Este protocolo descreve um ensaio celular para monitorar a eficiência do splicing, usando um repórter gerenciador adaptável. Este repórter Assay pode ser usado para estudar os efeitos da doença Mutações associadas nos locais da Exxon ou emendas, e para projetar terapia, em particular uma das partículas, para melhorar o reconhecimento de locais de emenda mutante a cinco pontos. A passagem nas células Hela aspira o meio gasto e incuba as células com três mililitros de 0,2 5% de viagens contendo um EDTA milimola, a 37 graus Celsius por três minutos.
Após a incubação em sete mililitros de DMEM frescos e transfira a suspensão celular para um tubo de 10 mililitros. Centrifugar as células. Em seguida, resuspenque a pelota celular em 10 mililitros de DMEM fresco, e plaque as células em um novo prato de cultura tecidual em 20% de confluência, para transsfecção transitória.
Conte as células hela com um slide de citómetro hemo limpo e prepare uma suspensão com uma densidade de 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro, semente um mililitro da suspensão celular em cada poço de uma placa de 12 poços e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte aspirar o meio gasto e adicionar 800 microliters de DMEM fresco com soro à placa. Prepare as misturas de transfecção e o vórtice por 15 segundos.
Em seguida, centrifufique as misturas e incuba-as à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação adicione todos os 200 microliters da transfecção misture em um poço da placa de 12 bem helacelular para alcançar um volume final de um mililitro por poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 48 horas. As reações de rotulagem preparadas estão incubando.
Resuspend os 25 quilos Dalton molecular peso corte de peso de exclusão de tamanho por vórtice suave por 10 segundos. Em seguida, transfira 600 microliters das contas resuspended para uma mini coluna descartável, colocado em um tubo de coleta de 1,5 mililitro, e devolva o estoque de contas para quatro graus Celsius. Centrifugar a coluna e descartar o fluxo através delas.
Em seguida, lave as contas duas vezes adicionando 300 microliters de RNA água livre à coluna. Após a segunda lavagem, transfira a mini coluna para um novo tubo de centrífugas de 1,5 mililitro e adicione a mistura de reação de quinase à coluna. Centrifugar a coluna e coletar o fluxo contendo os oligonucleotídeos rotulados P32.
Adicione dois microgramas de RNA extraídos das células heli em tubos de microclamagem microlitra e adicione água livre de RNA para compor o volume a 6,55 microliters. Em seguida, adicione 0,9 microliters uma mistura mestre a cada tubo PCR contendo as amostras de RNA, e incubar os tubos primeiro a 65 graus Celsius por cinco minutos, e depois no gelo por um minuto. Em seguida, às 2,55 microliters, uma mistura mestre dois, em cada tubo contendo o RNA e master mix um, e incubar os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos.
Após a incubação, transfira os tubos para um cicloviário térmico e incuba primeiro a 50 graus Celsius por 60 minutos, e depois a 70 graus Celsius, por 15 minutos. Após a incubação, adicione 10 microliters de 2X rna de carregamento de RNA a cada amostra e prossiga para separar os fragmentos por página UIA. Síntese de DNA do Percy.
Adicione dois microgramas de RNA extraídos das células de hela transectadas, em tubos de microncentrifuge de 200 microniliteres e adicione água livre de RNAs para compor o volume a 11 microlitrais baixos. Em seguida, adicione dois microliters, uma mistura mestre uma para cada amostra e incubar primeiro a 65 graus Celsius por cinco minutos, depois no gelo por um minuto. Em seguida, adicione sete microliters, uma mistura mestre dois em cada tubo e incubar os tubos à temperatura ambiente por 10 minutos, seguido de incubação a 50 graus Celsius por 60 minutos e 70 graus Celsius por 15 minutos.
Em seguida, para PCR diluir a reação de DNA C para produzir uma concentração de 100 nanogramas por microliter, e transferir um microliter de cada amostra de CDNA para novos tubos PCR. Adicione 10,5 microliters da mistura mestre a cada tubo contendo CDNA e realize o PCR. Usando um termociclador depois que o PCR estiver completo.
Adicione 12,5 microliters de 2X de DNA formamida carregando corante em cada tubo. Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e prossiga para realizar uma página UIA. Pipeta cinco microliters de CDNA diluída em poços individuais de uma placa qpcr de 96 poços triplicado.
Em seguida, adicione 10 microliters de mistura PCR em tempo real a cada poço, sele as placas com uma película óptica e centrífuga para coletar as reações à parte inferior dos Poços, em seguida, execute o qpcr enquanto coleta os valores do ciclo de quantificação limiar de amplicon alvo. Antes de carregar os marcadores e amostras, limpe os Poços com tampão TBE para remover a ureia assentada. Em seguida, carregue 10 microlitres de cada amostra por poço e execute o gel a 300 a 500 volts por duas a três horas, ou até que o xileno chegue ao fundo.
Depois de a eletroforese remover as placas de vidro do aparelho de eletroforese e separar cuidadosamente as duas placas para que o gel fique plano em qualquer superfície de vidro, em seguida, transfira o gel para um papel filtro e cubra-o com um plástico, usando um vácuo secador de gel secar o gel a 80 graus Celsius por 30 minutos, em seguida, coloque o gel seco em um de imagem fosfor para incubação durante a noite em temperatura ambiente. Quando expresso em células hela, o repórter de corte dup 51 minnijean expressa a transcrição completa madura em que a Exxon dois é emendada eficientemente. As cinco mutações principais do site de emendas e dup 51 P reduzem a inclusão da Exxon de 95 a 30% levando à formação de uma transcrição mais curta.
Co-expressão do DUP 51 P com U15A SNRNA resgata a Exxon por dois emendas, e restaura a formação da transcrição completa. Em contraste, a co-expressão com variante u1 ou U15G selvagem não tem o efeito semelhante na emenda dup 51P. A detecção de transcrições variantes U15A, por extensão primária, usa o nucleotídeo de Oligo U1 de 7 a 26, que tem 20 nucleotídeos de comprimento e pares de base perto da adenina na quinta posição do U1 SNRNA.
Somente na presença de DATP, u17 a 26 permite incorporar dois a três nucleotídeos para o tipo selvagem endógeno U1 SNRNA produzindo um produto de 22 ou 23 nucleotídeos longos. Para as variantes U15A e U15G termina após a adição de uma única adenosina produzindo um produto nucleotídeo de 21. Após a normalização da expressão U2 SNRNA, as variantes U1 5g e U15A foram expressas em três a cinco dobras sobre o SNRNA endógeno.
A qualidade do RNA extraído é fundamental para a análise de emendas. Portanto, o uso de água livre de RNA e descontaminação de serviços com agentes inativados rnas é altamente recomendado. O sistema de relatórios descrito aqui pode ser aplicado para estudar o papel do U1 SN RNAs na regulamentação de emenda para reverter o efeito de mutações de emenda de preço flash para silenciamento genético usando rnas U1SN modificados.
