通过马来酰亚胺-硫醇化学和 Sortase A 介导的连接制备位点特异性细胞毒性蛋白偶联物

在这里，我们提供了使用马来酰亚胺 - 硫醇反应和分选酶 A 介导的连接用细胞毒性药物对蛋白质进行位点特异性标记的详细方案。

癌症目前是全球第二大最常见的死亡原因。癌细胞的标志是其表面存在特定的标记蛋白，例如生长因子受体。这一特性使高选择性治疗药物，即蛋白质生物偶联物的开发成为可能，该疗法由通过特定接头连接到高细胞毒性药物的靶向蛋白（抗体或受体配体）组成。由于靶向蛋白的亲和力和选择性非常高，生物偶联物可识别癌细胞表面的标记蛋白，并利用受体介导的内吞作用到达细胞内部。细胞内囊泡运输系统最终将生物偶联物递送到溶酶体，在那里蛋白水解将游离的细胞毒性药物与生物偶联物的蛋白核心分离，从而触发药物依赖性癌细胞死亡。目前，有几种蛋白质生物偶联物被批准用于癌症治疗，大量正在开发或临床试验中。

生物偶联物产生的主要挑战之一是细胞毒性药物与靶向蛋白的位点特异性附着。近年来，使用细胞毒性药物进行蛋白质修饰的化学和酶促策略的开发取得了巨大进展。在这里，我们介绍了使用采用马来酰亚胺-硫醇化学的化学方法和依赖于分选酶 A 介导的连接的酶促方法将细胞毒性弹头位点特异性掺入靶向蛋白质的详细方案。我们使用成纤维细胞生长因子 2 的工程变体和人免疫球蛋白 G 的片段可结晶区域作为示例靶向蛋白，使用单甲基 auristatin E 和甲氨蝶呤作为模型细胞毒性药物。所有描述的策略都允许高效生成具有明确分子结构的生物活性细胞毒性偶联物，并有可能选择性治疗多种癌症。

数十年的科学努力使我们对控制癌症发展和进展的分子机制的认识取得了巨大进步。同时，由于药物缺乏选择性引起的不良反应、肿瘤的巨大变异性和长期治疗后产生的耐药性，治疗可能性在很大程度上仍然受到限制。近年来，靶向抗癌疗法作为治疗多种肿瘤的新型且极具前景的方法而受到关注。靶向治疗依赖于复杂的药物递送系统，该系统将细胞毒性有效载荷精确地输送到癌细胞并避免健康细胞。这些主要包括各种纳米颗粒、脂质体和基于蛋白质的药物载体。

癌细胞通常会暴露出其表面特异性标记蛋白水平升高。抗体药物偶联物 （ADC） 是一种基于蛋白质的新型抗癌疗法，它将单克隆抗体的极高特异性和药物的高细胞毒性效力结合在一个分子中。一旦与癌细胞表面结合，ADC 就会利用受体介导的内吞作用进入细胞。随后，ADC 通过内体区室转运到溶酶体，在那里蛋白酶降解 ADC 并释放活性细胞毒性药物。目前，美国有 8 种 ADC 获批用于治疗多种肿瘤，包括三阴性乳腺癌、HER2 阳性乳腺癌、尿路上皮癌、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤、血液系统恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤和急性髓性白血病。大量 ADC 也正在开发中或等待批准¹。值得注意的是，蛋白质工程方法导致了单克隆抗体蛋白质支架及其细胞毒性偶联物的多样化替代品的开发。这些抗体片段包括不同的抗体片段 ^2,3、DARPins ^4,5、结点蛋白 ^6,7、centyrins⁸、亲和体 ^9,10 或工程化受体配体^11,12。

成功的基于蛋白质的细胞毒性偶联物必须满足几个关键要求，即偶联物的稳定性、非凡的特异性、偶联物对癌症特异性标志物的高亲和力、偶联物快速内化到癌细胞内部、其向溶酶体的有效运输以及活性有效载荷的有效细胞内释放。另一个重要特征是偶联物均一性，这在很大程度上取决于将有效载荷连接到靶向蛋白的应用策略。有几种方法可用于蛋白质与细胞毒性药物的位点特异性偶联，例如蛋白质侧链半胱氨酸或赖氨酸残基的修饰、药物与掺入靶向蛋白质中的非天然氨基酸的结合，或靶向蛋白质的酶促修饰（例如，使用转谷氨酰胺酶、糖基转移酶、甲酰甘氨酸生成酶、分选酶 A）。在大多数情况下，位点特异性偶联方法需要修饰靶向分子（例如，通过半胱氨酸工程或引入短肽标签），但反过来又可以高效产生目标的均相偶联物。

在这里，我们提供了靶向蛋白与细胞毒性药物的高效位点特异性偶联方案。作为示例蛋白，我们使用了两种不同的分子：人 IgG 的可结晶片段 （Fc） 和人成纤维细胞生长因子 2 （FGF2） 的工程变体。Fc 片段是典型 ADC 的组成部分，但它也存在于其他类型的偶联物中，如细胞毒性肽体或抗体片段的偶联物。FGF2 是一种天然成纤维细胞生长因子受体 （FGFR） 配体，已成功经过工程改造，可产生靶向 FGFR 过量产生的癌细胞的选择性细胞毒性偶联物。

我们提出了两种不同的偶联策略，允许细胞毒性药物的位点特异性掺入。首先，提供了基于 Hermanson 方案¹³ 的通过马来酰亚胺-硫醇化学与 Fc 片段的半胱氨酸侧链偶联的方案（图 1A、B）。在该方案中，两个二硫键最初用三（2-羧乙基）膦 （TCEP） 还原，并且所得的游离巯基通过马来酰亚胺 - 硫醇化学与单甲基澳瑞他汀 E （MMAE） 偶联（图 1B）。由于恒定的重链结构域 2 和 3 （CH2 和 CH3） 之间的相互作用，药物连接的 Fc 的二聚体结构得以保留。其次，提出了产生双弹头 FGF2 偶联物的策略，该策略结合了半胱氨酸工程和分选酶 A 介导的连接，以位点特异性方式将两种不同的药物掺入 FGF2 中（图 1A，C）。使用带有额外 N 端 KCKSGG 的无半胱氨酸变体，具有单个暴露的半胱氨酸残基和 C 端 LPETGG 短肽标签¹²。马来酰亚胺-硫醇反应允许 MMAE 与我们小组设计的 KCKSSG 接头内的半胱氨酸偶联^14,15。Sortase A 依赖性步骤（基于 Chen 等人）¹⁶ 介导甲氨蝶呤 （MTX） 连接的四甘氨酸肽 GGGG-MTX 与 C 端 LPETGG 序列的连接，产生两种类型的单弹头偶联物（图 1C）。Sortase A 是一种半胱氨酸蛋白酶，可催化 LPETGG 和 GGGG 基序之间的转肽反应。酶与蛋白质 C 端的 LPETGG 基序结合，然后苏氨酸和甘氨酸之间的酰胺键被水解，形成酶-底物复合物。下一步是硫酯酶-底物键的氨解，其中伯氨基的供体是四甘氨酸基序的甘氨酸残基¹⁷。这两种方法的组合产生位点特异性 FGF2 双弹头偶联物（图 1C）。原则上，所提供的偶联方案可以成功地应用于任何感兴趣的工程靶向蛋白，以产生选择性细胞毒性偶联物。此外，该方法的多功能性使其适用于许多其他蛋白质-蛋白质和蛋白质-肽连接目的，以及脂质、聚合物、核酸和荧光团与具有可用巯基（或通过还原天然二硫键产生）和/或具有引入的小肽标签的蛋白质。

1. Fc 结构域与 MMAE 的偶联

注：在位点特异性偶联之前，准备关键试剂：高纯度目标蛋白（在本例中为 Fc 片段和工程化 FGF2 变体，作为起点 1-5 mg 重组蛋白，根据 Sokolowska-Wedzina¹⁸ 制备）、马来酰亚胺草酰-Val-Cit-对氨基苯甲醇 （PABC）-单甲基澳瑞他汀 E （MMAE）（CAUTION，高度细胞毒性试剂，小心处理）、Tris（2-羧乙基）膦 （TCEP） 和分选酶 A¹⁶.与四甘氨酸肽 （GGGG-MTX） 相连的甲氨蝶呤（注意，MTX 是一种高度细胞毒性的试剂，请小心处理）可以根据 Fmoc 策略¹⁹ 中的固相肽合成 （SPPS） 方法在固体支持相上合成，也可以从商业来源获得。

1. 为了减少Fc片段内的二硫键（图1），在PBS（100mM NaCl，18mM NaH，18mM NaH₂PO 4,33mM Na₂HPO₄ pH 7.4）中，在Fc蛋白（39μM）上加入十倍摩尔过量的TCEP，并在37°C下孵育1小时。TCEP储备溶液应用0.1M NaOH调节pH至6.0， 以防止蛋白质因 pH 值变化而沉淀。
2. 孵育后，使用 0.2 μm 过滤器过滤还原的蛋白质以去除蛋白质沉淀物。
3. 向新的反应管中，在蛋白质-SH基团上加入第一个四倍摩尔过量的MMAE（将MMAE溶解在 N，N-二甲基乙酰胺（DMAc）中，以制备40mM储备溶液）。然后加入与 Fc 蛋白体积相比双倍体积的 PBS 缓冲液。最后添加步骤 1.2 中还原的 Fc 片段。
   注：在此步骤中，试剂添加顺序很重要。
4. 在 15 °C 下轻轻旋转过夜进行偶联反应。这些温和的条件会阻止蛋白质变性。
5. 使用 0.2 μm 过滤器过滤含有偶联物的溶液，以去除潜在的沉淀物。
6. 进行 SDS-PAGE 以分析反应效率。使用 10% 分离凝胶、10 – 250 kDa 蛋白质标记物，并分析 35 至 50 kDa 之间的条带（图 2）。
   注：该方案可以在此处暂停，反应混合物可在 4 °C 下短期储存，或在 -80 °C 下长期储存。然而，冻融会导致额外的沉淀并降低偶联物纯化的产量。
7. 将反应混合物加载到带有蛋白质 A 偶联珠子的色谱柱上，并用含有 300 mM NaCl、18 mM NaH₂、PO₄、33 mM、Na₂、HPO₄、0.1% Tween 20、2 mM EDTA pH 7.4 的洗涤缓冲液 1 洗去过量的 MMAE。然后使用洗涤缓冲液 2 和 650 mM NaCl、18 mM NaH₂PO₄、33 mM Na₂HPO₄（pH 7.4）洗涤色谱柱。
   注：通过偶联物的 Fc 区与磁珠上的蛋白 A 的选择性相互作用，偶联物被捕获在色谱柱上，而未反应的 MMAE 被洗掉。此步骤对于获得高纯度偶联物是必要的。
8. 用 0.1 M 柠檬酸钠 pH 3.5 至 1.5 mL 管（含 1 M Tris pH 9.0）（1 mL 蛋白质至 200 μL 1 M Tris pH 9.0）的试管从色谱柱上洗脱 Fc-MMAE 偶联物。
9. 使用含有 Sephadex G-25 填料的色谱柱将 Fc-MMAE 脱盐至 PBS pH 7.4。此步骤可防止偶联物变性，并允许偶联物用于体外和体内测试。
   注意：协议可以在此处暂停。
10. 进行 SDS-PAGE （10%） 以分析最终的 Fc-MMAE 偶联物。使用 10% 分离凝胶、10 – 250 kDa 蛋白质标记物，并分析 35 至 50 kDa 之间的条带（图 2）。

2. 工程化 FGF2 的偶联

1. GGGG-MTX 通过分选酶 A 介导的连接与工程化 FGF2 的 C 端 LPETGG 序列偶联
   1. 使用含有 G-25 填料的色谱柱，将含有 N 端 KCKSGG 和 C 端 LPETGG 序列（在此步骤中用于偶联）的纯化工程化 FGF2 转移到分选酶 A 反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM （NH₄）₂SO₄、5 mM CaCl₂）中。用分选酶 A 反应缓冲液将蛋白质浓度调节至 1 μM。
   2. 将溶解在 DMAc 中的 GGGG-MTX 肽直接加入蛋白质溶液中，至终浓度为 100 μM。
   3. 加入分选酶 A 至终浓度为 0.1 μM，并在 15 °C 下轻轻旋转孵育 12 小时。步骤 2.1.1-2.1.3 中使用的试剂浓度在很大程度上取决于要达到的偶联物的产量和目标蛋白的生化特性（蛋白质纯化效果、溶解度和稳定性）。为了获得有效的分选酶 A 反应，使用比含 LPETGG 的靶蛋白低 10 倍到 100 倍的分选酶 A 浓度，比 LPETGG 标签蛋白低 100 倍的 GGGG-MTX 浓度的起点。
   4. 将反应混合物加载到肝素琼脂糖柱上。
   5. 用 25 mM HEPES pH 7.4 洗去未反应的分子。
   6. 洗脱反应产物 （FGF2.MTX） 和 25 mM HEPES pH 7.4 和 2 M NaCl。
      注意：协议可以在此处暂停。
   7. 使用 SDS-PAGE 分析偶联效率。使用 15% 分离凝胶、10 – 250 kDa 蛋白质标记物，并分析 15 至 25 kDa 之间的条带（图 3）。
2. MMAE 通过马来酰亚胺-硫醇反应与工程化 FGF2 的 N 端 KCKSGG 序列偶联
   1. 使用含有 Sephadex G-25 填料的色谱柱，将含有 N 端 KCKSGG 和 C 端 LPETGG 序列的 FGF2 脱盐到反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.0、10 mM （NH₄）₂SO₄、10 mM 蛋氨酸、0.1 mM EDTA）中。用反应缓冲液将蛋白质浓度调节至 25 μM。
   2. 将 MMAE 溶解在 DMAc 中以制备 40 mM 储备液。
   3. 向新的反应管中，在蛋白质-SH基团上加入第一个四倍摩尔过量的MMAE。然后加入与 FGF2 蛋白体积相关的双倍体积的 PBS 缓冲液。最后添加 FGF2 蛋白。
      注：在此步骤中，试剂添加的顺序很重要。
   4. 在 20 °C 下轻轻旋转反应 1 小时。
   5. 将反应混合物加载到羧甲基 （CM）-琼脂糖凝胶柱上，并用 25 mM HEPES pH 7.4 洗去过量的未偶联细胞毒剂。这些温和的条件会阻止蛋白质变性。
   6. 洗脱 MMAE。FGF2 偶联物来自色谱柱，与 25 mM HEPES （pH 7.4） 和 0.5 M NaCl 偶联物。
      注意：协议可以在此处暂停。
   7. 使用 SDS-PAGE 分析偶联效率。使用 15% 分离凝胶、10 – 250 kDa 蛋白质标记物，并分析 15 至 25 kDa 之间的条带（图 3）。
3. 使用马来酰亚胺-硫醇化学和分选酶 A 介导的连接制备内嵌 FGF2 的双弹头偶联物
   注：为了生成工程化 FGF2 的双弹头偶联物，步骤 2.1 和 2.2 相结合。第一个 MMAE。FGF2 偶联物通过马来酰亚胺-硫醇化学（步骤 2.2）产生，用于将带有分选酶 A 的 GGGG-MTX 连接到 MMAE 的 C 末端 LPETGG 标签上。FGF2（步骤 2.1）。此外，反向程序也是可能的（首先分选酶 A 介导的偶联，然后是马来酰亚胺-硫醇反应）。
   1. 使用步骤 2.2.1-2.2.7 制备单取代 MMAE。FGF2 偶联物。
   2. 使用含有 Sephadex G-25 填料的色谱柱，将缓冲液更换为分选酶 A 反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM （NH₄）₂SO₄、5 mM CaCl₂）。
   3. 按照 2.1.2-2.1.7 中的说明继续作。

所提出的方案描述了将不同细胞毒性药物偶联成目标蛋白质的两种不同策略。此外，显示了单个策略的组合，允许以位点特异性方式生成双弹头细胞毒性偶联物。

如图 2 中 SDS-PAGE 凝胶所示（泳道 2 与 3），马来酰亚胺-硫醇反应允许 MMAE 与 Fc 片段的偶联达到几乎 100% 的效率（由于 MMAE 掺入导致分子量增加，显示为 Fc 带的偏移）?...

由于人们对针对不同癌症类型的选择性疗法设计高度感兴趣，因此迫切需要允许将不同货物位点特异性连接到靶向蛋白的策略。靶向蛋白的位点特异性修饰至关重要，因为它确保了开发的生物活性偶联物的均一性，这是现代疗法的先决条件。有几种方法，包括化学和酶法，允许将货物特异性地附着到所选蛋白质上。在大多数情况下，这些方法需要在生成目标偶联物之前进...

作者没有什么可披露的。

这项工作得到了 First TEAM 和波兰科学基金会重返社会计划（POIR.04.04.00-00-43B2/17-00;POIR.04.04.00-00-5E53/18-00）由欧盟在欧洲区域发展基金下共同资助，授予 LO 和 ASMZ 工作得到了 OPUS （2018/31/B/NZ3/01656） 和 Sonata Bis （2015/18/E/NZ3/00501） 的支持来自国家科学中心。ASW 工作得到了美国国家科学中心 （2019/03/X/NZ1/01439） 的 Miniatura 资助。