L’objectif global de ce protocole est de fournir des conseils détaillés pour utiliser le minigène E1A2 pour évaluer les changements globaux d’épissage de l’ARNm. Il s’agit d’un outil rapide, peu coûteux et simple pour évaluer la fonction de la protéine cible dans la régulation alternative de l’épissage sans avoir besoin de régimes spéciaux ou de conditions de laboratoire. Commencez par la culture de cellules HEK 293 avec une expression stable du gène d’intérêt.
Divisez les cellules à l’aide de 0,25% de trypsine EDTA, puis plaquez 300 000 cellules par puits dans des plaques de six puits et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, vérifiez la confluence et transfectez les cellules stables HEK 293 uniquement lorsque 70 à 80% confluent. Retirez soigneusement le milieu de culture cellulaire avec une pipette, puis ajoutez deux millilitres de milieu DMEM complet sans antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur.
Préparez un tube avec le tampon de transfection, puis ajoutez deux microgrammes d’ADN pMTE1A, de vortex et ajoutez deux microlitres de réactif de transfection. Vortex à nouveau et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez soigneusement le mélange de transfection goutte à goutte.
Six heures après la transfection, ajouter de la tétracycline aux cellules stables HEK 293 pour l’induction de l’expression Nek4. 24 heures après la transfection, vérifier la morphologie cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope fluorescent. Utilisez une pipette pour enlever le milieu de culture cellulaire, puis ajoutez le milieu de culture cellulaire avec les produits chimiothérapeutiques.
Incuber les cellules pendant encore 24 heures. Pour recueillir l’ARN, jetez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 0,5 à 1 millilitre de réactif d’extraction de l’ARN directement au puits. Si les puits sont très confluents, utilisez un millilitre de réactif d’extraction d’ARN pour améliorer la qualité de l’ARN.
Homogénéiser les cellules avec une pipette et les transférer dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre. Passez immédiatement à l’extraction de l’ARN ou stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les échantillons dans une hotte et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ajouter 0,1 à 0,2 millilitres de chloroforme et agiter vigoureusement, puis incuber pendant trois minutes à température ambiante. Centrifuger pendant 15 minutes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius, puis recueillir la phase aqueuse supérieure et la transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Recueillir environ 60% du volume total, mais ne pas recueillir l’ADN ou la phase organique.
Ajouter 0,25 à 0,5 millilitres d’isopropanol et agiter l’échantillon par inversion quatre fois. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Lavez la pastille d’ARN deux fois avec de l’éthanol et centrifugez à 7 500 fois G pendant cinq minutes, puis jetez l’éthanol.
Retirez l’excès d’éthanol en inversant le tube sur une serviette en papier, puis laissez le tube ouvert à l’intérieur d’une hotte pour sécher partiellement le culot pendant cinq à 10 minutes. Re-suspendre la pastille d’ARN dans 15 microlitres d’eau traitée par DEPC. Quantifier l’ARN total et vérifier la qualité de l’ARN en mesurant l’absorbance à 230, 260 et 280 nanomètres.
Pour vérifier la qualité totale de l’ARN, faire fonctionner un gel d’agarose à 1% prétraité avec 1,2% d’une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5% pendant 30 minutes. Effectuer la synthèse de l’ADNc en utilisant un à deux microgrammes d’ARN total. Combiner l’ARN, une microlitres d’oligo d-T, une microlitres de DNTP et de l’eau sans nucléase en 12 microlitres.
Incuber la réaction dans le Thermo Cycler pendant cinq minutes à 65 degrés Celsius. Prélever des échantillons du Thermo Cycler et ajouter quatre microlitres de tampon de transcriptase inverse, deux microlitres de TNT et un microlitres d’inhibiteur de la ribonucléase. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.
Ajouter une microlitres de transcriptase inverse thermo-stable et incuber à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Inactiver l’enzyme à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Effectuez la PCR comme décrit dans le manuscrit de texte, puis chargez 20 à 25 microlitres du produit PCR sur un gel d’agarose à 3% contenant une coloration d’acide nucléique, et exécutez à 100 volts pendant environ une heure.
Photographiez le gel, en évitant toute saturation de bande, et quantifiez les bandes à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Les bandes à 631, 493, et 156 paires de bases correspondent aux isoformes 13S, 12S, et 9S respectivement. Dans le menu Fichier du logiciel, ouvrez le fichier image et convertissez-le en échelle de gris.
Réglez la luminosité et le contraste, puis supprimez le bruit aberrant si nécessaire. Dessinez un rectangle autour de la première voie à l’aide de l’outil de sélection de rectangle et sélectionnez-le à l’aide de la commande Analyser, Gels et Sélectionner la première voie ou à l’aide du raccourci clavier. Utilisez la souris pour cliquer et maintenir au milieu du rectangle sur la première voie, puis faites-la glisser vers la voie suivante.
Accédez à Analyser, Gels et Sélectionnez Next Lane. Répétez cette étape pour toutes les voies restantes. Une fois que toutes les voies sont mises en évidence et numérotées, accédez à Analyser, Gels et Tracer les voies pour dessiner un diagramme de profil de chaque voie.
Utilisez l’outil de sélection de ligne droite pour tracer une ligne à travers la base de chaque pic, correspondant à chaque bande, en omettant le bruit de fond. Une fois que tous les pics de chaque voie ont été fermés, sélectionnez l’outil baguette et cliquez à l’intérieur de chaque pic. Les mesures doivent apparaître dans la fenêtre de résultats pour chaque pic mis en surbrillance.
Considérez uniquement les pics 13S, 12S et 9S correspondant aux bandes de paires de bases 631, 493 et 156. Copiez les données d’intensité pour un éditeur de feuille de calcul et additionnez l’intensité des trois canaux pour chaque échantillon, puis calculez le pourcentage pour chaque isoforme par rapport au total. Tracer les pourcentages de chaque isoforme ou les différences dans le pourcentage par rapport aux échantillons non traités.
Un plasmide contenant le minigène d’E1A a été utilisé pour observer l’effet sur l’épissage alternatif en évaluant la proportion d’ARNm de chaque isoforme produite. L’expression basique des variantes d’isoforms d’E1A a dépendu de la variété de cellule et du temps de l’expression d’E1A. La variété de cellule stable HEK 293, ou la recombinase HEK 293 contenant l’emplacement, a montré une expression plus élevée de 13S par rapport aux cellules de HeLa, mais a montré les niveaux semblables des isoforms 13S et 12S après 48 heures d’expression d’E1A.
Les cellules exposées au cisplatin ont montré un décalage de cinq sélection de épissure S-S de premier choix favorisant l’expression 12S. Cet effet a été observé dans HEK 293 exprimant de manière stable le vecteur vide Flag, ainsi que l’isoforme de Nek4. Les changements dans l’épissage alternatif après traitement de paclitaxel étaient très discrets, mais les directions des changements étaient opposées dans les cellules exprimant Flag et Nek4.
Lors de l’exécution de ce protocole, il est important d’utiliser des contrôles de transcriptase non traduits et non inversés pour éviter une mauvaise interprétation avec l’expression endogène d’E1A, principalement lors de l’utilisation de cellules HEK 293. Après avoir obtenu des résultats positifs, l’épissage alternatif de gènes spécifiques liés à la réponse chimiothérapeutique peut être évalué. Lorsqu’un effet est observé, ce protocole simple peut orienter ces études vers des voies plus cohérentes, où la protéine joue un rôle régulant l’épissage alternatif dans la réponse chimiothérapeutique, par exemple.
