Herstellung von ortsspezifischen zytotoxischen Proteinkonjugaten mittels Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation

In dieser Arbeit stellen wir detaillierte Protokolle für eine ortsspezifische Markierung von Proteinen mit zytotoxischen Wirkstoffen unter Verwendung der Maleimid-Thiol-Reaktion und der Sortase A-vermittelten Ligation zur Verfügung.

Krebs ist derzeit die zweithäufigste Todesursache weltweit. Das Kennzeichen von Krebszellen ist das Vorhandensein spezifischer Markerproteine wie Wachstumsfaktor-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Diese Eigenschaft ermöglicht die Entwicklung hochselektiver Therapeutika, der Protein-Biokonjugate, die aus Zielproteinen (Antikörpern oder Rezeptorliganden) bestehen, die durch einen spezifischen Linker mit hochzytotoxischen Arzneimitteln verbunden sind. Aufgrund der sehr hohen Affinität und Selektivität der Zielproteine erkennen die Biokonjugate Markerproteine auf der Oberfläche der Krebszellen und nutzen die Rezeptor-vermittelte Endozytose, um ins Zellinnere zu gelangen. Das intrazelluläre vesikuläre Transportsystem liefert die Biokonjugate schließlich an die Lysosomen, wo die Proteolyse freie zytotoxische Wirkstoffe vom proteinhaltigen Kern der Biokonjugate trennt und den medikamentenabhängigen Abtod der Krebszellen auslöst. Derzeit gibt es mehrere Protein-Biokonjugate, die für die Krebsbehandlung zugelassen sind, und eine große Anzahl befindet sich in der Entwicklung oder in klinischen Studien.

Eine der größten Herausforderungen bei der Generierung der Biokonjugate ist eine ortsspezifische Bindung des zytotoxischen Wirkstoffs an das Zielprotein. In den letzten Jahren wurden enorme Fortschritte bei der Entwicklung chemischer und enzymatischer Strategien zur Proteinmodifikation mit Zytostatika erzielt. Hier stellen wir die detaillierten Protokolle für den ortsspezifischen Einbau zytotoxischer Sprengköpfe in Targeting-Proteine vor, wobei eine chemische Methode unter Verwendung der Maleimid-Thiol-Chemie und eines enzymatischen Ansatzes verwendet wird, der auf einer Sortase A-vermittelten Ligation beruht. Wir verwenden die modifizierte Variante des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 2 und die fragmentkristallisierbare Region des humanen Immunglobulins G als beispielhafte Targeting-Proteine sowie Monomethylauristatin E und Methotrexat als zytotoxische Modellmedikamente. Alle beschriebenen Strategien ermöglichen die hocheffiziente Erzeugung von biologisch aktiven zytotoxischen Konjugaten mit definierter molekularer Architektur mit Potenzial für die selektive Behandlung verschiedener Krebsarten.

Jahrzehntelange wissenschaftliche Bemühungen haben zu einem enormen Fortschritt unseres Wissens über die molekularen Mechanismen geführt, die die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs steuern. Gleichzeitig sind die therapeutischen Möglichkeiten aufgrund der Nebenwirkungen von Arzneimitteln, die durch ihre mangelnde Selektivität, die große Variabilität der Tumoren und die nach längerer Behandlung entstehende Arzneimittelresistenz verursacht werden, noch weitgehend eingeschränkt. Zielgerichtete Krebstherapien haben in den letzten Jahren als neuartige und vielversprechende Ansätze zur Behandlung verschiedener Tumore an Aufmerksamkeit gewonnen. Zielgerichtete Therapien beruhen auf ausgeklügelten Medikamentenverabreichungssystemen, die die zytotoxische Nutzlast präzise an die Krebszellen abgeben und die gesunden Zellen schonen. Dazu gehören vor allem diverse Nanopartikel, Liposomen und proteinbasierte Wirkstoffträger.

Krebszellen weisen oft erhöhte Mengen an spezifischen Markerproteinen auf ihrer Oberfläche auf. Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) sind neuartige proteinbasierte Krebstherapeutika, die in einem Molekül die extreme Spezifität monoklonaler Antikörper und die hohe zytotoxische Wirksamkeit von Arzneimitteln vereinen. Sobald sie an die Oberfläche der Krebszelle gebunden sind, nutzen ADC die Rezeptor-vermittelte Endozytose, um in die Zelle einzudringen. Anschließend werden ADCs über endosomale Kompartimente zu den Lysosomen transportiert, wo Proteasen ADCs abbauen und aktive zytotoxische Wirkstoffe freisetzen. Derzeit sind in den USA acht ADCs für die Behandlung verschiedener Tumoren zugelassen, darunter dreifach negativer Brustkrebs, HER2-positiver Brustkrebs, Urothelkarzinom, diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom, hämatologische Malignome, Hodgkin-Lymphom und akute myeloische Leukämie. Eine große Anzahl von ADCs befindet sich ebenfalls entweder in der Entwicklung oder wartet auf die Zulassung¹. Bemerkenswert ist, dass Protein-Engineering-Ansätze zur Entwicklung vielfältiger Alternativen zu monoklonalen Antikörpern geführt haben: Proteingerüste und ihre zytotoxischen Konjugate. Dazu gehören verschiedene Antikörperfragmente ^2,3, DARPine ^4,5, Knottine ^6,7, Centyrine⁸, Affibodies ^9,10 oder modifizierte Rezeptorliganden^11,12.

Es gibt mehrere kritische Anforderungen, die ein erfolgreiches proteinbasiertes zytotoxisches Konjugat erfüllen muss, nämlich die Konjugatstabilität, die außergewöhnliche Spezifität, die hohe Affinität des Konjugats zu krebsspezifischen Markern, die schnelle Internalisierung des Konjugats in das Innere der Krebszelle, seinen effizienten Transport zu den Lysosomen und die effektive intrazelluläre Freisetzung der aktiven Nutzlast. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die Homogenität der Konjugate, die weitgehend von der angewandten Strategie für die Bindung der Nutzlast an die Zielproteine abhängt. Es gibt mehrere Methoden für die ortsspezifische Konjugation von Proteinen mit zytotoxischen Arzneimitteln, wie z. B. die Modifikation von Protein-Seitenketten-Cystein- oder Lysinresten, die Bindung des Arzneimittels an unnatürliche Aminosäuren, die in die Zielproteine eingebaut sind, oder enzymatische Modifikationen der Zielproteine (z. B. mit Transglutaminase, Glykosyltransferase, Formylglycin-erzeugendem Enzym, Sortase A). In den meisten Fällen erfordern ortsspezifische Konjugationsmethoden Modifikationen der Zielmoleküle (z.B. durch Cystein-Engineering oder Einführung kurzer Peptid-Tags), führen aber wiederum zu einer effizienten Produktion von homogenem Konjugat.

Hier stellen wir Protokolle für die hocheffiziente ortsspezifische Konjugation von Targeting-Proteinen mit zytotoxischen Wirkstoffen zur Verfügung. Als exemplarische Proteine haben wir zwei verschiedene Moleküle verwendet: das kristallisierbare (Fc) Fragment von humanem IgG und eine manipulierte Variante des humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktors 2 (FGF2). Das Fc-Fragment ist ein integraler Bestandteil typischer ADCs, aber es ist auch in anderen Arten von Konjugaten wie zytotoxischen Peptibodies oder Konjugaten von Antikörperfragmenten vorhanden. FGF2 ist ein natürlicher Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGFR)-Ligand, der erfolgreich entwickelt wurde, um ein selektives zytotoxisches Konjugat zu erzeugen, das auf FGFR-überproduzierende Krebszellen abzielt.

Wir stellen zwei unterschiedliche Konjugationsstrategien vor, die den ortsspezifischen Einbau von Zytostatika ermöglichen. Zunächst wird das Protokoll für die Konjugation an die Cystein-Seitenketten des Fc-Fragments mittels Maleimid-Thiol-Chemie auf der Grundlage des Hermanson-Protokolls¹³ bereitgestellt (Abbildung 1A,B). In diesem Protokoll werden zunächst zwei Disulfidbindungen mit Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) reduziert und die resultierenden freien Thiolgruppen über die Maleimid-Thiol-Chemie mit Monomethylauristatin E (MMAE) konjugiert (Abbildung 1B). Aufgrund der Interaktion zwischen konstanten Schwerkettendomänen 2 und 3 (CH2 und CH3) bleibt die dimere Struktur des wirkstoffgebundenen Fc erhalten. Zweitens wird die Strategie zur Erzeugung eines FGF2-Konjugats mit Doppelgefechtskopf vorgestellt, das Cystein-Engineering und Sortase A-vermittelte Ligation für den ortsspezifischen Einbau von zwei unterschiedlichen Wirkstoffen in FGF2 kombiniert (Abbildung 1A,C). Es wird die cysteinfreie Variante von FGF2 verwendet, die zusätzliches N-terminales KCKSGG mit einfach freiliegendem Cysteinrest und C-terminalem LPETGG-Kurzpeptid-Tag trägt¹². Die Maleimid-Thiol-Reaktion ermöglicht die Konjugation von MMAE an Cystein innerhalb des KCKSSG-Linkers, der von unserer Gruppe^14,15 entwickelt wurde. Sortierung A-abhängiger Schritt (basierend auf Chen et al.)¹⁶ vermittelt die Ligation des Methotrexat (MTX)-gebundenen Tetraglycinpeptids GGGG-MTX an die C-terminale LPETGG-Sequenz, wodurch zwei Arten von Einzelgefechtskopfkonjugaten erhalten werden (Abbildung 1C). Sortase A ist eine Cysteinprotease, die die Transpeptidierungsreaktion zwischen LPETGG- und GGGG-Motiven katalysiert. Das Enzym bindet an das LPETGG-Motiv am C-Terminus des Proteins, dann wird die Amidbindung zwischen dem Threonin und dem Glycin hydrolysiert, um einen Enzym-Substrat-Komplex zu bilden. Der nächste Schritt ist die Aminolyse der Thioester-Enzym-Substrat-Bindung, wobei der Donor einer primären Aminogruppe der Glycinrest des Tetraglycin-Motivs¹⁷ ist. Die Kombination dieser beiden Ansätze erzeugt standortspezifische FGF2-Doppelgefechtskopf-Konjugate (Abbildung 1C). Im Prinzip können die bereitgestellten Konjugationsprotokolle erfolgreich auf jedes manipulierte Zielprotein von Interesse angewendet werden, um selektive zytotoxische Konjugate zu erzeugen. Darüber hinaus eignet er sich aufgrund seiner Vielseitigkeit für viele andere Protein-Protein- und Protein-Peptid-Ligationszwecke sowie für die Bindung von Lipiden, Polymeren, Nukleinsäuren und Fluorophoren an Proteine mit verfügbarer Sulfhydrylgruppe (oder erzeugt durch Reduktion nativer Disulfidbindungen) und/oder mit eingeführtem kleinen Peptid-Tag.

1. Konjugation der Fc-Domäne mit MMAE

HINWEIS: Vor ortsspezifischen Konjugationen sind die wichtigsten Reagenzien vorzubereiten: hochreines Protein von Interesse (in diesem Fall das Fc-Fragment und die manipulierte FGF2-Variante, als Ausgangspunkt 1-5 mg rekombinantes Protein, hergestellt gemäß Sokolowska-Wedzina¹⁸), Maleimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzylalkohol (PABC)-monomethylauristatin E (MMAE) (Vorsicht, hochgradig zytotoxisches Mittel, vorsichtig behandeln), Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Sortase A¹⁶. Methotrexat, das an das Tetraglycinpeptid (GGGG-MTX) gebunden ist (Vorsicht, MTX ist ein hochgradig zytotoxisches Mittel, mit Vorsicht zu behandeln) kann entweder auf der festen Stützphase gemäß der Methode der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) in der Fmoc-Strategie¹⁹ synthetisiert oder aus kommerziellen Quellen gewonnen werden.

1. Um Disulfidbindungen innerhalb des Fc-Fragments (Abbildung 1) zu reduzieren, fügen Sie den zehnfachen molaren Überschuss von TCEP über das Fc-Protein (39 μM) in PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7,4) hinzu und inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C. Der pH-Wert der TCEP-Stammlösung sollte mit 0,1 M NaOH auf 6,0 eingestellt werden. um eine Proteinfällung durch pH-Änderungen zu verhindern.
2. Nach der Inkubation wird das reduzierte Protein mit einem 0,2-μm-Filter filtriert, um Proteinausfällungen zu entfernen.
3. In das neue Reaktionsröhrchen geben Sie den ersten vierfachen molaren Überschuss an MMAE (MMAE in N,N-Dimethylacetamid (DMAc) auflösen, um 40 mM Stammlösung herzustellen) über Protein--SH-Gruppen. Fügen Sie dann das doppelte Volumen des PBS-Puffers im Verhältnis zum Volumen des Fc-Proteins hinzu. Fügen Sie zuletzt das reduzierte Fc-Fragment aus Schritt 1.2 hinzu.
   HINWEIS: In diesem Schritt ist die Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien wichtig.
4. Die Konjugationsreaktion über Nacht bei 15 °C mit sanfter Drehung durchführen. Diese milden Bedingungen verhindern die Denaturierung von Proteinen.
5. Filtrieren Sie die Lösung mit einem Konjugat unter Verwendung eines 0,2-μm-Filters, um mögliche Ausfällungen zu entfernen.
6. Führen Sie SDS-PAGE durch, um die Effizienz der Reaktion zu analysieren. Verwenden Sie ein 10%-Trenngel, einen Proteinmarker von 10 bis 250 kDa und analysieren Sie Banden zwischen 35 und 50 kDa (Abbildung 2).
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und das Reaktionsgemisch entweder bei 4 °C für die Kurzzeitlagerung oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. Das Einfrieren und Auftauen kann jedoch zu zusätzlichem Niederschlag führen und die Ausbeute an konjugierter Reinigung verringern.
7. Laden Sie das Reaktionsgemisch auf eine Säule mit Protein-A-konjugierten Kügelchen und waschen Sie den Überschuss an MMAE mit Waschpuffer 1 ab, der 300 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0,1 % Tween 20, 2 mM EDTA pH 7,4 enthält. Waschen Sie dann die Säule mit Waschpuffer 2 mit 650 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄, pH 7,4.
   HINWEIS: Durch selektive Wechselwirkung des Fc-Bereichs des Konjugats mit Protein A auf den Kügelchen wird das Konjugat auf der Säule eingefangen, während nicht umgesetztes MMAE ausgewaschen wird. Dieser Schritt ist notwendig, um hochreines Konjugat zu erhalten.
8. Eluieren Sie das Fc-MMAE-Konjugat aus der Säule mit 0,1 M Natriumcitrat pH 3,5 bis 1,5 mL Röhrchen mit 1 M Tris pH 9,0 (1 ml Protein auf 200 μl 1 M Tris pH 9,0).
9. Entsalzen Sie Fc-MMAE auf PBS pH 7,4 mit einer Säule mit Sephadex G-25 Harz. Dieser Schritt verhindert eine Denaturierung des Konjugats und ermöglicht die Verwendung des Konjugats in In-vitro- und In-vivo-Tests.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
10. Führen Sie SDS-PAGE (10%) durch, um das endgültige Fc-MMAE-Konjugat zu analysieren. Verwenden Sie ein 10%-Trenngel, einen Proteinmarker von 10 bis 250 kDa und analysieren Sie Banden zwischen 35 und 50 kDa (Abbildung 2).

2. Konjugation von künstlich hergestelltem FGF2

1. Konjugation von GGGG-MTX an die C-terminale LPETGG-Sequenz von engineered FGF2 über Sortase A-vermittelte Ligation
   1. Übertragen Sie gereinigtes, technisch hergestelltes FGF2, das N-terminale KCKSGG- und C-terminale LPETGG-Sequenzen enthält (in diesem Schritt für die Konjugation verwendet) unter Verwendung einer Säule mit G-25-Harz auf den Sortase-A-Reaktionspuffer (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂). Passen Sie die Proteinkonzentration mit sortase A Reaktionspuffer auf 1 μM an.
   2. Das in DMAc gelöste GGGG-MTX-Peptid wird bis zu einer Endkonzentration von 100 μM direkt in die Proteinlösung gegeben.
   3. Sortase A auf eine Endkonzentration von 0,1 μM zugeben und 12 h bei 15 °C mit sanfter Rotation inkubieren. Die Konzentrationen der in den Schritten 2.1.1 bis 2.1.3 zu verwendenden Reagenzien werden weitgehend durch die zu erzielende Konjugatausbeute und die biochemischen Eigenschaften des Zielproteins (Wirksamkeit der Proteinreinigung, Löslichkeit und Stabilität) bestimmt. Für eine effektive Sortase A-Reaktion ist eine zehn- bis hundertfach niedrigere Konzentration von Sortase A als das LPETGG-haltige Zielprotein und eine 100-mal höhere Konzentration von GGGG-MTX als das LPETGG-markierte Protein zu verwenden.
   4. Laden Sie das Reaktionsgemisch auf eine Heparin-Sepharose-Säule.
   5. Waschen Sie nicht umgesetzte Moleküle mit 25 mM HEPES pH 7,4 ab.
   6. Eluieren Sie das Produkt der Reaktion (FGF2. MTX) mit 25 mM HEPES, pH 7,4 mit 2 M NaCl.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   7. Analysieren Sie die Effizienz der Konjugation mit SDS-PAGE. Verwenden Sie ein 15%iges Trenngel, einen Proteinmarker von 10 bis 250 kDa und analysieren Sie Banden zwischen 15 und 25 kDa (Abbildung 3).
2. Konjugation von MMAE an die N-terminale KCKSGG-Sequenz von manipuliertem FGF2 über Maleimid-Thiol-Reaktion
   1. Entsalzung von FGF2 mit N-terminaler KCKSGG- und C-terminaler LPETGG-Sequenz zum Reaktionspuffer (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM Methionin, 0,1 mM EDTA) unter Verwendung einer Säule mit Sephadex G-25-Harz. Stellen Sie die Proteinkonzentration mit dem Reaktionspuffer auf 25 μM ein.
   2. MMAE in DMAc auflösen, um eine 40 mM Stammlösung herzustellen.
   3. In das neue Reaktionsröhrchen geben Sie den ersten vierfachen molaren Überschuss an MMAE über Protein-SH-Gruppen. Fügen Sie dann das doppelte Volumen PBS-Puffer im Verhältnis zum Volumen des FGF2-Proteins hinzu. Fügen Sie zuletzt das FGF2-Protein hinzu.
      HINWEIS: In diesem Schritt ist die Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien wichtig.
   4. Die Reaktion 1 h lang bei 20 °C bei sanfter Drehung durchführen.
   5. Das Reaktionsgemisch wird auf eine Carboxymethyl (CM)-Sepharose-Säule geladen und der Überschuss des unkonjugierten Zytostatikums wird mit 25 mM HEPES pH 7,4 abgewaschen. Diese milden Bedingungen verhindern die Denaturierung von Proteinen.
   6. Eluieren Sie das MMAE. FGF2-Konjugat aus der Säule mit 25 mM HEPES, pH 7,4 mit 0,5 M NaCl.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   7. Analysieren Sie die Effizienz der Konjugation mit SDS-PAGE. Verwenden Sie ein 15%iges Trenngel, einen Proteinmarker von 10 bis 250 kDa und analysieren Sie Banden zwischen 15 und 25 kDa (Abbildung 3).
3. Herstellung eines dualen Gefechtskopfkonjugats aus enginneriertem FGF2 unter Verwendung einer Kombination aus Maleimid-Thiol-Chemie und Sortase A-vermittelter Ligation
   ANMERKUNG: Für die Erzeugung von Konjugaten mit doppeltem Gefechtskopf aus konstruiertem FGF2 werden die Schritte 2.1 und 2.2 kombiniert. Zuerst MMAE. Das FGF2-Konjugat wird mittels Maleimid-Thiol-Chemie (Schritt 2.2) hergestellt und für die Bindung von GGGG-MTX mit Sortase A an den C-terminalen LPETGG-Tag von MMAE verwendet. FGF2 (Schritt 2.1). Es ist auch ein umgekehrtes Verfahren möglich (zuerst Sortase A-vermittelte Konjugation, dann Maleimid-Thiol-Reaktion).
   1. Die Schritte 2.2.1 bis 2.2.7 sind für die Herstellung von monosubstituiertem MMAE anzuwenden. FGF2-Konjugat.
   2. Tauschen Sie den Puffer gegen den Sortase A Reaktionspuffer (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) mit einer Säule mit Sephadex G-25 Harz aus.
   3. Fahren Sie fort, wie in 2.1.2-2.1.7 beschrieben.

Die vorgestellten Protokolle beschreiben zwei unterschiedliche Strategien für die Konjugation verschiedener zytotoxischer Wirkstoffe in Proteine von Interesse. Darüber hinaus wird eine Kombination einzelner Strategien gezeigt, die es ermöglicht, zytotoxische Konjugate mit doppeltem Gefechtskopf auf ortsspezifische Weise zu erzeugen.

Wie an SDS-PAGE-Gelen in Abbildung 2 (Spur 2 vs. 3) gezeigt, ermöglicht die Maleimid-Thiol-Reak...

Aufgrund des großen Interesses an der Entwicklung selektiver Therapeutika gegen verschiedene Krebsarten besteht ein dringender Bedarf an Strategien, die eine ortsspezifische Bindung unterschiedlicher Frachten an die Zielproteine ermöglichen. Die ortsspezifische Modifikation von Targeting-Proteinen ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Homogenität der entwickelten bioaktiven Konjugate sicherstellt, eine Voraussetzung für moderne Therapeutika. Es gibt verschiedene Methoden, sowo...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das First TEAM und die Reintegrationsprogramme der Stiftung für Polnische Wissenschaft (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00), von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung kofinanziert, an L.O und A.S. M.Z. vergeben. Die Arbeit von M.Z wurde unterstützt von OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) und Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) des Nationalen Wissenschaftszentrums. Die Arbeit von A.S.W. wurde durch ein Miniatura-Stipendium des National Science Centre (2019/03/X/NZ1/01439) unterstützt.