הכנת מצומדי חלבון ציטוטוקסיים ספציפיים לאתר באמצעות כימיה של מלימיד-תיול וקשירה מתווכת סורטאז A

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לתיוג ספציפי לאתר של חלבונים עם תרופות ציטוטוקסיות באמצעות תגובת מלימיד-תיול וקשירה בתיווך סורטאז A.

סרטן הוא כיום גורם המוות השני בשכיחותו בעולם. סימן ההיכר של תאים סרטניים הוא נוכחותם של חלבוני סמן ספציפיים כגון קולטני גורמי גדילה על פני השטח שלהם. תכונה זו מאפשרת פיתוח של טיפולים סלקטיביים ביותר, החלבון הביו-מצומד, המורכב מחלבונים מכוונים (נוגדנים או ליגנדים קולטנים) המחוברים לתרופות ציטוטוקסיות מאוד על ידי מקשר ספציפי. בשל זיקה וסלקטיביות גבוהה מאוד של חלבוני מטרה, הביו-מצומדים מזהים חלבוני סמן על פני התאים הסרטניים ומנצלים אנדוציטוזיס בתיווך קולטנים כדי להגיע לפנים התא. מערכת הובלה שלפוחית תוך-תאית מעבירה בסופו של דבר את הביו-מצומדים לליזוזומים, שם פרוטאוליזה מפרידה תרופות ציטוטוקסיות חופשיות מהליבה החלבונית של הביו-מצומדים, וגורמת למוות של תאי סרטן תלויי תרופות. נכון לעכשיו, ישנם מספר חלבונים ביו-מצומדים המאושרים לטיפול בסרטן ומספר גדול נמצא בפיתוח או ניסויים קליניים.

אחד האתגרים העיקריים ביצירת הביו-מצומדים הוא חיבור ספציפי לאתר של התרופה הציטוטוקסית לחלבון המטרה. השנים האחרונות הביאו התקדמות אדירה בפיתוח אסטרטגיות כימיות ואנזימטיות לשינוי חלבונים באמצעות תרופות ציטוטוקסיות. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים המפורטים לשילוב ספציפי לאתר של ראשי נפץ ציטוטוקסיים בחלבונים מכוונים באמצעות שיטה כימית המשתמשת בכימיה של מלימיד-תיול וגישה אנזימטית המסתמכת על קשירה בתיווך סורטאז A. אנו משתמשים בגרסה מהונדסת של גורם גדילה פיברובלסטים 2 ואזור גבישי של אימונוגלובולין אנושי G כחלבונים מכוונים למופת ובמונומתיל אוריסטטין E ומטוטרקסט כתרופות ציטוטוקסיות מודל. כל האסטרטגיות המתוארות מאפשרות יצירה יעילה ביותר של ציטוטוקסיות פעילות ביולוגית של ארכיטקטורה מולקולרית מוגדרת עם פוטנציאל לטיפול סלקטיבי בסוגי סרטן מגוונים.

עשרות שנים של מאמצים מדעיים הובילו להתקדמות עצומה בידע שלנו על המנגנונים המולקולריים השולטים בהתפתחות סרטן והתקדמותו. יחד עם זאת, האפשרויות הטיפוליות עדיין מוגבלות במידה רבה בשל תופעות הלוואי של התרופות הנגרמות מחוסר הסלקטיביות שלהן, השונות הרבה של גידולים ועמידות לתרופות המתפתחות לאחר טיפול ממושך. טיפולים אנטי-סרטניים ממוקדים זוכים לתשומת לב בשנים האחרונות כגישות חדשות ומבטיחות מאוד לטיפול בגידולים מגוונים. טיפולים ממוקדים מסתמכים על מערכות אספקת תרופות מתוחכמות המעבירות במדויק את המטען הציטוטוקסי לתאי הסרטן וחוסכות את הבריאים. אלה כוללים בעיקר ננו-חלקיקים מגוונים, ליפוזומים ונשאי תרופות מבוססי חלבון.

תאים סרטניים חושפים לעתים קרובות רמות גבוהות של חלבוני סמן ספציפיים על פני השטח שלהם. צימודי תרופות נוגדנים (ADCs) הם טיפולים אנטי-סרטניים חדשים מבוססי חלבון, המשלבים במולקולה אחת ספציפיות קיצונית של נוגדנים חד-שבטיים ועוצמה ציטוטוקסית גבוהה של תרופות. לאחר שנקשר לפני השטח של התא הסרטני, ADC משתמש באנדוציטוזיס בתיווך קולטן כדי להיכנס לתא. לאחר מכן, ADCs מועברים דרך תאים אנדוזומיים לליזוזומים, שם פרוטאזות מפרקות ADCs ומשחררות תרופות ציטוטוקסיות פעילות. נכון לעכשיו, ישנם שמונה ADCs מאושרים בארה"ב לטיפול בגידולים מגוונים, כולל סרטן שד טריפל נגטיב, סרטן שד חיובי ל-HER2, סרטן דרכי השתן, לימפומה מפושטת של תאי B גדולים, ממאירות המטולוגית, לימפומת הודג'קין ולוקמיה מיאלואידית חריפה. מספר רב של ADCs נמצאים גם הם בפיתוח או ממתינים לאישור¹. ראוי לציין כי גישות הנדסת חלבונים הובילו לפיתוח פיגומי חלבון חלופיים מגוונים לנוגדנים חד-שבטיים והמצומדים הציטוטוקסיים שלהם. אלה כוללים שברי נוגדנים שונים ^2,3, DARPins ^4,5, קשרים ^6,7, צנטרינים⁸, affibodies ^9,10 או ליגנדים קולטנים מהונדסים^11,12.

ישנן מספר דרישות קריטיות שיש לעמוד בהן על ידי מצומד ציטוטוקסי מוצלח מבוסס חלבון, כלומר יציבות מצומדת, ספציפיות יוצאת דופן, זיקה גבוהה של המצומד לסמן ספציפי לסרטן, הפנמה מהירה של המצומד לתוך פנים התא הסרטני, הובלתו היעילה לליזוזומים ושחרור תוך תאי יעיל של המטען הפעיל. תכונה חשובה נוספת היא הומוגניות מצומדת, שתלויה במידה רבה באסטרטגיה המיושמת להצמדת המטען לחלבוני המטרה. ישנן מספר שיטות זמינות לצימוד ספציפי לאתר של חלבונים עם תרופות ציטוטוקסיות, כמו שינוי של שאריות ציסטאין או ליזין בשרשרת צד של חלבון, הצמדת התרופה לחומצות אמינו לא טבעיות המשולבות בחלבוני המטרה, או שינויים אנזימטיים של חלבוני המטרה (למשל, עם טרנסגלוטמינאז, גליקוזילטרנספראז, אנזים המייצר פורמיל גליצין, סורטאז A). ברוב המקרים שיטות צימוד ספציפיות לאתר דורשות שינויים במולקולות המטרה (למשל, באמצעות הנדסת ציסטאין או הכנסת תגי פפטיד קצרים), אך בתורן מביאות לייצור יעיל של מצומד הומוגני מעניין.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לצימוד יעיל ביותר ספציפי לאתר של חלבוני מטרה עם תרופות ציטוטוקסיות. כחלבונים לדוגמה השתמשנו בשתי מולקולות שונות: המקטע המתגבש (Fc) של IgG אנושי וגרסה מהונדסת של גורם גדילה פיברובלסטים אנושי 2 (FGF2). מקטע ה-Fc מהווה חלק בלתי נפרד מ-ADCs טיפוסיים, אך הוא קיים גם בסוגים אחרים של מצומדים כמו פפטיגנים ציטוטוקסיים או מצומדים של שברי נוגדנים. FGF2 הוא ליגנד קולטן גורם גדילה פיברובלסטים טבעי (FGFR) שהונדס בהצלחה כדי להניב מצומד ציטוטוקסי סלקטיבי המכוון לתאי סרטן המייצרים יתר על המידה FGFR.

אנו מציגים שתי אסטרטגיות צימוד נפרדות המאפשרות שילוב ספציפי לאתר של תרופות ציטוטוקסיות. ראשית, מסופק הפרוטוקול להצמדה לשרשראות הצד של ציסטאין של מקטע ה-Fc באמצעות כימיה של מלימיד-תיול המבוסס על פרוטוקול¹³ של הרמנסון (איור 1A,B). בפרוטוקול זה, שני קשרי דיסולפיד מופחתים בתחילה עם tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) וקבוצות תיול חופשיות כתוצאה מכך נתונות לצימוד עם מונומתיל אוריסטטין E (MMAE) באמצעות כימיה של מלימיד-תיול (איור 1B). בשל האינטראקציה בין תחומי השרשרת הכבדים הקבועים 2 ו-3 (CH2 ו-CH3) נשמר המבנה הדימרי של ה-Fc המקושר לתרופה. שנית, מוצגת האסטרטגיה ליצירת מצומד FGF2 עם ראש נפץ כפול המשלבת הנדסת ציסטאין וקשירה מתווכת סורטאז A לשילוב של שתי תרופות נפרדות ב-FGF2 באופן ספציפי לאתר (איור 1A,C). נעשה שימוש בגרסה נטולת הציסטאין של FGF2 הנושאת KCKSGG נוסף N-terminal עם שאריות ציסטאין חשופות בודדות ותג פפטיד קצר LPETGG מסוף C¹². תגובת מלימיד-תיול מאפשרת צימוד של MMAE לציסטאין בתוך מקשר KCKSSG שתוכנן על ידי קבוצתנו^14,15. Sortase A-dependent step (מבוסס על Chen et al.)¹⁶ מתווך את הקשירה של פפטיד טטרגליצין GGGG-MTX המקושר למטוטרקסט (MTX) לרצף LPETGG C-terminal, ומניב שני סוגים של מצומדים של ראש נפץ יחיד (איור 1C). Sortase A הוא פרוטאז ציסטאין המזרז את תגובת הטרנספרפטידציה בין מוטיבים LPETGG ו-GGGG. האנזים נקשר למוטיב LPETGG בקצה C של החלבון, ואז קשר האמיד בין התראונין לגליצין עובר הידרוליזה ליצירת קומפלקס אנזים-סובסטרט. השלב הבא הוא אמינוליזה של קשר האנזים-סובסטר תיואסטר, כאשר התורם של קבוצת אמינו ראשונית הוא שאריות הגליצין של מוטיב הטטרגליצין¹⁷. שילוב של שתי גישות אלה יוצר מצומדים של ראשי נפץ כפולים FGF2 ספציפיים לאתר (איור 1C). באופן עקרוני, ניתן ליישם בהצלחה פרוטוקולי צימוד מסופקים על כל חלבון מכוון מהונדס בעל עניין ליצירת ציטוטוקסיים סלקטיביים. יתר על כן, הרבגוניות של גישה זו הופכת אותה למתאימה למטרות רבות אחרות של קשירת חלבון-חלבון וחלבון-פפטיד, כמו גם להצמדה של שומנים, פולימרים, חומצות גרעין ופלואורופורים לחלבונים עם קבוצת סולפידריל זמינה (או שנוצרו על ידי הפחתה של קשרי דיסולפיד מקומיים) ו/או עם תג פפטיד קטן שהוכנס.

1. צימוד של תחום ה-Fc עם MMAE

הערה: לפני ההטיות הספציפיות למקום הכינו ריאגנטים עיקריים: חלבון טהור ביותר מעניין (במקרה זה מקטע ה-Fc וגרסת FGF2 המהונדסת, כנקודת התחלה 1-5 מ"ג של חלבון רקומביננטי, שהוכן על פי Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzyl alcohol (PABC)-monomethyl auristatin E (MMAE) (זהירות, חומר ציטוטוקסי מאוד, יש לטפל בזהירות), Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ו-sortase A¹⁶. מטוטרקסט המקושר לפפטיד טטרגליצין (GGGG-MTX) (זהירות, MTX הוא חומר ציטוטוקסי ביותר, יש לטפל בזהירות) יכול להיות מסונתז בשלב התמיכה המוצקה על פי שיטת סינתזת פפטיד שלב מוצק (SPPS) באסטרטגיית Fmoc¹⁹ או להשיג ממקורות מסחריים.

1. כדי להפחית קשרי דיסולפיד בתוך מקטע ה-Fc (איור 1), הוסף עודף מולרי פי עשרה של TCEP על פני חלבון Fc (39 מיקרומטר) ב-PBS (100 מ"מ NaCl, 18 מ"מ NaH₂PO₄, 33 מ"מ Na₂HPO₄ pH 7.4) ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. תמיסת מלאי TCEP צריכה להיות בעלת pH מותאם עם 0.1 M NaOH עד 6.0, על מנת למנוע משקעי חלבון כתוצאה משינויי pH.
2. לאחר הדגירה, סנן את החלבון המופחת באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר כדי להסיר משקעי חלבון.
3. לצינור התגובה החדש הוסף עודף מולרי ראשון פי ארבעה של MMAE (ממיס MMAE ב-N,N-dimethylacetamide (DMAc) להכנת תמיסת מלאי של 40 מ"מ) על פני קבוצות חלבון -SH. לאחר מכן הוסף נפח כפול של מאגר PBS ביחס לנפח של חלבון Fc. לבסוף הוסף קטע Fc מופחת משלב 1.2.
   הערה: בשלב זה, סדר הוספת הריאגנטים חשוב.
4. בצע את תגובת ההטיה למשך הלילה ב-15 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. תנאים קלים אלה מונעים דנטורציה של חלבון.
5. סנן את התמיסה עם מצומד באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר כדי להסיר משקעים פוטנציאליים.
6. בצע SDS-PAGE כדי לנתח את יעילות התגובה. השתמשו בג'ל הפרדה של 10%, בסמן חלבון של 10-250 kDa, ונתחו רצועות בין 35 ל-50 kDa (איור 2).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, ולאחסן את תערובת התגובה ב-4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר, או ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. עם זאת, הקפאה והפשרה עלולות לגרום למשקעים נוספים ולהפחית את תפוקות הטיהור המצומדות.
7. טען את תערובת התגובה על עמוד עם חרוזים מצומדים של חלבון A ושטוף את עודפי ה-MMAE עם מאגר כביסה 1 המכיל 300 מ"מ NaCl, 18 מ"מ NaH₂PO₄, 33 מ"מ, Na₂HPO₄, 0.1% טווין 20, 2 מ"מ EDTA pH 7.4. לאחר מכן שטפו את העמודה באמצעות מאגר כביסה 2 עם 650 מ"מ NaCl, 18 מ"מ NaH₂PO₄, 33 מ"מ Na₂HPO₄, pH 7.4.
   הערה: באמצעות אינטראקציה סלקטיבית של אזור Fc של המצומד עם חלבון A על החרוזים, המצומד נלכד על העמוד, בעוד MMAE לא מגיב נשטף החוצה. שלב זה הכרחי כדי להשיג מצומד טהור ביותר.
8. הסר את מצומד ה-Fc-MMAE מהעמודה עם צינורות של 0.1 M נתרן ציטראט pH 3.5 עד 1.5 מ"ל המכילים 1 M Tris pH 9.0 (1 מ"ל חלבון עד 200 מיקרוליטר של 1 M Tris pH 9.0).
9. המלח Fc-MMAE ל-PBS pH 7.4 באמצעות עמודה עם שרף Sephadex G-25. שלב זה מונע דנטורציה של המצומד ומאפשר להשתמש במצומד במבחנה ובבדיקות in vivo.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
10. בצע SDS-PAGE (10%) כדי לנתח את המצומד הסופי של Fc-MMAE. השתמשו בג'ל הפרדה של 10%, בסמן חלבון של 10-250 kDa, ונתחו רצועות בין 35 ל-50 kDa (איור 2).

2. צימוד של FGF2 מהונדס

1. צימוד של GGGG-MTX לרצף LPETGG מסוף C של FGF2 מהונדס באמצעות קשירה מתווכת A
   1. העבר FGF2 מהונדס מטוהר המכיל רצף LPETGG KCKSGG N-terminal ו-C-terminal (המשמש בשלב זה לצימוד) למאגר התגובה של Sortase A (25 מ"מ HEPES pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ (NH₄)₂SO₄, 5 מ"מ CaCl₂) באמצעות עמודה עם שרף G-25. התאם את ריכוז החלבון ל-1 מיקרומטר עם מאגר תגובה מסוג A.
   2. הוסף פפטיד GGGG-MTX מומס ב-DMAc, ישירות לתמיסת החלבון לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   3. הוסף סוג A לריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר ודגירה למשך 12 שעות ב-15 מעלות צלזיוס בסיבוב עדין. ריכוזי הריאגנטים שישמשו בשלבים 2.1.1-2.1.3 נקבעים במידה רבה על ידי תפוקת המצומד שיש להשיג והמאפיינים הביוכימיים של חלבון המטרה (יעילות טיהור החלבון, מסיסותו ויציבותו). לתגובת מיון A יעילה, השתמש בנקודת התחלה בריכוז נמוך פי עשרה עד פי מאה של סוג A מאשר חלבון המטרה המכיל LPETTGG וריכוז גבוה פי 100 של GGGG-MTX מאשר חלבון מתויג LPETGG.
   4. טען את תערובת התגובה על עמוד הפרין ספרוז.
   5. שטפו מולקולות שלא הגיבו עם 25 מ"מ HEPES pH 7.4.
   6. הסר את תוצר התגובה (FGF2. MTX) עם 25 מ"מ HEPES pH 7.4 עם 2 M NaCl.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   7. נתח את יעילות ההטיה באמצעות SDS-PAGE. השתמשו בג'ל הפרדה של 15%, בסמן חלבון של 10-250 kDa, ונתחו רצועות בין 15 ל-25 kDa (איור 3).
2. צימוד MMAE לרצף KCKSGG N-terminal של FGF2 מהונדס באמצעות תגובת מלימיד-תיול
   1. FGF2 מהונדס המכיל רצף LPETGG KCKSGG ו-C-terminal N-terminal למאגר התגובה (25 מ"מ HEPES pH 7.0, 10 מ"מ (NH₄)₂SO₄, 10 מ"מ מתיונין, 0.1 מ"מ EDTA) באמצעות עמודה עם שרף Sephadex G-25. התאם את ריכוז החלבון ל-25 מיקרומטר עם מאגר התגובה.
   2. ממיסים MMAE ב-DMAc להכנת תמיסת מלאי של 40 מ"מ.
   3. לצינור התגובה החדש הוסף עודף מולרי ראשון פי ארבעה של MMAE על פני קבוצות חלבון -SH. לאחר מכן הוסף נפח כפול של מאגר PBS ביחס לנפח החלבון FGF2. לבסוף הוסף חלבון FGF2.
      הערה: בשלב זה חשוב להוסיף את סדר הריאגנטים.
   4. בצע את התגובה למשך שעה ב-20 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין.
   5. טען את תערובת התגובה על עמוד קרבוקסימתיל (CM)-Sepharose ושטוף את עודפי החומר הציטוטוקסי הלא מצומד עם 25 מ"מ HEPES pH 7.4. תנאים קלים אלה מונעים דנטורציה של חלבון.
   6. לחסל את ה-MMAE. FGF2 מצומד מהעמודה עם 25 מ"מ HEPES pH 7.4 עם 0.5 M NaCl.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   7. נתח את יעילות ההטיה באמצעות SDS-PAGE. השתמשו בג'ל הפרדה של 15%, בסמן חלבון של 10-250 kDa, ונתחו רצועות בין 15 ל-25 kDa (איור 3).
3. הכנת צימוד ראש נפץ כפול של FGF2 מהונדס באמצעות שילוב של כימיה מלימיד-תיול וקשירה בתיווך סורטאז A
   הערה: ליצירת צימודים של ראשי נפץ כפולים של FGF2 מהונדס משולבים שלבים 2.1 ו-2.2. MMAE ראשון. מצומד FGF2 מיוצר באמצעות כימיה של מלימיד-תיול (שלב 2.2) ומשמש לחיבור של GGGG-MTX עם סוג A לתג LPETGG מסוף C של MMAE. FGF2 (שלב 2.1). כמו כן, הליך הפוך אפשרי גם כן (תחילה מיון צימוד בתיווך A, ולאחר מכן תגובת מלימיד-תיול).
   1. השתמש בשלבים 2.2.1-2.2.7 להכנת MMAE חד-תחליף. מצומד FGF2.
   2. החלף את המאגר עבור מאגר התגובה מסוג A (25 מ"מ HEPES pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ (NH₄)₂SO₄, 5 מ"מ CaCl₂) באמצעות עמודה עם שרף Sephadex G-25.
   3. המשך כמתואר ב-2.1.2-2.1.7.

הפרוטוקולים המוצגים מתארים שתי אסטרטגיות נפרדות לצימוד של תרופות ציטוטוקסיות שונות לחלבונים מעניינים. יתר על כן, מוצג שילוב של אסטרטגיות בודדות המאפשר ליצור מצומדים ציטוטוקסיים של ראש נפץ כפול באופן ספציפי לאתר.

כפי שמוצג בג'לים SDS-PAGE באיור 2

בשל העניין הרב בתכנון טיפולים סלקטיביים נגד סוגי סרטן מגוונים, יש צורך דחוף באסטרטגיות המאפשרות הצמדה ספציפית לאתר של מטענים נפרדים לחלבוני המטרה. השינוי הספציפי לאתר של חלבונים מכוונים הוא קריטי מכיוון שהוא מבטיח הומוגניות של מצומדים ביו-אקטיביים מפותחים, תנאי מוקדם ?...

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי הצוות הראשון ותוכניות האינטגרציה מחדש של הקרן למדע פולני (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00) במימון משותף של האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח אזורי, הוענק ל-L.O ו-A.S. M.Z נתמך על ידי OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) ו-Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) מהמרכז הלאומי למדע. עבודת A.S.W נתמכה על ידי מענק מיניאטורה מהמרכז הלאומי למדע (2019/03/X/NZ1/01439).