Ce protocole décrit un test cellulaire pour la surveillance de l’efficacité de l’épissage, à l’aide d’un rapporteur de gestion adaptable. Ce test rapporteur peut être utilisé pour étudier les effets des mutations associées à la maladie dans les sites Exxon ou d’épissure, et pour concevoir une thérapie, en particulier une particule, afin d’améliorer la reconnaissance des sites d’épissure mutants à cinq points. Le passage dans les cellules Hela aspire le milieu usé et incube les cellules avec trois millilitres de 0,2 5% trébuche en contenant un millimolaire EDTA, à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.
Après incubation à sept millilitres de DMEM frais et transfert de la suspension cellulaire dans un tube de 10 millilitres. Centrifuger les cellules. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de DMEM frais et plaquez les cellules sur une nouvelle boîte de culture tissulaire à 20% de confluence, pour une transsfection transitoire.
Comptez les cellules hela avec une lame d’hémo cytomètre propre et préparez une suspension d’une densité de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, ensemencez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 12 puits et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirer le milieu usé et ajouter 800 microlitres de DMEM frais avec du sérum dans l’assiette. Préparez les mélanges de transfection et vortexez-les pendant 15 secondes.
Ensuite, centrifugez les mélanges et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez les 200 microlitres du mélange de transfection dans un puits de la plaque cellulaire hela de 12 puits pour obtenir un volume final d’un millilitre par puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Les réactions d’étiquetage préparées sont en incubation.
Remettez en suspension les billes d’exclusion de taille de coupure de poids moléculaire Dalton de 25 kilos en vortexant doucement pendant 10 secondes. Ensuite, transférez 600 microlitres des perles remises en suspension dans une mini colonne jetable, placée dans un tube de collecte de 1,5 millilitre, et retournez le stock de perles à quatre degrés Celsius. Centrifugez la colonne et jetez le flux à travers eux.
Ensuite, lavez les perles deux fois en ajoutant 300 microlitres d’eau sans ARN à la colonne. Après le deuxième lavage, transférer la mini colonne dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter le mélange de réaction kinase à la colonne. Centrifuger la colonne et recueillir l’écoulement contenant les oligonucléotides marqués P32.
Ajouter deux microgrammes d’ARN extraits des cellules hélicoïdales dans des tubes de microcentrifugation de 200 microlitres et ajouter de l’eau sans ARN pour augmenter le volume à 6,55 microlitres. Ensuite, ajoutez 0,9 microlitre à un mélange maître à chaque tube pcR contenant les échantillons d’ARN, et incubez les tubes d’abord à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant une minute. Ensuite, à 2,55 microlitres, un maître mélange deux, à chaque tube contenant l’ARN et un mélange maître, et incubez les tubes à température ambiante pendant 10 minutes.
Après l’incubation, transférez les tubes dans un cycleur thermique et incubez d’abord à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes, puis à 70 degrés Celsius, pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez 10 microlitres de colorant de chargement d’ARN formamide 2X à chaque échantillon et procédez à la séparation des fragments par page UIA. Synthèse de l’ADN de Percy.
Ajouter deux microgrammes d’ARN extraits des cellules hela transectées, dans des tubes de 200 microlitres de microncentrifuge et ajouter de l’eau libre d’ARN pour composer le volume à un faible 11 microlitres. Ensuite, ajoutez deux microlitres, un mélange principal à chaque échantillon et incubez d’abord à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant une minute. Ensuite, ajoutez sept microlitres, un mélange maître deux à chaque tube et incubez les tubes à température ambiante pendant 10 minutes, suivis d’une incubation à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes et à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Ensuite, pour la PCR, diluez la réaction d’ADN C pour obtenir une concentration de 100 nanogrammes par microlitre et transférez un microlitre de chaque échantillon de CDNA dans de nouveaux tubes de PCR. Ajoutez 10,5 microlitres du mélange maître à chaque tube contenant du CDNA et effectuez la PCR. Utilisation d’un thermocycleur Une fois la PCR terminée.
Ajouter 12,5 microlitres de colorant de charge d’ADN formamide 2X à chaque tube. Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes et procédez à l’exécution d’une page UIA. Pipette cinq microlitres de CDNA dilué dans des puits individuels d’une plaque qpcr de 96 puits triplicate.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres de mélange PCR en temps réel à chaque puits, scellez les plaques avec un film optique et centrifugez pour recueillir les réactions au fond des puits, puis effectuez le qpcr tout en collectant les valeurs du cycle de quantification seuil de l’amplicon cible. Avant de charger les marqueurs et les échantillons, videz les puits avec un tampon TBE pour éliminer l’urée décantée. Chargez ensuite 10 microlitres de chaque échantillon par puits et faites fonctionner le gel à 300 à 500 volts pendant deux à trois heures, ou jusqu’à ce que le xylène atteigne le fond.
Après l’électrophorèse, retirez les plaques de verre de l’appareil d’électrophorèse et séparez soigneusement les deux plaques de sorte que le gel repose à plat sur l’une ou l’autre surface de verre, puis transférez le gel sur un papier filtre et recouvrez-le d’une pellicule plastique, à l’aide d’un séchoir à gel, séchez le gel sous vide à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis placez le gel séché dans une cassette d’imagerie au phosphore pour une incubation nocturne à température ambiante. Lorsqu’il est exprimé dans des cellules hela, le rapporteur de tranchage dup 51 minnijean exprime la transcription complète mature dans laquelle Exxon two est épissé efficacement. Les cinq mutations du site d’épissure premier et dup 51 P réduisent l’inclusion de deux Exxon de 95 à 30%, ce qui conduit à la formation d’un transcrit plus court.
La co-expression de dup 51 P avec L’ARNN U15A sauve Exxon de deux épissages et restaure la formation de la transcription complète. En revanche, la co-expression avec la variante de type sauvage U1 ou U15G n’a pas le même effet sur l’épissage dup 51P. La détection des transcriptions de la variante U15A, par extension primaire, utilise l’oligonucléotide U1 sept à 26, qui est constitué de 20 nucléotides de longues paires de bases près de l’adénine à la cinquième position de l’ARNN U1.
En présence de DATP seul, U1 sept à 26 permet d’incorporer deux à trois nucléotides pour l’ARNNS sauvage endogène de type U1 donnant un produit long de 22 ou 23 nucléotides. Pour les variantes U15A et U15G, l’extension se termine après l’ajout d’une seule adénosine produisant un produit à 21 nucléotides. Après normalisation à l’expression de l’ARNN U2, les variantes U1 de type sauvage U1 5g et U15A transfectées ont été exprimées de trois à cinq fois sur l’ARNN endogène.
La qualité de l’ARN extrait est essentielle pour l’analyse de l’épissage. Par conséquent, l’utilisation d’eau sans ARN et la décontamination des services avec des ARN inactivent les agents sont fortement recommandées. Le système de rapport décrit ici peut être appliqué pour étudier le rôle des ARN U1 SN dans les réglementations d’épissage pour inverser l’effet des mutations d’épissage à prix flash pour le silençage génique à l’aide d’ARN U1SN modifiés.
