sec62، نسختين من S. البروتين الذهبية ألف (برا)، وانزيم الخميرة HIS3. من أجل الوضوح، ويشار البروتين الانصهار باسم Deg1 -Sec62-HIS3. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig4.jpg" width="700" /> الشكل 4: الصمامات HIS3 إلى Deg1 </eم&gt; -Sec62 يسمح اختيار من المسوخ تدهور معيب. وقد رصدت التخفيفات المسلسل من النوع البري (HRD1) وhrd1Δ الخميرة تتحول مع ناقلات الفارغة أو ترميز البلازميد Deg1 -Sec62-HIS3 على المتوسط ​​تفتقر التربتوفان والمتوسطة تفتقر التربتوفان والحامض الاميني ، ومتوسطة تفتقر التربتوفان والحامض الاميني تستكمل مع 3-الأمينية-1H-1،2،3-التريازول (3-AT)، مثبط تنافسية من HIS3، في تركيزات المشار إليها. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52428/52428fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig5.jpg" width="300" /> الشكل 5: زيادة وفرة من Deg1 -Sec62 وDeg1 -Sec62-HIS3 في الخلايا التي تفتقر إلى Hrd1 أعدت مقتطفات من البروتين من النوع البري (+) وhrd1Δ(Δ) الخميرة معربا عن Deg1 -Sec62 أو Deg1 -Sec62-HIS3. تم فصل البروتينات (ما يعادل 0.125 OD 600 وحدة) من خلال SDS-PAGE، تليها النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الثانوية أرنب المضادة للماوس، التي تربط مباشرة على البروتين والحواتم من البروتينات الانصهار. النشاف لاحق الغربية مع الاجسام المضادة المحددة لPgk1 يوفر تحكم التحميل. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حل </td><td> مكونات </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td rowspan="3"> الاصطناعية تعريف (SD) الحد الأدنى من الخميرة المتوسطة </td><td rowspan="3"> 2٪ سكر العنب، 0.67٪ نيتروجين قاعدة الخميرة دون الأحماض الأمينية، 0.002٪ الأدينين، 0.004٪ اليوراسيل، 0.002٪ أرجينين، 0.001٪ الحامض الاميني، 0.006٪ آيسولوسين، 0.006٪ ليسين، 0.004٪ ليسين، ميثيونين 0.001٪، 0.006٪ فينيل ألانين، 0.005 ٪ ثريونين، 0.004٪ التربتوفان. للصلب (لوحة) المتوسطة، وتشمل 2٪ أجار. </td><td> ويتم إعداد 1. المتوسطة الانتقائي بحذف ا ف بمالئمة الأحماض الأمينية (ق) أو القواعد النيتروجينية. </td></tr><tr><td> 2. للراحة، فإنه يجوز الإبقاء على هذه المكونات كحلول الأسهم تتركز على النحو التالي. يمكن الحفاظ على الأحماض الأمينية كما 100X حل الأوراق المالية تحتوي على جميع الأحماض الأمينية المطلوبة. ويمكن الاحتفاظ قاعدة النيتروجين الخميرة في حل 20X الأسهم (13.4٪). يمكن الحفاظ على سكر العنب في محلول الأسهم 40٪. ويمكن الاحتفاظ الأدينين واليوراسيل ك 1٪ الحلول الأسهم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم. </td></tr><tr><td> 3. تعقيم المتوسطة عن طريق التعقيم. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1X Laemmli العازلة عينة </td><td rowspan="2"> 2٪ SDS، الجلسرين 10٪، 5٪ β المركابتويثانول، 60 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 0.008٪ برموفينول الأزرق </td><td> وعن طريق تمييع أكثر تركيزا (مثل 5X) الأسهم غالبا ما أعد 1. 1X عازلة عينة. </td></tr><tr><td> 2. يمكن إضافة برموفينول الأزرق صبغ للكثافة المطلوبة. أ &quot;قرصة&quot; (كمية صغيرة جدا استغلالها من على حافة ملعقة) كافية عادة. </td&gt; </tr><tr><td> 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم </td><td></td><td> إعداد في الماء. هيدروكسيد الصوديوم يتفاعل مع الزجاج. لذلك، لتخزين على المدى الطويل، ينبغي الحفاظ 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم في حاويات من البلاستيك. </td></tr><tr><td> Laemmli تشغيل العازلة (5X) </td><td> 125 ملي تريس، 960 ملي جليكاين، 0.5٪ SDS </td><td> لإعداد 1 L من 1X Laemmli تشغيل العازلة، وتمييع 1: 5 في DH 2 O </td></tr><tr><td> نقل تريس خلات SDS العازلة (5X) </td><td> 125 ملي تريس خلات (الرقم الهيدروجيني 8.8)، 960 ملي جليكاين، 0.05٪ SDS </td><td> لإعداد 20 L من 1X تريس خلات SDS نقل العازلة، والجمع بين 4 L من الأسهم 5X، 4 L من الميثانول، و 12 L من درهم 2 O </td></tr><tr><td> 10X تريس مخزنة المالحة (TBS) </td><td> 500 ملي تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم. درجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 </td><td> لإعداد 1 L من 1X TBS، وتمييع 01:10 في DH 2 O. 1X TBS يمكن أن تستكمل مع المنظفات توين-20 ومسحوق الحليب الخالي من الدسم، حسب الاقتضاء. </td></tr></tbody></taبلي&gt; الجدول 1: حلول والمخازن المستخدمة في هذه الدراسة. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم السلالة </td><td> الاسم المستعار </td><td> راثى ذات الصلة </td><td> الأرقام </td><td> مصدر </td></tr><tr><td rowspan="7"> VJY6 </td><td rowspan="7"> MHY500 </td><td> ماتا </td><td rowspan="7"> 4 و 5 </td><td rowspan="7"> تشن وآخرون، 1993 </td></tr><tr><td> HIS3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY10 </td><td rowspan="8"></td><td> ماتا </td><td rowspan="8"> 4 و 5 </td><td rowspan="8"> هذه الدراسة </td></tr><tr><td> his3- Δ 200 </td></tr><tr> &lt;td&gt; leu2-3،112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> hrd1 :: kanMX4 </td></tr></tbody></table> متوفرة عند الطلب الخميرة السلالات المستخدمة في هذه الدراسة تفاصيل البناء: الجدول 2. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> البلازميد عدد </td><td> الاسم الكامل البلازميد </td><td> شخصية </td><td> مصدر </td></tr><tr><td> pVJ30 </td><td> pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA </td><td> 5 </td><td> روبنشتاين وآخرون، 2012 </td></tr><tr><td> pVJ121 </td><td> pRS414-P MET25 (ناقلات الفارغة مع MET25 المروج) </td><td> 4 </td><td> Mumberg وآخرون، 1994 </td></tr><tr><td> pVJ467 </td><td> pRS414-P MET25 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 </td><td> 5 </td><td> هذه الدراسة </td></tr><tr><td> pVJ477 </td><td> pRS414-P GAL4 -Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA-HIS3 </td><td> 4 </td><td> هذه الدراسة </td></tr></tbody></table> الجدول 3: البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة لاحظ أن جميع البلازميدات تحتوي على السنترومير الخميرة للسماح النسخ المتماثل في خلايا الخميرة، والجينات TRP1 لاختيار في خلايا الخميرة، والجينات AmpR للصيانة في الخلايا البكتيرية. متوفرة عند الطلب خرائط البلازميد، متواليات، وتفاصيل البناء.

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Views.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Video: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Genetics

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Biochemistry

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunology and Infection

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في

توجه طريقة تطور في

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في

الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.