JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولات مفصلة لوضع العلامات الخاصة بالموقع للبروتينات بالأدوية السامة للخلايا باستخدام تفاعل ماليميد ثيول والربط بوساطة نوع A.

Abstract

يعد السرطان حاليا ثاني أكثر أسباب الوفاة شيوعا في جميع أنحاء العالم. السمة المميزة للخلايا السرطانية هي وجود بروتينات علامات محددة مثل مستقبلات عامل النمو على سطحها. تتيح هذه الميزة تطوير علاجات انتقائية للغاية ، وهي الاقتران الحيوي للبروتين ، والتي تتكون من بروتينات مستهدفة (أجسام مضادة أو روابط مستقبلات) متصلة بأدوية شديدة السمية للخلايا بواسطة رابط معين. نظرا للتقارب العالي جدا والانتقائية لبروتينات الاستهداف ، تتعرف المترافقات الحيوية على بروتينات العلامات على سطح الخلايا السرطانية وتستخدم الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات للوصول إلى داخل الخلية. يقوم نظام النقل الحويصلي داخل الخلايا في النهاية بتوصيل المترافقات الحيوية إلى الجسيمات الحالة ، حيث يفصل التحلل البروتيني الأدوية السامة للخلايا الحرة عن اللب البروتيني للمترافقات الحيوية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا السرطانية المعتمدة على الأدوية. حاليا ، هناك العديد من المقترنات الحيوية البروتينية المعتمدة لعلاج السرطان وعدد كبير قيد التطوير أو التجارب السريرية.

أحد التحديات الرئيسية في توليد المترافقات الحيوية هو الارتباط الخاص بالموقع للدواء السام للخلايا بالبروتين المستهدف. حققت السنوات الأخيرة تقدما هائلا في تطوير الاستراتيجيات الكيميائية والأنزيمية لتعديل البروتين بالأدوية السامة للخلايا. نقدم هنا البروتوكولات التفصيلية لدمج الرؤوس الحربية السامة للخلايا في بروتينات الاستهداف باستخدام طريقة كيميائية تستخدم كيمياء الماليميد ثيول ونهج إنزيمي يعتمد على ربط بوساطة نوع A. نحن نستخدم متغيرا هندسيا لعامل نمو الخلايا الليفية 2 والمنطقة القابلة للتبلور من الغلوبولين المناعي البشري G كبروتينات استهداف نموذجية وأحادي ميثيل أوريستاتين E والميثوتريكسات كأدوية نموذجية سامة للخلايا. تسمح جميع الاستراتيجيات الموصوفة بتوليد عالي الكفاءة من المترافقات السامة للخلايا النشطة بيولوجيا ذات الهندسة الجزيئية المحددة مع إمكانية العلاج الانتقائي للسرطانات المتنوعة.

Introduction

أدت عقود من الجهود العلمية إلى تقدم هائل في معرفتنا بالآليات الجزيئية التي تحكم تطور السرطان وتطوره. في الوقت نفسه ، لا تزال الإمكانيات العلاجية محدودة إلى حد كبير بسبب الآثار الضارة للأدوية الناجمة عن افتقارها إلى الانتقائية ، والتباين الكبير في الأورام ومقاومة الأدوية التي تطورت بعد العلاج المطول. اكتسبت العلاجات المضادة للسرطان اهتماما في السنوات الأخيرة كأساليب جديدة وواعدة للغاية لعلاج الأورام المتنوعة. تعتمد العلاجات المستهدفة على أنظمة توصيل الأدوية المتطورة التي توفر بدقة الحمولة السامة للخلايا إلى الخلايا السرطانية وتحافظ على الخلايا السليمة. وتشمل هذه الجسيمات النانوية المتنوعة بشكل أساسي ، والجسيمات الشحمية ، وناقلات الأدوية القائمة على البروتين.

غالبا ما تكشف الخلايا السرطانية عن مستويات مرتفعة من بروتينات علامات معينة على سطحها. مترافقات أدوية الأجسام المضادة (ADCs) هي علاجات جديدة مضادة للسرطان قائمة على البروتين ، والتي تجمع في جزيء واحد بين الخصوصية القصوى للأجسام المضادة وحيدة النسيلة وفعالية عالية السمية للخلايا للأدوية. بمجرد ربطه بسطح الخلية السرطانية ، يستخدم ADC الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات لدخول الخلية. بعد ذلك ، يتم نقل ADCs عبر مقصورات داخلية إلى الجسيمات الحالة ، حيث تتحلل البروتياز ADCs وتطلق أدوية نشطة سامة للخلايا. حاليا ، هناك ثمانية ADCs معتمدة في الولايات المتحدة لعلاج الأورام المتنوعة ، بما في ذلك سرطان الثدي الثلاثي السلبي ، وسرطان الثدي الإيجابي HER2 ، وسرطان الظهارة البولية ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة ، والأورام الخبيثة الدموية ، وسرطان الغدد الليمفاوية هودجكين ، وسرطان الدم النخاعي الحاد. كما أن عددا كبيرا من ADCs إما قيد التطوير أو ينتظر الموافقة1. وتجدر الإشارة إلى أن مناهج هندسة البروتين أدت إلى تطوير بديل متنوع للأجسام المضادة وحيدة النسيلة وسقالات البروتين ومرافقاتها السامة للخلايا. وتشمل هذه شظايا الأجسام المضادةالمختلفة 2،3 ، و DARPins4،5 ، و knottins6،7 ، و centyrins8 ، و affibodies9،10 ، أو روابط المستقبلات الهندسية11،12.

هناك العديد من المتطلبات الحاسمة التي يجب الوفاء بها من خلال مترافق سام للخلايا قائم على البروتين ، وهي الاستقرار المترافق ، والخصوصية غير العادية ، والتقارب العالي للمرافق تجاه علامة خاصة بالسرطان ، والاستيعاب السريع للمرافق في داخل الخلية السرطانية ، ونقله الفعال إلى الجسيمات الحالة والإفراج الفعال داخل الخلايا للحمولة النشطة. ميزة أخرى مهمة هي التجانس المترافق ، والذي يعتمد إلى حد كبير على الإستراتيجية المطبقة لربط الحمولة الصافية بالبروتينات المستهدفة. هناك العديد من الطرق المتاحة لاقتران البروتينات مع الأدوية السامة للخلايا ، مثل تعديل بقايا السيستين أو الليسين ذات السلسلة الجانبية للبروتين ، أو ربط الدواء بالأحماض الأمينية غير الطبيعية المدمجة في البروتينات المستهدفة ، أو التعديلات الأنزيمية للبروتينات المستهدفة (على سبيل المثال ، مع ترانسجلوتاميناز ، جليكوزيل ترانسفيراز ، إنزيم مولد للفورميل جلايسين ، نوع أ). في معظم الحالات ، تتطلب طرق الاقتران الخاصة بالموقع تعديلات على جزيئات الاستهداف (على سبيل المثال ، عن طريق هندسة السيستين أو إدخال علامات الببتيد القصيرة) ، ولكنها بدورها تؤدي إلى إنتاج فعال لمرافق متجانس ذي أهمية.

نقدم هنا بروتوكولات لاقتران عالي الكفاءة الخاص بالموقع لاستهداف البروتينات بالأدوية السامة للخلايا. كبروتينات نموذجية ، استخدمنا جزيئين مختلفين: الجزء القابل للتبلور (Fc) من IgG البشري والمتغير المصمم هندسيا لعامل نمو الخلايا الليفية البشرية 2 (FGF2). يشكل جزء Fc جزءا لا يتجزأ من ADCs النموذجية ، ولكنه موجود أيضا في أنواع أخرى من المترافقات مثل الأجسام الببتي السامة للخلايا أو اقترانات شظايا الأجسام المضادة. FGF2 هو ترابط طبيعي لمستقبلات عامل نمو الخلايا الليفية (FGFR) تم تصميمه بنجاح لإنتاج مترافق انتقائي سام للخلايا يستهدف الخلايا السرطانية التي تفرط إنتاج FGFR.

نقدم استراتيجيتين متمايزتين للاقتران تسمح بدمج الأدوية السامة للخلايا في الموقع المحدد. أولا ، يتم توفير بروتوكول الاقتران بالسلاسل الجانبية للسيستين لجزء Fc عبر كيمياء maleimide-thiol بناء على بروتوكول Hermanson13 (الشكل 1أ ، ب). في هذا البروتوكول ، يتم تقليل وصلات ثاني كبريتيد في البداية باستخدام ثلاثي (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) وتخضع مجموعات الثيول الحرة الناتجة للاقتران مع أحادي ميثيل أوريستاتين E (MMAE) عبر كيمياء الماليميد ثيول (الشكل 1 ب). نظرا للتفاعل بين مجالات السلسلة الثقيلة الثابتة 2 و 3 (CH2 و CH3) ، يتم الحفاظ على البنية الثنائية ل Fc المرتبط بالدواء. ثانيا ، يتم تقديم استراتيجية توليد مترافق FGF2 ذو الرأس الحربي المزدوج الذي يجمع بين هندسة السيستين والربط بوساطة النوع A لدمج عقارين متميزين في FGF2 بطريقة خاصة بالموقع (الشكل 1أ ، ج). يتم استخدام البديل الخالي من السيستين من FGF2 الذي يحمل KCKSGG الطرفية N الإضافية مع بقايا السيستين المكشوفة المفردة وعلامة الببتيد القصيرة LPETGG الطرفيةC 12. يسمح تفاعل maleimide-thiol باقتران MMAE إلى السيستين داخل رابط KCKSSG الذي صممته مجموعتنا14،15. خطوة تعتمد على Sortase A (بناء على Chen et al.)16 يتوسط ربط ببتيد التتراجليسين المرتبط بالميثوتريكسات (MTX) GGGG-MTX إلى تسلسل LPETGG الطرفي C ، مما ينتج عنه نوعان من اقترانات الرأس الحربي الفردي (الشكل 1 ج). سورتاز أ هو بروتياز السيستين الذي يحفز تفاعل البتيد بين أشكال LPETGG و GGGG. يرتبط الإنزيم بزخارف LPETGG عند الطرف C للبروتين ، ثم يتم تحلل رابطة الأميد بين الثريونين والجلايسين لتشكيل مركب ركيزة إنزيمية. الخطوة التالية هي الانحلال الأميني لرابطة ركيزة إنزيم ثيوستر ، حيث يكون المتبرع بمجموعة أمينية أولية هو بقايا الجلايسين في شكل رباعي الجليسين17. يؤدي الجمع بين هذين النهجين إلى إنشاء اقتران رأس حربي مزدوج FGF2 خاص بالموقع (الشكل 1 ج). من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق بروتوكولات الاقتران المقدمة بنجاح على أي بروتين استهداف هندسي ذي أهمية لتوليد اقترانات انتقائية سامة للخلايا. علاوة على ذلك ، فإن تعدد استخدامات هذا النهج يجعله مناسبا للعديد من أغراض ربط البروتين والبروتين والببتيد ، وكذلك لربط الدهون والبوليمرات والأحماض النووية والفلوروفورات بالبروتينات ذات مجموعة السلفهيدريل المتاحة (أو الناتجة عن تقليل روابط ثاني كبريتيد الأصلية) و / أو مع علامة الببتيد الصغيرة المقدمة.

Protocol

1. اقتران مجال FC مع MMAE

ملاحظة: قبل الاقترانات الخاصة بالموقع ، قم بإعداد الكواشف الرئيسية: بروتين عالي النقاء ذي أهمية (في هذه الحالة جزء Fc ومتغير FGF2 المصمم هندسيا ، كنقطة انطلاق 1-5 مجم من البروتين المؤتلف ، المحضر وفقا ل Sokolowska-Wedzina18) ، كحول maleimidocaproyl-Val-Cit-p-aminobenzyl (PABC) - monomethyl auristatin E (MMAE) (الحذر ، عامل شديد السمية للخلايا ، التعامل معه بحذر) ، Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) و sortase A16. يمكن تصنيع الميثوتريكسات المرتبط بببتيد رباعي الجلايسين (GGGG-MTX) (الحذر ، MTX هو عامل شديد السمية للخلايا ، يتعامل معه بحذر) في مرحلة الدعم الصلب وفقا لطريقة تخليق الببتيد في الطور الصلب (SPPS) في استراتيجية Fmoc19 أو الحصول عليها من مصادر تجارية.

  1. لتقليل روابط ثاني كبريتيد داخل جزء Fc (الشكل 1) ، أضف عشرة أضعاف زيادة مولار من TCEP على بروتين Fc (39 ميكرومتر) في PBS (100 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 18 ملي مولار هيدروكسيدهيدروكسيد 2PO4 ، 33 ملي مولار Na2HPO4 درجة الحموضة 7.4) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يجب أن يكون لمحلول مخزون TCEP درجة حموضة معدلة ب 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 6.0 ، من أجل منع ترسيب البروتين من تغيرات الأس الهيدروجيني.
  2. بعد الحضانة ، قم بتصفية البروتين المخفض باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة رواسب البروتين.
  3. أضف إلى أنبوب التفاعل الجديد أول فائض مولاري بأربعة أضعاف من MMAE (قم بإذابة MMAE في N ، N-dimethylacetamide (DMAc) لتحضير محلول مخزون 40 مليمتر) على مجموعات البروتين -SH. ثم أضف حجما مزدوجا من المخزن المؤقت PBS فيما يتعلق بحجم بروتين Fc. أخيرا ، أضف جزء Fc مخفض من الخطوة 1.2.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يكون ترتيب إضافة الكواشف مهما.
  4. قم بإجراء تفاعل الاقتران طوال الليل عند 15 درجة مئوية مع دوران لطيف. تمنع هذه الظروف الخفيفة تمسخ البروتين.
  5. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر لإزالة الرواسب المحتملة.
  6. قم بتنفيذ SDS-PAGE لتحليل كفاءة التفاعل. استخدم هلام فصل 10٪ ، وعلامة بروتين 10-250 كيلو دالتون ، وحلل النطاقات بين 35 و 50 كيلو دالتون (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، وتخزين خليط التفاعل إما عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل ، أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب التجميد والذوبان في هطول أمطار إضافية وتقليل غلة التنقية المترافقة.
  7. قم بتحميل خليط التفاعل على عمود به حبات مترافقة بالبروتين A واغسل فائض MMAE باستخدام مخزن الغسيل 1 الذي يحتوي على 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 18 ملي مولار هيدروهيدراتالصوديوم 2PO4 ، 33 ملي مولار ،Na 2HPO4 ، 0.1٪ Tween 20 ، 2 ملي مولار EDTA الرقم الهيدروجيني 7.4. ثم اغسل العمود باستخدام Washing Buffer 2 مع 650 ملي كلوريد الصوديوم ، 18 ملي هيدروكسيدهيدروجين 2PO4 ، 33 ملي Na2HPO4 ، درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: من خلال التفاعل الانتقائي لمنطقة Fc للمترافق مع البروتين A على الخرز ، يتم التقاط المترافق على العمود ، بينما يتم غسل MMAE غير المتفاعل. هذه الخطوة ضرورية للحصول على مترافق نقي للغاية.
  8. قم بإخراج Fc-MMAE المترافق من العمود ب 0.1 M من سترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة من 3.5 إلى 1.5 مل ، وأنابيب تحتوي على 1 M ، ودرجة الحموضة ، 9.0 ، (1 مل من البروتين إلى 200 ميكرولتر من 1 M ، ودرجة الحموضة Tris 9.0).
  9. تحلية Fc-MMAE إلى PBS درجة الحموضة 7.4 باستخدام عمود به راتنج Sephadex G-25. تمنع هذه الخطوة تمسخ المترافق وتسمح باستخدام المترافق في الاختبارات المختبرية وفي الجسم الحي.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  10. قم بتنفيذ SDS-PAGE (10٪) لتحليل الاقتران النهائي Fc-MMAE. استخدم هلام فصل 10٪ ، وعلامة بروتين 10-250 كيلو دالتون ، وحلل النطاقات بين 35 و 50 كيلو دالتون (الشكل 2).

2. اقتران FGF2 المصمم هندسيا

  1. اقتران GGGG-MTX مع تسلسل LPETGG الطرفي C ل FGF2 المصمم هندسيا عبر الربط بوساطة النوع A
    1. نقل FGF2 المنقى هندسيا الذي يحتوي على N-terminal KCKSGG وتسلسل LPETGG الطرفي C (المستخدم في هذه الخطوة للاقتران) إلى مخزن التفاعل A (25 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار (NH4) 2SO4 ، 5 ملي مولار كلوريدالصعيدين 2) باستخدام عمود به راتنج G-25. اضبط تركيز البروتين على 1 ميكرومتر باستخدام مخزن التفاعل الفرعي A.
    2. أضف ببتيد GGGG-MTX المذاب في DMAc ، مباشرة إلى محلول البروتين إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر.
    3. يضاف سورتاز A إلى التركيز النهائي البالغ 0.1 ميكرومتر ويحتضن لمدة 12 ساعة عند 15 درجة مئوية مع دوران لطيف. يتم تحديد تركيزات الكواشف التي ستستخدم في الخطوات 2.1.1-2.1.3 إلى حد كبير من خلال إنتاجية المترافق المراد تحقيقها والخصائص الكيميائية الحيوية للبروتين المستهدف (فعالية تنقية البروتين وقابليته للذوبان واستقراره). للحصول على تفاعل فعال من النوع A ، استخدم نقطة البداية تركيزا أقل من سورتاز A بعشرة إلى مائة مرة من البروتين المستهدف المحتوي على LPETGG وتركيز GGGG-MTX أعلى ب 100 مرة من البروتين الموسوم ب LPETGG.
    4. قم بتحميل خليط التفاعل على عمود الهيبارين سيفاروس.
    5. اغسل الجزيئات غير المتفاعلة ب 25 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4.
    6. قم بإزالة ناتج التفاعل (FGF2. MTX) مع 25 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 2 م كلوريد الصوديوم.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    7. تحليل كفاءة الاقتران باستخدام SDS-PAGE. استخدم هلام فصل 15٪ ، علامة بروتين 10-250 كيلو دالتون ، وحلل النطاقات بين 15 و 25 كيلو دالتون (الشكل 3).
  2. اقتران MMAE إلى تسلسل KCKSGG الطرفي N ل FGF2 المصمم هندسيا عبر تفاعل maleimide-thiol
    1. تم تصميم FGF2 المصمم هندسيا يحتوي على KCKSGG الطرفية N وتسلسل LPETGG الطرفي C إلى المخزن المؤقت للتفاعل (25 ملي مولار HEPES pH 7.0 ، 10 ملي مولار (NH4) 2SO4 ، 10 ملي ميثيونين ، 0.1 ملي مولار EDTA) باستخدام عمود به راتنج Sephadex G-25. اضبط تركيز البروتين على 25 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت للتفاعل.
    2. قم بإذابة MMAE في DMAc لتحضير محلول مخزون 40 ملم.
    3. أضف إلى أنبوب التفاعل الجديد أول فائض مولاري بأربعة أضعاف من MMAE على مجموعات البروتين -SH. ثم أضف حجما مزدوجا من المخزن المؤقت PBS فيما يتعلق بحجم بروتين FGF2. أخيرا أضف بروتين FGF2.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ترتيب إضافة الكواشف مهم.
    4. قم بتنفيذ التفاعل لمدة 1 ساعة عند 20 درجة مئوية مع دوران لطيف.
    5. قم بتحميل خليط التفاعل على عمود كربوكسي ميثيل (CM)-Sepharose واغسل فائض العامل السام للخلايا غير المترافق ب 25 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.4. تمنع هذه الظروف الخفيفة تمسخ البروتين.
    6. قم بإزالة MMAE. FGF2 مترافق من العمود مع 25 ملي مولار هيبس درجة الحموضة 7.4 مع 0.5 M كلوريد الصوديوم.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    7. تحليل كفاءة الاقتران باستخدام SDS-PAGE. استخدم هلام فصل 15٪ ، علامة بروتين 10-250 كيلو دالتون ، وحلل النطاقات بين 15 و 25 كيلو دالتون (الشكل 3).
  3. تحضير مترافق الرأس الحربي المزدوج ل FGF2 المهندسة باستخدام مزيج من كيمياء ماليميد-ثيول والربط بوساطة سورتيز A
    ملاحظة: لتوليد مترافقات الرؤوس الحربية المزدوجة من FGF2 الهندسية ، يتم الجمع بين الخطوتين 2.1 و 2.2. أول MMAE. يتم إنتاج مترافق FGF2 عن طريق كيمياء الماليميد - ثيول (الخطوة 2.2) ويستخدم لربط GGGG-MTX مع سورتاز A بعلامة LPETGG الطرفية C ل MMAE. FGF2 (الخطوة 2.1). أيضا ، الإجراء العكسي ممكن أيضا (الاقتران بوساطة النوع A أولا ، ثم تفاعل maleimide-thiol).
    1. استخدم الخطوات 2.2.1-2.2.7 لإعداد MMAE أحادي المستبدل. FGF2 مترافنة.
    2. استبدل المخزن المؤقت للمخزن المؤقت للتفاعل A (25 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار (NH4) 2SO4 ، 5 ملي مولار CaCl2) باستخدام عمود به راتنج Sephadex G-25.
    3. تابع كما هو موضح في 2.1.2-2.1.7.

النتائج

تصف البروتوكولات المقدمة استراتيجيتين متميزتين لاقتران الأدوية السامة للخلايا المختلفة في بروتينات ذات أهمية. علاوة على ذلك ، تم عرض مجموعة من الاستراتيجيات الفردية التي تسمح بتوليد متقارنات سامة للخلايا ذات رأس حربي مزدوج بطريقة خاصة بالموقع.

كما هو م?...

Discussion

نظرا للاهتمام الكبير بتصميم العلاجات الانتقائية ضد أنواع السرطان المتنوعة ، هناك حاجة ملحة لاستراتيجيات تسمح بربط الشحنات المميزة بالبروتينات المستهدفة الخاصة بالموقع. يعد التعديل الخاص بالموقع للبروتينات المستهدفة أمرا بالغ الأهمية لأنه يضمن تجانس المتقارنات النش?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل الفريق الأول وبرامج إعادة الإدماج التابعة لمؤسسة العلوم البولندية (POIR.04.04.00-00-43B2 / 17-00; POIR.04.04.00-00-5E53 / 18-00) بتمويل مشترك من الاتحاد الأوروبي في إطار صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي ، تم منحه لعمل L.O و A.S. M.Z بدعم من OPUS (2018/31 / B / NZ3 / 01656) و Sonata Bis (2015/18 / E / NZ3 / 00501) من المركز الوطني للعلوم. تم دعم عمل A.S.W بمنحة Miniatura من المركز الوطني للعلوم (2019/03/X/NZ1/01439).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CM-Sepharose columnSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USACCF100
Heparin Sepharose columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-0407-01
HiTrap Desalting columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-100374Toxic
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA185884
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA646547

References

  1. Bethany, H. A new generation of antibody-drug conjugates for cancer patients. Chemical & Engineering News. 98 (14), (2020).
  2. Tu, C., et al. A Combination of structural and empirical analyses delineates the key contacts mediating stability and affinity increases in an optimized biotherapeutic single-chain Fv (scFv). Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1267-1276 (2016).
  3. Sokolowska-Wedzina, A., et al. High-affinity internalizing human scFv-Fc antibody for targeting FGFR1-overexpressing lung cancer. Molecular Cancer Research. 15 (8), 1040-1050 (2017).
  4. Seeger, M. A., et al. construction, and characterization of a second-generation DARPin library with reduced hydrophobicity. Protein Science. 22 (9), 1239-1257 (2013).
  5. Deyev, S., et al. Synthesis, characterization, and selective delivery of DARPin-gold nanoparticle conjugates to cancer cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (10), 2569-2574 (2017).
  6. Currier, N. V., et al. Targeted drug delivery with an integrin-binding Knottin-Fc-MMAF conjugate produced by cell-free protein synthesis. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (6), 1291-1300 (2016).
  7. Cox, N., Kintzing, J. R., Smith, M., Grant, G. A., Cochran, J. R. Integrin-targeting knottin peptide-drug conjugates are potent inhibitors of tumor cell proliferation. Angewandte Chemie International Edition. 55 (34), 9894-9897 (2016).
  8. Goldberg, S. D., et al. Engineering a targeted delivery platform using Centyrins. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 563-572 (2016).
  9. Altai, M., et al. Affibody-derived drug conjugates: Potent cytotoxic molecules for treatment of HER2 over-expressing tumors. Journal of Controlled Release. 288, 84-95 (2018).
  10. Sochaj-Gregorczyk, A. M., Serwotka-Suszczak, A. M., Otlewski, J. A Novel affibody-Auristatin E conjugate with a potent and selective activity against HER2+ cell lines. Journal of Immunotherapy. 39 (6), 223-232 (2016).
  11. Szlachcic, A., Zakrzewska, M., Lobocki, M., Jakimowicz, P., Otlewski, J. Design and characteristics of cytotoxic fibroblast growth factor 1 conjugate for fibroblast growth factor receptor-targeted cancer therapy. Drug Design, Development and Therapy. 10, 2547-2560 (2016).
  12. Krzyscik, M. A., Opaliński, &. #. 3. 2. 1. ;., Otlewski, J. Novel method for preparation of site-specific, stoichiometric-controlled dual warhead conjugate of FGF2 via dimerization employing sortase A-mediated ligation. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3588-3599 (2019).
  13. Hermanson, G. T. The Reactions of bioconjugation. Bioconjugate Techniques. , 229-258 (2013).
  14. Lobocki, M., et al. High-yield site-specific conjugation of fibroblast growth factor 1 with monomethylauristatin e via cysteine flanked by basic residues. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 1850-1858 (2017).
  15. Krzyscik, M. A., et al. Cytotoxic conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with monomethyl auristatin e for effective killing of cells expressing FGF receptors. ACS Omega. 2 (7), 3792-3805 (2017).
  16. Chen, I., Dorr, B. M., Liu, D. R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11399-11404 (2011).
  17. Weiner, E. M., Robson, S., Marohn, M., Clubb, R. T. The sortase A enzyme that attaches proteins to the cell wall of Bacillus anthracis contains an unusual active site architecture. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 23433-23443 (2010).
  18. Sokolowska-Wedzina, A., et al. Efficient production and purification of extracellular domain of human FGFR-Fc fusion proteins from Chinese hamster ovary cells. Protein Expression and Purification. 99, 50-57 (2014).
  19. Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85 (14), 2149-2154 (1963).
  20. Chen, Y. Drug-to-antibody ratio (DAR) by UV/Vis spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1045, 267-273 (2013).
  21. Falck, G., Müller, K. M. Enzyme-based labeling strategies for antibody-drug conjugates and antibody mimetics. Antibodies. 7 (1), 4 (2018).
  22. Shental-Bechor, D., Arviv, O., Hagai, T., Levy, Y. Folding of conjugated proteins. Annual Reports in Computational Chemistry. , 263-277 (2010).
  23. Bigman, L. S., Levy, Y. Entropy-enthalpy compensation in conjugated proteins. Chemical Physics. 514, 95-105 (2018).
  24. Danielsson, J., et al. Thermodynamics of protein destabilization in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (40), 12402-12407 (2015).
  25. Świderska, K. W., Szlachcic, A., Czyrek, A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific conjugation of fibroblast growth factor 2 (FGF2) based on incorporation of alkyne-reactive unnatural amino acid. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 25 (14), 3685-3693 (2017).
  26. Krzyscik, M. A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific, stoichiometric-controlled, PEGylated conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with hydrophilic auristatin Y for highly selective killing of cancer cells overproducing fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1). Molecular Pharmaceutics. 17 (7), 2734-2748 (2020).
  27. Borek, A., Sokolowska-Wedzina, A., Chodaczek, G., Otlewski, J. Generation of high-affinity, internalizing anti-FGFR2 single-chain variable antibody fragment fused with Fc for targeting gastrointestinal cancers. PLOS ONE. 13 (2), 0192194 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

A 2 G E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved