Questo protocollo descrive un test cellulare per il monitoraggio dell'efficienza di splicing, utilizzando un reporter di gestione adattabile. Questo reporter Assay può essere utilizzato per studiare gli effetti delle mutazioni associate alla malattia nei siti Exxon o di giunzione e per progettare la terapia, in particolare una particella, per migliorare il riconoscimento dei siti di giunzione mutanti a cinque punti. Il passaggio nelle cellule Hela aspira il mezzo esaurito e incuba le cellule con tre millilitri di 0,2 viaggi del 5% in contenenti un EDTA millimolare, a 37 gradi Celsius per tre minuti.
Dopo l'incubazione a sette millilitri di DMEM fresco e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 10 millilitri. Centrifugare le cellule. Quindi risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM fresco e placcare le cellule su un nuovo piatto di coltura tissutale al 20% di confluenza, per la trasfezione transitoria.
Contare le cellule hela con un vetrino emocitometrico pulito e preparare una sospensione con una densità di 2,5 volte 10 alla quinta cellula per millilitro, seminare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 12 pozzetti e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente aspirare il mezzo esaurito e aggiungere 800 microlitri di DMEM fresco con siero al piatto. Preparare le miscele di trasfezione e vortexle per 15 secondi.
Quindi centrifugare le miscele e incubarle a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l'incubazione aggiungere tutti i 200 microlitri della miscela di trasfezione in un pozzetto della piastra di cellule hela a 12 pozzetti per ottenere un volume finale di un millilitro per pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 48 ore. Le reazioni di etichettatura preparate sono in incubazione.
Sospendere le perle di esclusione delle dimensioni di taglio del peso molecolare Dalton da 25 chili con un delicato vortice per 10 secondi. Successivamente trasferire 600 microlitri delle perline risospese su una mini colonna usa e getta, collocata in un tubo di raccolta da 1,5 millilitri, e riportare lo stock di perline a quattro gradi Celsius. Centrifugare la colonna e scartare il flusso attraverso di esse.
Quindi lavare le perline due volte aggiungendo 300 microlitri di acqua priva di RNA alla colonna. Dopo il secondo lavaggio, trasferire la mini colonna in un nuovo tubo centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere la miscela di reazione chinasica alla colonna. Centrifugare la colonna e raccogliere il flusso attraverso la presenza degli oligonucleotidi marcati P32.
Aggiungere due microgrammi di RNA estratto dalle elicellule in tubi microcentrifughe da 200 microlitri e aggiungere acqua priva di RNA per aumentare il volume a 6,55 microlitri. Quindi aggiungere 0,9 microlitri, un master mix uno per ogni tubo PCR contenente i campioni di RNA e incubare i tubi prima a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi sul ghiaccio per un minuto. Successivamente a 2,55 microlitri, un master mix due, per ogni tubo contenente l'RNA e master mix uno, e incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti.
Dopo l'incubazione trasferire i tubi a un termociclatore e incubare prima a 50 gradi Celsius per 60 minuti, e poi a 70 gradi Celsius, per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di colorante di caricamento 2X formamide RNA a ciascun campione e procedere a separare i frammenti per pagina UIA. Sintesi del DNA di Percy.
Aggiungere due microgrammi di RNA estratti dalle cellule hela transettate, in tubi microncentrifuga da 200 microlitri e aggiungere acqua priva di RNA per aumentare il volume a un basso 11 microlitri. Quindi, aggiungere due microlitri, un master mix uno per ogni campione e incubare prima a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi sul ghiaccio per un minuto. Quindi, aggiungere sette microlitri, un master mix due per ogni tubo e incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti, seguiti da incubazione a 50 gradi Celsius per 60 minuti e 70 gradi Celsius per 15 minuti.
Successivamente, per la PCR diluire la reazione del DNA C per produrre una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro e trasferire un microlitro di ciascun campione CDNA a nuovi tubi PCR. Aggiungere 10,5 microlitri del mix master a ciascun tubo contenente CDNA ed eseguire la PCR. Utilizzo di un termociclatore Al termine della PCR.
Aggiungere 12,5 microlitri di colorante di caricamento del DNA 2X di formammide a ciascun tubo. Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti e procedere con l'esecuzione di una pagina UIA. Pipettare cinque microlitri di CDNA diluito in singoli pozzi di un triplicato di piastra qpcr a 96 pozzetti.
Quindi aggiungere 10 microlitri di miscela PCR in tempo reale a ciascun pozzo, sigillare le piastre con un film ottico e centrifugare per raccogliere le reazioni sul fondo dei pozzi, quindi eseguire il qpcr mentre si raccolgono i valori del ciclo di quantificazione di soglia dell'amplicon target. Prima di caricare i marcatori e i campioni, sciacquare i pozzetti con il tampone TBE per rimuovere l'urea stabilizzata. Quindi caricare 10 microlitri di ciascun campione per pozzetto ed eseguire il gel a 300-500 volt per due o tre ore o fino a quando lo xilene raggiunge il fondo.
Dopo l'elettroforesi rimuovere le lastre di vetro dall'apparecchio di elettroforesi e separare accuratamente le due piastre in modo che il gel si trovi piatto su entrambe le superfici di vetro, quindi trasferire il gel su una carta da filtro e coprirlo con un involucro di plastica, utilizzando un essiccatore di gel asciugare sottovuoto il gel a 80 gradi Celsius per 30 minuti, quindi posizionare il gel essiccato in una cassetta di imaging al fosforo per l'incubazione notturna a temperatura ambiente. Quando espresso in celle hela, il reporter di affettamento dup 51 minnijean esprime la trascrizione matura a figura intera in cui Exxon due è giuntato in modo efficiente. Le cinque mutazioni principali del sito di giunzione e dup 51 P riducono l'inclusione di Exxon due dal 95 al 30%, portando alla formazione di un trascritto più breve.
La co-espressione di dup 51 P con U15A SNRNA salva Exxon due splicing e ripristina la formazione del trascritto a lunghezza intera. Al contrario, la co-espressione con la variante wild type U1 o U15G non ha l'effetto simile sullo splicing dup 51P. Il rilevamento di trascritti di varianti U15A, per estensione primaria, utilizza l'oligonunzido U1 da sette a 26, che è lungo 20 nucleotidi e coppie di basi vicino all'adenina nella quinta posizione di U1 SNRNA.
In presenza del solo DATP, U1 da sette a 26 consente di incorporare da due a tre nucleotidi per l'SNRNA U1 di tipo selvaggio endogeno producendo un prodotto lungo 22 o 23 nucleotidi. Per le varianti U15A e U15G l'estensione termina dopo l'aggiunta di una singola adenosina che produce un prodotto a 21 nucleotidi. Dopo la normalizzazione all'espressione di U2 SNRNA, le varianti U1 5g e U15A trasfettate di tipo U1 wild-type sono state espresse da tre a cinque volte rispetto allo SNRNA endogeno.
La qualità dell'RNA estratto è fondamentale per l'analisi dello splicing. Pertanto, l'uso di acqua priva di RNA e la decontaminazione dei servizi con agenti inattivanti RNA è altamente raccomandato. Il sistema di report qui descritto può essere applicato per studiare il ruolo degli RNA SN U1 nei regolamenti di splicing per invertire l'effetto delle mutazioni di splicing del prezzo flash per il silenziamento genico utilizzando RNA U1SN modificati.
