The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

צמיחה 1. קציר של תאים שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא בניתוח קינטיקה השפלה של חלבון שמרים אנדוגני, להפוך זן שמרים הרצוי (ים) עם פלסמיד המקודד את החלבון של עניין. שיטות אמינות לטרנספורמציה שמרים תוארו בעבר 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרים ב 5 מ&quot;ל של המדיום המתאים (למשל, מוגדר סינתטי סלקטיבית (SD) בינוני עבור תחזוקה פלסמיד של התאים שהשתנו או שמרים הלא סלקטיבי לחלץ דקסטרוז-peptone (YPD) בינוני עבור תאים שאינם טרנספורמציה). דגירה לילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. הערה: 30 ° C היא הטמפרטורה לצמיחה אופטימלית עבור זני שמרים מעבדה wild-type טיפוסי 38. עם זאת, בגלל זני שמרי מוטציה כמה לא גדלים בצורה אופטימלית על 30 מעלות צלזיוס וכמה חלבונים עוברים שפלת טמפרטורה תלויה, הטמפרטורות המשמשות צמיחת שמרי תא ולרדוף cycloheximide צריכות להיקבע באופן אמפירי 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד הצפיפות הדואר אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה. הערה: תאים עשויים להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי או נייח אבל צריך מינימלית הגיעו צפיפות שיאפשר דילול ל OD 600 = 0.2 ב 15 מ&quot;ל של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות לילה ערך OD 600 של 0.2 ב 15 מ&quot;ל של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס, רועד עד התאים מגיעים לשלב צמיחת אמצע לוגריתמים (כלומר, OD 600 בין 0.8 ו -1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך גדילת תאים שמרים, לבצע את הפעולות הבאות כהכנת הליך מרדף cycloheximide: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר גוש חום שיכול להכיל 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי 30 מעלות צלזיוס במשך הדגירה של תאים בנוכחות cycloheximide. מוסיפים מים עד הבארות של גוש חום לאפשר פיזור חום יעיל לתרבויות. מוסיפים מים היטב כל כך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל תגרום מפלס המים לעלות, אבל לא עולה על גדותיו, שפת הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר גוש חום שני שיכול להכיל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עד 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation חלבונים לאחר תמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום גידול טרי טרום חם (1.1 מיליליטר לכל נקודת זמן לכל תרבות להיות assayed) עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl 20x עצור מיקס מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge (פעם אחת צינור לכל נקודה לכל תרבות להיות assayed). מניחים צינורות על הקרח. זהירות: אזיד הנתרן, מרכיב 20x עצור מיקס, הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון והטיפול יזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הגיעו צמיחת אמצע לוגריתמים, לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של כל תרבות לכל נקודת זמן להיות assayed (למשל, 7.5 OD 600 יחידות לנתח שפע חלבון בשלוש נקודות זמן). צנטריפוגה שנאספו התאים צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ב 3,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. הערה: קישור אחד OD 600 היחידה היא שווה לסכום של שמרים נוכח 1 תרבות מ&quot;ל ב OD של 600 1.0. היקף התרבות (ב מיליליטר) נדרשה למסוק יחידות X OD 600 (V) יכול להיקבע באמצעות המשוואה הבאה: V = X OD 600 יחידות / נמדדת OD 600. לדוגמה, כדי לקצור 7.5 OD 600 יחידות של תרבית תאים שמרים OD של 600 1.0, לאסוף 7.5 OD 600 יחידות / 1.0 = 7.5 מ&quot;ל תרבית שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה תא 1 מ&quot;ל של 30 ° C (מחומם מראש) מדיום הגידול טריים לכל 2.5 OD 600 יחידות של תאים (למשל, 3 מ&quot;ל תמורת 7.5 OD 600 יחידות). </li></ol> 2. cycloheximide צ&#39;ייס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן השעיות תא שמרים ידי דגירה במשך 5 דקות בתוך הגוש החום 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טיימר לספור למעלה מ 00:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את מרדף cycloheximide, לחץ על &quot;התחל&quot; על טיימר. מַהֵר,אבל בזהירות, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף cycloheximide לריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ההשעיה תא שמרים הראשונה (למשל, להוסיף 37.5 μl של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל המניות cycloheximide עד 3 מ&quot;ל של תרחיף תאים), מערבולת בקצרה לערבב. זהירות: cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הוספת cycloheximide ו vortexing, להעביר 950 μl (~ 2.4 OD 600 יחידות) של ההשעיה תא שמרים עם הוסיף cycloheximide לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו המכיל 50 תמהיל μl קר כקרח 20x להפסיק. וורטקס צינור microcentrifuge, ומניח על קרח עד שכל הדגימות נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את ההשעיה תא שמרים עד 30 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3.1 דרך 2.3.3 עבור כל אחד השעיות תא שמרים הנותרים במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 30 שניות, כך cycloheximide מתווסף לדוגמא # 1 0:00, לדוגמא # 2 ב- 00:30, לדוגמא # 3 בשעה 1:00 , וכו &#39;.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לאחר מכן, השעיות תא מערבולת שמרים העברת 950 μl לצינורות microcentrifuge שכותרתו המכיל 50 μl מראש צונן 20x עצור מיקס. וורטקס ותאי שנאספו ומניחים על קרח. חזור 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי 30 ° C בבלוק חום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, עבור אוסף של תאים 30 דקות לאחר תוספת cycloheximide (בהנחה של 30 שניות במרווחים בין בנוסף cycloheximide כדי השעיות תא שמרים בתחילת הקורס הזמן), מערבולת ולהסיר 950 μl של ההשעיה תא ממדגם # 1 ב- 30:00 . חזור על הפעולה עבור לדוגמא # 2 ב- 30:30, וכן הלאה. הערה: כדי למנוע התיישבות של שמרים, השעיות תא מערבולת ב 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי בערך כל 5 דקות במהלך הקורס של המרדף. לחלופין, השעית תא שמריםהים עשוי להישמר באמבט מי התססה ברציפות למשך ניסוי מרדף cycloheximide. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הדגימות נאספו, גלולה שנאספו התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,500 XG בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. הסר את supernatant ידי pipetting או שאיפה. תאים מוכנים כעת תמוגה אלקליין. לחלופין, הצמד להקפיא תאים pelleted בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. הפקת חלבון פוסט אלקליין (השתנה מ 16,40) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של מים מזוקקים לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של 0.2 M NaOH מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים מושעה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בשלב זה, תאי שמרים שלא היה lysed, וחלבונים לא שוחררו 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 18,000 XG ב מזג בחדרature למשך 30 שניות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי lyse תאים, להוסיף 100 μl של חיץ מדגם Laemmli לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. הערה: הדגירה סדרתית של תאים עם חלבונים משחרר חיץ מדגם NaOH ו Laemmli בצורה תואמת ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE) באמצעות מערכת חיץ ריצה טריס-גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים באופן מלא. הערה: דגירה על 95 מעלות צלזיוס לא יכולה להיות מתאימה ניתוח של חלבונים כי הם מועדים צבירה (למשל, חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני). חלבונים אלה עשויים להיות מסיסים כאשר מודגרות בטמפרטורות גבוהות 41. לכן, לצורך ניתוח של חלבונים כאלה, lysates צריך להיות מודגרות בטמפרטורות נמוכות (למשל, 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כפי שנקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates צנטריפוגה ב 18,000 XG ב roטמפרטורת om דקות 1 עד גלולת חומר מסיס. Supernatant (חלבון חילוץ solubilized) מוכן להפרדה על ידי SDS-PAGE וניתוח כתם המערבי לאחר מכן. לחלופין, lysates ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. נציג SDS-PAGE ונוהל המערבי סופג (מעובד מתוך 16) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון טען סטנדרטים משקל מולקולרי ונפח לקבוע באופן אמפירי של lysates על ג&#39;ל SDS-PAGE. הערה: בחר את אחוז acrylamide ו bis-acrylamide ב ג&#39;ל SDS-PAGE לפי המשקל המולקולרי של החלבון של עניין. באופן כללי, ג&#39;לים שיעור נמוך מתאימים יותר לפתרון חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לרוץ 200 V עד בחזית לצבוע הגיע לקצה התחתון של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר חלבונים מן ג&#39;ל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום בהעברה רטובה ב 20 V 60 - 90 דק &#39;ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום הממברנה על ידי דוגרי טריס-בופר (TBS) המכיל 5% חלב רזה, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: כדי למנוע התפתחותם של חיידקים בנוכחות קרום מודגרות לילה, מומלץ לכלול אזיד הנתרן הפתרון חוסם בריכוז סופי של 0.02%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין TBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) וחלב 1% דל שומן, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה. הערה: fluorophores הוא רגיש לאור. לכן, דילולים של נוגדנים מצומדות כדי fluorophores צריך להיות מוכן בחושך, ו הדגירה של ממברנות בנוכחות נוגדנים מצומדות כדי fluorophores וצעדים לשטוף לאחר מכן אמור להתרחש ב lightproof (למשל, עטופה בנייר כסף) במשותףntainers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום תמונה באמצעות LI-COR אודיסיאה CLX ותוכנה סטודיו תמונה (או ציוד הדמיה להשוות ותוכנה), בעקבות המלצות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת התמונה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי עבור חלבון טעינה מלאה ב TBS / T עם 1% חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום תמונה כמו בשלב 4.9. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את קינטיקה השפלה של אוכלוסיות ספציפיות של חלבונים. לדוגמא, גורל degradative של פוליפפטידים המתהווה יכול להיות מועבר על ידי ניתוח מרדף דופק 55. בניסויים כאלה, חלבונים המתהווה הם הדופק שכותרתו בקצרה (למשל, עם חומצות אמינו רדיואקטיבי). שינויי השפע של חלבונים המתהווים שכותרתו (אשר עשוי או לא עשוי לשקף שינויים בשפע חלבון מצב יציב) עשויים להיות במעקב לאורך זמן. מרדף cycloheximide מתאים לניתוח יציבות חלבון מעל קורס זמן קצר יחסית (כלומר, עד שעתיים). במהלך זמן רב יותר גourses (כלומר, שתי שעות עד ימים), cycloheximide, מעכב העולמי של התרגום, הוא רעיל לתאים, כנראה עקב דלדול של היוביקוויטין 56. יתר על כן, מנתח של יציבות חלבון מעל קורסים כבר זמן יש סיכוי גבוה יותר להיות בסכנה על ידי השפעות עקיפות של סינתזת חלבון לקויה גלובלי על השפלה של החלבון של עניין (למשל, שפלה של חלבון קצר מועד מעורב השפלה של החלבון של ריבית). טכניקות אחרות, כגון ניסויי תיוג דופק מרדף מטבולית, ולכן הם מתאימים יותר ללימוד הפירוק של חלבונים ארוכים חיות ניתן לבצע כדי לאשש תוצאות שהתקבלו בניסויי מרדף cycloheximide. העיתוי של תוספת של cycloheximide וגביית התאים הוא שיקול חשוב בהליך זה. Precision חשוב במיוחד בניתוח חלבונים מאוד קצרי מועד, כפי סטיות קטנות בזמן שחלף מן addi cycloheximidetion כדי קציר תא יכול להיות השפעה מהותית על קינטיקה שפלה נראית לעין. יתר על כן, ללא תכנית ברורה לביצוע שלבי הזמן רגיש אלה, ניסוי ועובר במהירות לתוך כאוס ותסכול. מסיבה זו, מומלץ להוסיף cycloheximide לתרבויות בבית, במרווחי זמן קבועים המתוכננים. במרווחים של 30 שניות הם הציעו בפרוטוקול זה, אבל העיתוי עשוי להיות מותאם כדי להתאים את רמת הנוחות ומיומנות של החוקר. חוקרי מחשב שניים עלולים למצוא את זה שימושי כדי לכתוב את לוח זמנים של פעמי אוסף מדגם לפני שתזם את הניסוי לחצות את כל גבייה רגילה כפי שהוא מתרחש. בצעדי 1.7 ו -1.8 של הפרוטוקול המתואר כאן, תרביות תאי שמרים מרוכזות כרכים מופחתים של מדיום גידול על מנת להקל על המניפולציה במהלך הליך מרדף cycloheximide שלאחר מכן. עם זאת, צנטריפוגה של תאים שמרים גורמת תגובות דחק תאיים מסוימות במהירות (למשל, מסלולי איתות כימופעלים על ידי מניעת גלוקוז) 57,58. חוקרים ולכן מוזהרים מפני תקופות ממושכות של צנטריפוגה. כאשר מנתחים את היציבות של חלבונים שעשויות להיות רגיש צנטריפוגה, חוקרים מומלצים להוסיף cycloheximide ישירות תרבויות שלב אמצע יומן ללא צנטריפוגה מוקדמת. במקרים כאלה, יש להוסיף cycloheximide לאותו הריכוז הסופי (250 מיקרוגרם / מ&quot;ל), דגימות תא שמרים ניתן לקצור ידי מתודולוגיות שאינם דורשים צעד צנטריפוגה הראשוני (למשל, סינון מהיר) 57. יתר על כן, צעדים 2.3 - 2.5, דגימות שנאספו בכל נקודת זמן מועברים תמיסה המכילה אזיד הנתרן והניח על הקרח. תנאים אלה אינם מאפשרים המשך פירוק חלבונים למשך המרדף. יצוין כי אזיד מפחית את ריכוז הסלולר של 59 ATP, ובכך במיוחד עיכוב פעילות של פרוטאזות תלוי ATP. בעוד טמפרטורה נמוכה במקרה בוסימפוני להפחית את הקצב שבו הלא תלוי ATP פונקצית תהליכים פרוטאוליטים, חוקרים לומדים חלבונים מושפלים על ידי מנגנונים כאלה יכולים לבחור לחלופין לצלם להקפיא כדורי תא בחנקן נוזלי כמו כל דגימה היא שנקטפה. פרוטוקול מדגם עבור תמוגה תא פרוטוקול נציג מערבי סופג כלול בכתב היד הזה הותאם מדוחות קודמות 16,40. בשיטת תמוגה שלאחר אלקליין המתואר כאן, מקדים NaOH משפר חילוץ של חלבונים שמרימים על התוספת הבאה של חיץ מדגם Laemmli. המנגנון שבאמצעותו שיפור זה מתרחש גרוע מאופיין 40. עם זאת, סוכרים כמו אלה שנמצאו בקירות תא שמרים הם solubilized בתנאים אלקלי 60. לפיכך הוא מפתה להיכנס להשערות הדגירה כי בנוכחות של NaOH באופן חלקי או מוחלט spheroplasts תאי שמרים (כלומר, מסיר רכיבים דופן התא), ההופך אותן יותר sensitivדואר ועד ימינו דטרגנט SDS למאגר מדגם Laemmli. בגלל חלבונים משתחררים בתנאי denaturing מאוד, מעכבי פרוטאז לא צריכים להיכלל במאגר מדגם Laemmli. השיטה הספציפית של תמוגה תא עשויה להיות שונה בהתאם בניסוי נתון. למשל, שיטת תמוגה שלאחר אלקליין לא יכולה להיות מתאימה חלבונים נמוך שפע או חלבונים מזוהים כהלכה על ידי כתם מערבי. במקרים כאלה, שיטות הכוללות צעד ממטרי חומצת trichloroacetic להתרכז דגימות חלבון עשוי להיות מתאימים ביותר 61. יתר על כן, כמה שיקולים חשובים לגבי בחירת נוגדנים, בחירת טעינה מלאה, ו אמצעים חלופיים איתור (למשל, מערבי סופגים chemiluminescent באמצעות מערכות סרט או הדמיה דיגיטלית) כבר מזמן דברו 16. כימות של שפע חלבונים לאחר טיפול cycloheximide עשויה להתבצע. מערכות הדמיה רבות נמכרות עם חבילות תוכנה המאפשרותניתוח זה. מרדף cycloheximide יכול להיות מיושם על מנת לנתח את ההשפלה של מגוון של חלבונים שמרים וניתן להתאימו לחקר יציבות חלבון בתאים איקריוטיים אחרים. כפי שתואר בפרוטוקול זה, הטיפול cycloheximide ואחריו תא תמוגה וזיהוי של שפע חלבון על ידי ניתוח כתם המערבי. בהתאם ליישום, אולם שפע חלבונים לאחר טיפול cycloheximide ניתן להעריך על ידי מגוון של טכניקות, בהתאם למטרות מחקר. לדוגמה, אם גודל החלבון אינו גורם רלוונטי לניתוח, lysates תא עשוי להיות חשוף כתם נקודה או assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) ניתוח, אשר מדווחים על שפע חלבונים, אבל לא 62 משקל מולקולרי לעין. עבור חלבונים על פני התא (או fluorescently הפנימי מתויג חלבונים פנימיים), cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לכמת שפע חלבון של דגימות בזמנים שונים לאחר תוספת cycloheximide 51. Fluoטיפול מיקרוסקופיה rescence cycloheximide הבא יספק מידע משני שפע החלבון ולוקליזציה 18. מגוון מצעים, אורגניזמים, או במורד יישומים מקובלים מרדף cycloheximide שהופך את הטכניקה אמצעי צדדי אינפורמטיבי מאוד של לימוד פירוק חלבונים.

חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר 1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים 2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון 3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקבון רנ&quot;א proteolysis). פירוק חלבונים פגומים או מוגזם תורם פתולוגיות מרובים, כולל סרטן, סיסטיק פיברוזיס, תנאים ניווניות, והפרעות קרדיו 4-8. מנגנוני פרוטאוליטים ולכן הם בגדר מטרות טיפוליות מבטיחים עבור מגוון של מחל 9-12. ניתוח של חלבונים בנקודת זמן אחת (למשל, על ידי כתם המערבי 13, cytometry זרימה 14, או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 15) מספק תמונת מצב של שפע חלבון מצב יציב מבלי לחשוף את התרומה היחסית של סינתזה או השפלה. בדומה לכך, מבחני כתב מבוסס צמיחה לשקף את רמות חלבון מצב יציבות על פני תקופת זמן ממושכת בלי להיפלות בין ההשפעות של סינתזת שפלה 15-20. אפשר להסיק את התרומה של תהליכי degradative לרמות חלבון מצב יציב על ידי השוואת שפע לפני ואחרי עיכוב רכיבים ספציפיים של מנגנון degradative (למשל, על ידי פרמקולוגית inactivating והגנה של המחזורasome 21 או לדפוק את גן שיערו להידרש השפלה 13). לשינוי ברמת חלבון מצב יציב לאחר עיכוב מסלולים degradative מספק ראיות חזקות תרומת proteolysis לשליטת שפע חלבון 13. עם זאת, כגון ניתוח עדיין אינו מספק מידע לגבי קינטיקה של מחזור חלבון. מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג מתגבר חולשות אלה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לחזות פירוק חלבונים לאורך זמן 22-24. יתר על כן, כי גילוי חלבונים לאחר מרדף cycloheximide מבוצע בדרך כלל על ידי מערבי סופג, איזוטופים רדיואקטיביים וצעדי immunoprecipitation ממושכים אינם נדרש עבור מרדף cycloheximide, בניגוד טכניקות מרדף דופק רבות נפוצות, אשר מבוצעות גם לדמיין חלבון שפל 25. Cycloheximide זוהה לראשונה כמתחם עם אנטי פטרייתי נאהקשרים המיוצר על ידי Streptomyces חיידק חיובי גרם griseus 26,27. זוהי מולקולה התא חדיר המעכבת cytosolic איקריוטיים במיוחד (אבל לא organellar) תרגום על ידי פגיעה ריבוזומלי טרנסלוקציה 28-31. בניסוי מרדף cycloheximide, cycloheximide מתווסף תאים, aliquots של התאים נאספים מיד ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של תרכובת 22. תאים lysed, ושפע חלבון בכל נקודת זמן מנותח, בדרך כלל על ידי כתם המערבי. ירידות שפע חלבונים לאחר תוספת של cycloheximide ניתן לייחס בבטחה פירוק חלבונים. חלבון יציב יקטן בשפע לאורך זמן, בעוד חלבון יציב יחסית יפגין שינוי קטן בשפע. מנגנוני פירוק חלבונים סלקטיבית כבר שמורים ביותר ברחבי Eukarya. הרבה ממה שידוע על פירוק חלבונים נודע ראשוןeukaryote unicellular המודל, cerevisiae Saccharomyces (שמרים ניצנים) 25,32-36. מחקרים עם שמרים צפויים להמשיך ולספק תובנה רומן וחשובות לתוך פירוק חלבונים. שיטת מרדף cycloheximide בתאי שמרים ואחריו ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון מוצגת כאן.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>A tube roller is recommended to maintain overnight&amp;nbsp; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&amp;nbsp;</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heaters</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &amp;deg;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td></tr><tr><td>Heating block for 12 x 15 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td></tr><tr><td>Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג&#39;ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.

כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח 42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המקומיים על קרום ER. חלבונים polyubiquitylated כזה ובהמשך יוסרו מן ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, פרוטאז גדול, cytosolic 45. חלבון Deg1 -Sec62 מיועד שפלה לאחר בהתמדה aberrantly מעסיק את translocon, ערוץ המאפשר טרנסלוקציה חלבון לתוך לומן ER או קרום 43. באופן דומה, B אפוליפופרוטאין היונק, מרכיב חלבון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, בהתמדה עוסק המיון translocon ובהמשך עובר שפלה ידי מנגנון הקשור כאשר השפות שלהid שותפים מחייבים נעדרים 46-48. לפיכך, מנתח של השפלה Deg1 -Sec62 בתאי שמרים עשוי להניב תובנות לגבי פירוק של חלבונים כי בהתמדה או aberrantly להעסיק את translocon, כינה זמני ERAD-T (עבור הקשורים translocon) מצעים 43. מחקרים קודמים הראו כי פונקציות Hrd1 האנזים היוביקוויטין ER-תושב עם Ubc7 אנזים conjugating היוביקוויטין לזרז השפלה של Deg1 -Sec62 16,42-44. החלבון הטרנסממברני Cue1 מעגן Ubc7 קרום ER ומפעיל את האנזים 49-51. עם זאת, דרישה Cue1 ב השפלת Deg1 -Sec62 עוד לא נחקר ישירות. כדי לבדוק את ההשערה כי Cue1, כמו Hrd1 ו Ubc7, נדרש השפלה יעיל של Deg1 -Sec62, סוג-בר בתאי שמרים מוטציה לבטא Deg1 -Sec62 היו נתונים cycloheximide המרדף ווסניתוח כתם שחפייה (איור 2 א). חלבון Deg1 -Sec62 נודד על SDS-PAGE כמו מינים רבים. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המעידים שינוי שלאחר translational נרחב של החלבון 43,44,52. בתאי שמרים wild-type, Deg1 -Sec62 היה מושפל בקלות. כפי שנצפה קודם לכן, אובדן או Hrd1 או Ubc7 משמעותי התייצב החלבון Deg1 -Sec62 42-44. כצפוי, Deg1 -Sec62 התייצב בהעדר Cue1 (במידה דומה לזו בהעדר Ubc7), המאשר תפקיד החלבון Ubc7-אינטראקציה ERAD-T. חלקם של חלבון Deg1 -Sec62 הנותר בכל נקודת זמן היה לכמת והוא זמם באיור 2B. נציין כי שיעור ניכר של היעלמות Deg1 -Sec62 ב wild-type תאים עשויה להיות נמוכה מדי של קצב הפירוק של המתהווה Deg1 -Sec62(כלומר, זמן מחצית החיים של החלבון, אשר יכול להיקבע באופן ישיר ביותר על ידי ניתוח מרדף דופק 43). מכיוון שמרים wild-type פעיל לבזות את חלבון Deg1 -Sec62 לפני תוספת cycloheximide, שפע המצב היציב של Deg1 -Sec62 מצטמצם באופן משמעותי בתאים אלה (לעומת התאים בהם השפלה נפגעת). זה יכול להיות מוערך על ידי השוואת שפע של Deg1 -Sec62 בנקודות הזמן הראשוני עבור כל זן ב איור 2 א. יתר על כן, כל תת-אוכלוסייה שפלה עמידה של חלבון המצע (למשל, אם החלבון מצטבר ברכות תאיות שממנו השפלה נמנעת) עשויה להיראות יציבה יחסית wild-type תאים במשך זמן הניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig1.jpg" /> דגם איור 1. ביזוי של Deg1 </em&gt; -Sec62 הבאים אירוסין Aberrant של Translocon (א) תיאור סכמטי של Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 מכיל את הפריטים הבאים, ברצף:.. Deg1 (חומצות אמינו מסוף 67 אמינו מן מדכא שמרים תעתיק MATα2), דגל (F) epitope, חלבון 2-הטרנסממברני Sec62, ושני עותקים של חלבון Staphylococcus aureus (PRA). (ב) בעקבות החדרה נורמלית שיתוף translational של המגזרים שני הטרנסממברני שלה לתוך reticulum endoplasmic (ER) הקרום, עמותה מתמיד של Deg1 -Sec62 עם translocon מפעילה נורמלי, Deg1 תלוי, שלאחר translational אירוסי translocon. חלק מן התחנה הסופית אמינו cytosolic aberrantly נכנס-ונשאר סביר בתוך-the translocon. (C) בעקבות מעורבות translocon, את האנזים היוביקוויטין Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 נעזרת האנזים conjugating היוביקוויטין Ubc7, המעוגן בקרום ER ידי Cue1. UB, מונומרים חלבון היוביקוויטין. (ד) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 מופק הממברנה ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, להקלה על חסימה translocon. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53975/53975fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53975/53975fig2.jpg" /> איור 2. cycloheximide צ&#39;ייס ואחריו מערבי סופג מציין כי Cue1 נדרש שפלת Deg1 -Sec62 יעילה. (א) תאים שמרים של גנוטיפים הצביע שהוסבו עם קידוד פלסמיד שמרים centromeric Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) ו נתון ניתוח מרדף cycloheximide. חֶלְבּוֹןs מ בכל נקודת זמן (שווה ערך ל 0.125 OD 600 יחידות) הופרדו על ג&#39;ל 8% SDS-PAGE ו זוהה על ידי המערבי סופג עם נוגדנים משני אנטי עכבר ארנב, המשפיעה ישירות לאגד את אפיטופים חלבון C-terminal של Deg1 - חלבון היתוך Sec62. כביקורת טעינה, הקרום ובהמשך הודגר עם נוגדנים ספציפיים Pgk1. ניסוי זה כבר משוכפל שלוש פעמים; תוצאות נציגים הן בתמונה. (ב) כימות של נתונים (א) בוצע באמצעות תוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). עוצמת הקרינה הכוללת של שטח המקיף את חלבון Deg1 -Sec62 נקבעה עבור כל דגימה. רקע עוצמת הקרינה עבור כל דגימה היה להסיק מעוצמת הקרינה הממוצעת של פיקסלים ליד חלבון Deg1 -Sec62. עוצמת קרינת רקע אקסטרפולציה זו מפחיתה את עוצמת הקרינה הכוללת להניב fluoresc המתואם<html> עוצמת ence עבור כל דגימה. quantifications הדומה הכולל, רקע, ואת עוצמות קרינה מתואמות בוצע Pgk1, חלבון טעינה מלא אשר השפע אינו משתנה בתנאי assayed. כדי להשוות את השפע של חלבון Deg1 -Sec62 בקרב מדגמים, יחס של עוצמת האות המותאמת של Deg1 -Sec62 כדי Pgk1 נקבע עבור כל דגימה. יחס Deg1 -Sec62 / Pgk1 הוגדר 100% עבור הנקודה לראשונה (כלומר, מייד לאחר תוספת cycloheximide) עבור כל זן תחת ניתוח. כמות Deg1 -Sec62 הנותרת בנקודות זמן עוקבות (כלומר, יחסי Deg1 -Sec62 / Pgk1) חושבו כאחוז יחס Deg1 -Sec62 / Pgk1 בנקודת הזמן הראשונה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53975/53975fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:k</html style=";text-align:right;direction:rtl">יפ-עם-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="3"> מוגדר סינטטי (SD) בינוני שמרים מינימאלי </td><td rowspan="3"> 2% דקסטרוז, בסיס חנקן שמרים 0.67% ללא חומצות אמינו, 0.002% אדנין, אורציל 0.004%, 0.002% ארגינין, 0.001% היסטידין, 0.006% isoleucine, 0.006% לאוצין, 0.004% ליזין, 0.001% מתיונין, 0.006 פנילאלנין%, 0.005 תראונין%, 0.004% טריפטופן. לקבלת בינוני מוצק (צלחת), כולל אגרו 2%. </td><td> 1. בינוני סלקטיבי הוא הוכן על ידי השמטת חומצת אמינו המתאים (ים) או בסיסים חנקניים. </td></tr><tr><td> 2. לנוחיותכם, מרכיבים אלו עשויים להיות מתוחזקים ככאלה פתרונות מניות מרוכזים כדלקמן. עשויות להישמר חומצות אמינו כפתרון 100x מניות המכיל את כל חומצות האמינו הרצויות. בסיס חנקן שמרים עשוי להישמר פתרון 20x מניות (13.4%). דקסטרוז עשוי להישמר פתרון המניות 40%. אדנין ו אורציל עשוי להישמר כפתרונות המניה 1% ב 0.1 M NaOH. </td></tr><tr><td> 3.לעקר בינוני ידי מעוקר. </td></tr><tr><td rowspan="3"> חלץ-Peptone שמרים דקסטרוז (YPD) ריץ &#39;שמרים בינוני </td><td rowspan="3"> 1% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז (אופציונלי: 0.002% אדנין). לקבלת בינוני מוצק (צלחת), כולל אגרו 2%. </td><td> 1. כדי למנוע צמיחה איטית מאפיין צבע אדום של זני שמרים מעבדה בפרט בהעדר (או שפע נמוך) של אדנין, אדנין ניתן להוסיף מדיום הגידול YPD. </td></tr><tr><td> 2. להנוחיות, כמה מרכיבים עשויים להישמר כמו פתרונות מניות מרוכזים כדלקמן. דקסטרוז עשוי להישמר פתרון המניות 40%. אדנין עשוי להישמר כפתרון מניות 1% ב 0.1 M NaOH. </td></tr><tr><td> 3. לעקר בינוני ידי מעוקר. </td></tr><tr><td> 20x העצור Mix </td><td> 200 מ&quot;מ אזיד הנתרן, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אלבומין בסרום שור </td><td> אזיד הנתרן הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. עקוב יצרןהמלצות בעת הכנת, אחסון וטיפול אזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל cycloheximide </td><td rowspan="2"></td><td> 1. הכינו באתנול. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td> 2. cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </td></tr><tr><td> 0.2 M נתרן הידרוקסידי </td><td></td><td> הכן במים. הידרוקסיד הנתרן מגיב עם זכוכית. לכן, עבור אחסון לטווח ארוך, 0.2 M נתרן הידרוקסידי צריך להישמר במכלי פלסטיק. </td></tr><tr><td rowspan="2"> חיץ מדגם Laemmli </td><td rowspan="2"> 2% SDS, 10% גליצרול, 5% &amp;# 946; -mercaptoethanol, 60 מ&quot;מ טריס HCl pH 6.8, 0.008% bromophenol כחול </td><td> 1. חיץ מדגם Laemmli לעתים קרובות הוא הוכן על ידי דילול מרוכז יותר (למשל, 5x) מניות. </td></tr><tr><td> 2. כחול צבע bromophenol ניתן להוסיף בעוצמה הרצויה. A &quot;קמצוץ&quot; (כמות קטנה מאוד טפח מקצה מרית) הוא בדרך כלל מספיק. </td></tr><tr><td> Laemmli הפעיל מאגר (5x) </td><td> 125 מ&quot;מ טריס, 960 גליצין מ&quot;מ, 0.5% SDS </td><td> כדי להכין 1 ליטר של 1x Laemmli הפעלת מאגר, לדלל 1: 5 ב DH 2 O. </td></tr><tr><td> טריס Acetate-SDS העברת חוצץ (5x) </td><td> 125 מ&quot;מ טריס אצטט (pH 8.8), 960 גליצין מ&quot;מ, 0.05% SDS </td><td> כדי להכין 20 ליטר של 1x טריס Acetate-SDS עבר הצפה, לשלב 4 ליטר של מניית 5x, 4 ליטר של מתנול, ו -12 ליטר של DH 2 O. </td></tr><tr><td> 10x טריס שנאגרו מלוחים (TBS) </td><td> 500 מ&quot;מ טריס, 1.5 M NaCl; pH מותאם 7.5</td><td> כדי להכין 1 ליטר של TBS 1x, לדלל 1:10 ב DH 2 O. 1x TBS ניתן להשלים עם Tween-20 חומרי ניקוי חלב דל שומן אבקת, לפי העניין. </td></tr></tbody></table> פתרונות לוח 1. השתמשו במחקר זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם זנים </td><td> כינוי </td><td> גנוטיפ רלוונטי </td><td> הפניות </td></tr><tr><td rowspan="7"> VJY42 </td><td rowspan="7"> MHY501 </td><td> MATα </td><td rowspan="7"> חן et al., 1993 </td></tr><tr><td> his3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY47 </td><td rowspan="8"> YWO55; MHY507 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> Jungmann et al, 1993.; רובינשטיין ואח &#39;. 2012 </td></tr><tr><td> his3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> ubc7Δ :: LEU2 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY56 </td><td rowspan="8"> YTX105; MHY1364 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> Biederer ואח &#39;, 1997.; רביד et al., 2006 </td></tr><tr><td> his3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> cue1Δ :: HIS3 </td></tr><tr><td rowspan="8"> VJY172 </td><td rowspan="8"> MHY6199 </td><td> MATα </td><td rowspan="8"> מחקר זה </td></tr><tr><td> his3-Δ200 </td></tr><tr><td> leu2-3,112 </td></tr><tr><td> ura3-52 </td></tr><tr><td> lys2-801 </td></tr><tr><td> trp1-1 </td></tr><tr><td> gal2 </td></tr><tr><td> hrd1Δ :: kanMX4 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. זני שמרים השתמשו במחקר זה. זנים כולם congenic עם MHY500 53. VJY42, VJY47, ו VJY56 תוארו בעבר 49,53,54. דור זן מפורט ואסטרטגית אישור עבור VJY172 (שהוכן עבור מחקר זה) זמין על פי בקשה.

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

28.9K Views.  Ball State University. Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Video: Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Developmental Biology

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

Immunology and Infection

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome segregation. As DNA synthesis defects underlie chromosome rearrangements, monitoring DNA replication has become essential to understand the basis of genome instability. Saccharomyces cerevisiae is a classical model to study cell cycle regulation, but key DNA replication parameters, such as the fraction of cells in the S phase or the S-phase duration, are still difficult to determine. This protocol uses short and non-toxic pulses of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), a thymidine analog, in engineered TK-hENT1 yeast cells, followed by its detection by Click reaction to allow the visualization and quantification of DNA replication with high spatial and temporal resolution at both the single-cell and population levels by microscopy and flow cytometry. This method may identify previously overlooked defects in the S phase and cell cycle progression of yeast mutants, thereby allowing the characterization of new players essential for ensuring genome stability.

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

We describe two complementary protocols to accurately determine S-phase duration in S. cerevisiae using EdU, a thymidine analog, which is incorporated in vivo and detected using Click chemistry by microscopy and flow cytometry. It allows for the easy characterization of the duration of DNA replication and overlooked replication defects in mutants.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

Saccharomyces cerevisiae Yeast as a Model Organism

מבוא לסכרומיצס סרביסיה

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video