Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat

Cette étude fournit une méthode efficace et stable pour obtenir suffisamment de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de mâchoire de haute qualité avec une forte capacité de différenciation en peu de temps. La méthode basée sur une niche peut être appliquée dans l’isolement des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse du rat. Notre étude a réussi à isoler des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire de haute pureté, offrant une source de cellules substantielle pour l’ingénierie du tissu osseux de la mâchoire, en particulier dans le contexte de la réparation des défauts osseux.

Ces avancées sont très prometteuses pour le domaine. Pour commencer, extrayez la mandibule d’un rat euthanasié. Positionnez le bec des rongeurs à la jonction des incisives de la mandibule d’un rat extrait et de la première molaire.

Coupez la connexion entre les incisives inférieures et la mandibule, puis extrayez complètement les incisives inférieures. Retirez toutes les molaires, puis la branche mandibulaire. Séparez maintenant la partie centrale de la mandibule le long du bord distal de la dernière molaire et exposez la cavité médullaire.

Ensuite, remplissez une seringue jetable d’un millilitre avec du milieu complet alpha MEM. Insérez l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse. Rincez la moelle osseuse à plusieurs reprises dans une boîte de culture contenant un milieu complet alpha MEM jusqu’à ce que l’os devienne blanc.

Transférez la solution rincée dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifuger la solution à 800 G pendant trois minutes à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, pipetez le surnageant, puis ajoutez 10 millilitres de milieu complet alpha MEM dans le tube.

Remettez la pastille en suspension dans le milieu et transférez la suspension dans une nouvelle boîte de culture de 10 centimètres de large. Utilisez maintenant un rongeur à os pour diviser la mandibule rincée en tranches d’os. Transférez les tranches d’os dans un tube contenant trois millilitres de solution de collagénase de type II à 0,1 %.

Placez le mélange de tranches d’os dans un shaker pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Une fois l’incubation terminée, centrifuger la mandibule digérée à 800 G pendant trois minutes à température ambiante. Pipetez le surnageant pour le jeter, puis transférez les cellules récoltées et les tranches d’os digérées dans des plaques contenant 10 millilitres de milieu complet alpha MEM.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 %. Après 72 heures, remplacez la moitié du milieu de culture par un milieu frais. Lorsque les cellules adhérentes sont confluentes à 80 à 90 %, faites-les passer dans un rapport de un à deux.

Retirez les tranches d’os lors de la deuxième sous-culture. Après 72 heures de culture, la plupart des cellules étaient suspendues et rondes, quelques-unes adhérant à la paroi. Des colonies adhérentes qui étaient fusiformes ou ressemblant à des fibroblastes sont apparues après cinq jours de culture.

Les cellules adhérentes ont atteint 90 % de confluence au septième jour et ont formé une forme de banc de poissons. Les cellules traversées présentaient une homogénéité, étaient principalement en forme de fuseau et dans un motif semblable à un vortex après la confluence.